一种针对海水鱼类盾纤毛虫病原杀虫细菌的筛选方法

摘要

本发明提供一种针对海水鱼类盾纤毛虫病原杀虫细菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分离纯化获得海洋细菌；(2)分离筛选海水鱼类盾纤毛虫病原；(3)将分离获得的海洋细菌与盾纤毛虫在96孔板中进行共培养；(4)监测共培养体系中盾纤毛虫的存活率确定杀虫细菌。本发明的积极效果：在以前研究的基础上，通过本发明，能大批量、迅速进行海洋细菌的筛选，并获得作用效果显著的对目的盾纤毛虫有明确杀灭作用的菌株，从而提高了应用微生物方法防治盾纤毛虫病的可能性，具有耗时短、提高效率、整个实验过程中无污染，可达到绿色环保的要求。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，尤其涉及一种针对海水鱼类盾纤毛虫病原杀虫细菌的筛 选方法。

背景技术

海水鱼工厂化养殖是我国水产养殖中非常重要的一个产业，但随着养殖产量的不 断提高和养殖规模的不断扩大，各种病害的发生也愈加频繁，其中盾纤毛虫病是其中 危害较大的一种。盾纤毛虫属兼性寄生虫，一般情况下营自由生活，以悬浮的微小颗 粒物质(细菌、微藻、原虫等)为食；但在某些环境下，这些纤毛虫可以表现为寄生性， 吞噬鱼类的细胞和组织残渣并在其组织内生长、繁殖；报道显示，我国各地工厂化养 殖车间从12～26℃均可出现盾纤毛虫病，几乎全年均可发病；盾纤毛虫病在牙鲆发病 最为凶猛，控制不力会出现90％以上的死亡率。目前我国海水鱼工厂化养殖中所发现 的盾纤类纤毛虫主要有弗州拟尾丝虫、蟹栖异阿脑虫、指状拟舟虫、水滴伪康纤虫、 贪食迈阿密虫。

为防控盾纤毛虫病对我国海水鱼养殖产业的危害，国内多家单位针对盾纤毛虫进 行了防治药物的筛选，但目前水产上对该病的治疗仍集中于福尔马林、硫酸铜、硫酸 锌的使用，这些药物基本作用于蛋白变性，其虽然可以杀死水体中盾纤毛虫，但很难 根治杀死在鱼体内的盾纤毛虫，而且这些药物对鱼和人体细胞没有鉴别能力，同样可 以发挥作用，引起严重后果，另外中国专利文献CN1762460A、CN103349747A公布了 两种中草药配方的防治牙鲆盾纤毛虫病的中药制剂，但该类制剂在实际生产中的应用 和稳定性还需更多检验。

实际上，在自然界，存在着许多对盾纤毛虫有致病或杀灭作用的微生物，利用微 生物这种致病性来防治盾纤毛虫病会是一种有效的生物防治方法，该方法属于微生物 防治害虫领域，其研究始自19世纪，到20世纪上半期逐渐进入开发实用阶段，微生 物杀虫剂是生物科学与工程技术结合发展的产物，随着现代生物工程的迅速发展，微 生物杀虫剂将有很大的开发前景，但根据目前的资料，目前还没有发现针对海水鱼类 盾纤毛虫病原的进行杀虫细菌筛选的方法报告。

发明内容

本发明目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种针对海水鱼类盾纤毛虫病原杀虫 细菌的筛选方法，通过该方法能高效、大批量、迅速针对海水鱼类盾纤毛虫病原进行 杀虫细菌的筛选。

本发明是通过以下技术方案实现的，研制了一种针对海水鱼类盾纤毛虫病原杀虫 细菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、分离纯化获得海洋细菌：取海洋生境来源样品，加入灭菌海水震荡混匀后， 配置成10^-2，10^-3，10^-4，10^-5的稀释液，用上述稀释度的稀释液分别涂布100μl到改 良海水2216E固体培养基平板上，每个稀释重复两次，用涂布好的培养皿倒置于25℃ 培养24-96小时，挑取长出的单菌落，在海水2216E固体培养基平板进行划线，将划 好线的培养皿倒置于25℃培养24-96小时，挑取长出的单菌落，再次在海水2216E固 体培养基平板上进行划线，将划好线的培养皿倒置于25℃培养24-96小时，待单一菌 落长出，挑取单菌落到1ml海水2216E液体培养基中，并用封口膜密封备用，接种好 单菌落的海水2216E液体培养基置于25℃摇菌24-96小时，至其OD600达到0.4-0.7， 用封口膜密封，于细菌菌液备用；

(2)、分离筛选海水鱼类盾纤毛虫病原：将海水鱼类养殖厂取回患盾纤毛虫病的 海水鱼，取其鳃部、大脑、体表病灶，做成水浸片用显微镜观察病灶部位，取发现有 盾纤毛虫的病灶部位加入到5毫升灭菌海水中震荡，配置成10^-2，10^-3，10^-4，10^-5的稀 释液，将上述稀释度的稀释液分别取10μl滴到无菌载玻片上，用显微镜观察每个水 滴中盾纤毛虫的数量，对每个只存在一个盾纤毛虫的水滴立即转移到1ml鱼汤培养基 中置于14-18℃培养，待鱼汤培养基中盾纤毛虫密度达到5×10³个/ml以上时，将该1ml 鱼汤培养基转移到50ml鱼汤培养基中置于14-18℃继续培养，直至该50ml鱼汤培养基 中盾纤毛虫密度达到5×10³个/ml以上，做为盾纤毛虫培养液备用；

