一种片段法固相合成齐考诺肽的方法

摘要

本发明属于多肽合成领域，涉及一种片段法固相合成齐考诺肽的方法。本发明所要解决的技术问题是现有制