(3)、将分离获得的海洋细菌与盾纤毛虫在96孔板中进行共培养：取一个96孔 板，96孔板的A1、B1孔做空白对照，加160μl灭菌海水，其余孔为实验组；取步骤 (1)细菌菌液160μl加入到96孔板中，每种细菌设2个平行，即每一种细菌加两孔； 取步骤(2)获得的盾纤毛虫培养液，依次向96孔板加注了灭菌海水或细菌菌液的孔 中再加注160μl盾纤毛虫培养液，将加好样的96孔板置于湿盒中，放到16℃共培养； (4)、监测共培养体系中盾纤毛虫的存活率确定杀虫细菌：开始共培养后，每隔1天， 从培养箱中取出96孔板，将每孔液体吹匀后取出10μl-20μl液体在显微镜下观察盾 纤毛虫生长情况和存活率，液体中观察到活跃的盾纤毛虫个体少于10个，该细菌为有 效菌，有效的细菌保藏留存。

所述的步骤(2)中的鱼汤培养基配法为：取50ml陈海水，经过121℃，20min灭 菌，冷却后加入1ml鱼肉汤母液。

所述的步骤(4)中有效的细菌保藏留存，其方法为，将有效菌保存备用平皿上挑 取单菌落到1毫升海水2216E液体培养基中置于25℃摇菌36-96小时，至其OD₆₀₀达到 0.4-0.6，加入灭菌的甘油，使甘油的终浓度为30-50％，-80℃保存备用。

所述的鱼肉汤母液配置方法为：取大菱鲆鱼肉10-30g于锥形瓶中，加入50ml的 蒸馏水，电炉煮沸10min冷却，将上清液分装至灭好菌的1.5ml的离心管中，每管分 装1ml，放置于-20℃冰箱备用。

所述的步骤(1)中的海洋生境来源样品主要包括海水、海底沉积物及海洋生物。

本发明的积极效果：在以前研究的基础上，通过本发明，能大批量、迅速进行海 洋细菌的筛选，并获得作用效果显著的对目的盾纤毛虫有明确杀灭作用的菌株，从而 提高了应用微生物方法防治盾纤毛虫病的可能性，具有耗时短、提高效率、整个实验 过程中无污染，可达到绿色环保的要求。

具体实施方式

实施例1

培养基配置方法：

海水2216E固体培养基配方为：每1升陈海水中含有蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸 铁0.01g，琼脂20g；

海水2216E液体培养基配方为：每1升陈海水中含有蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸 铁0.01g；

鱼肉汤母液配置方法为：取大菱鲆鱼肉20g于锥形瓶中，加入50ml的蒸馏水，电 炉煮沸10min，冷却；将上清液分装至灭好菌的1.5ml的离心管中，每管分装1ml，放 置于-20℃冰箱备用；

鱼汤培养基配置方法为：取50ml陈海水，经过121℃，20min灭菌，冷却后加入 1ml鱼肉汤母液。

实施例2

从采集的大菱鲆养殖池塘池水样品中分离对海水鱼类盾纤毛虫病原的有杀虫效果 的细菌：

1)、分离纯化获得海洋细菌：取1毫升大菱鲆养殖池塘池水，加入灭菌海水震荡 混匀后，配置成10^-2，10^-3，10^-4，10^-5的稀释液；把不同稀释度的稀释液分别涂布100 μl到海水2216E固体培养基平板上，每个稀释重复两次；把涂布好的培养皿倒置于 25℃培养38小时，挑取长出的单菌落，在海水2216E固体培养基平板进行划线；将划 好线的培养皿倒置于25℃培养38小时，挑取长出的单菌落，再次在海水2216E固体培 养基平板上进行划线；将划好线的培养皿倒置于25℃培养38小时，待单一菌落长出； 挑取单菌落到1ml海水2216E液体培养基中，并用封口膜密封备用；接种好单菌落的 海水2216E液体培养基置于25℃摇菌38小时以上，至其OD₆₀₀达到0.4，用封口膜密封， 该细菌菌液备用；

2)、分离筛选海水鱼类盾纤毛虫病原：将海水鱼类养殖厂取回患盾纤毛虫病的海 水鱼，取其鳃部、大脑、体表病灶，做成水浸片用显微镜观察病灶部位，取发现有盾 纤毛虫的病灶部位加入到5毫升灭菌海水中震荡，配置成10^-2，10^-3，10^-4，10^-5的稀释 液，将不同稀释度的稀释液分别取10μl滴到无菌载玻片上，用显微镜观察每个水滴 中盾纤毛虫的数量，对每个只存在一个盾纤毛虫的水滴立即转移到1ml鱼汤培养基中 置于16℃培养，待鱼汤培养基中盾纤毛虫密度达到5×10³个/ml以上时，将该1ml鱼汤 培养基转移到50ml鱼汤培养基中置于16℃继续培养，直至该50ml鱼汤培养基中盾纤 毛虫密度达到5×10³个/ml，于盾纤毛虫培养液备用；

3)、将分离获得的海洋细菌与盾纤毛虫在96孔板中进行共培养：取一个96孔板， 96孔板的A1、B1孔做空白对照，加160μl灭菌海水，其余孔为实验组；取步骤(1) 细菌菌液160μl加入到96孔板中，每种细菌设2个平行，即每一种细菌加两孔；取 步骤(2)获得的盾纤毛虫培养液，依次向96孔板加注了灭菌海水或细菌菌液的孔中 再加注160μl盾纤毛虫培养液，将加好样的96孔板置于湿盒中，放到16℃共培养；

4)、监测共培养体系中盾纤毛虫的存活率确定杀虫细菌：开始共培养后，每隔1 天，从培养箱中取出96孔板，将每孔液体吹匀后取出10μl液体在显微镜下观察盾纤 毛虫生长情况和存活率，若某孔取出的液体中观察不到活跃的盾纤毛虫个体时，重新 从相应孔取50μl液体进行观察，若液体中观察到活跃的盾纤毛虫个体少于10个，且 平行样出现同样情况，则判定该细菌为有效菌并将其保藏留存。

实施例3

从采集的日照海参养殖池底泥样品中分离对海水鱼类盾纤毛虫病原的有杀虫效果 的细菌：

1)、分离纯化获得海洋细菌：取1g日照海参养殖池底泥样品，加入10ml灭菌海 水震荡混匀后，配置成10^-2，10^-3，10^-4，10^-5的稀释液；把不同稀释度的稀释液分别涂 布100μl到海水2216E固体培养基平板上，每个稀释重复两次；把涂布好的培养皿倒 置于25℃培养40小时，挑取长出的单菌落，在海水2216E固体培养基平板进行划线； 将划好线的培养皿倒置于25℃培养40小时，挑取长出的单菌落，再次在海水2216E 固体培养基平板上进行划线；将划好线的培养皿倒置于25℃培养40小时以上，待单一 菌落长出；挑取单菌落到1m1海水2216E液体培养基中，该平皿用封口膜密封备用； 接种好单菌落的海水2216E液体培养基置于25℃摇菌40小时，至其0D₆₀₀达到0.6以 上，用封口膜密封，该细菌菌液备用；

2)、分离筛选海水鱼类盾纤毛虫病原：从海水鱼类养殖厂取回患盾纤毛虫病的海 水鱼，取其鳃部、大脑、体表病灶，做成水浸片用显微镜观察病灶部位；取发现有盾 纤毛虫的病灶部位加入到5毫升灭菌海水中震荡，配置成10^-2，10^-3，10^-4，10^-5的稀释 液；将不同稀释度的稀释液分别取10μl滴到无菌载玻片上，用显微观察每个水滴中盾 纤毛虫的数量，对每个只存在一个盾纤毛虫的水滴立即转移到1ml鱼汤培养基中置于 16℃培养；待鱼汤培养基中盾纤毛虫密度达到5×10³/ml以上时，将该1ml鱼汤培养基 全部转移到50ml鱼汤培养基中置于16℃继续培养，直至该50ml鱼汤培养基中盾纤毛 虫密度达到5×10³/ml以上，于盾纤毛虫培养液备用；

3)、将分离获得的海洋细菌与盾纤毛虫在96孔板中进行共培养：取一个96孔板， 96孔板的A1、B1孔做空白对照，加160μl灭菌海水，其余孔为实验组；取步骤1) 细菌菌液160μl加入到96孔板中，每种细菌设2个平行，即每一种细菌加两孔；取步 骤2)获得的盾纤毛虫培养液，依次向96孔板加注了灭菌海水或细菌菌液的孔中再加 注160μl盾纤毛虫培养液；将加好样的96孔板置于湿盒中，放到16℃共培养；

4)、监测共培养体系中盾纤毛虫的存活率确定杀虫细菌：开始共培养后，每隔1 天，从培养箱中取出96孔板，将每孔液体吹匀后取出20μl液体在显微镜下观察盾纤 毛虫生长情况和存活率，若某孔取出的液体中观察不到活跃的盾纤毛虫个体时，重新 从相应孔取100μl液体进行观察，若液体中观察到活跃的盾纤毛虫个体少于10个， 且平行样出现同样情况，则判定该细菌为有效菌并将其保藏留存。

以上仅采集的大菱鲆养殖池塘池水样品和日照海参养殖池底泥样品中分离对海水 鱼类盾纤毛虫病原有杀虫效果的细菌，说明针对海水鱼类盾纤毛虫病原杀虫细菌的筛 选方法，具体实施时不受实施例限制，在不脱离本发明范围的情况下，还可以作出各 种变化和变型，本方法中所使用技术术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术 人员通常理解的含义，因此所有等同的技术方案也应属于本发明的范畴。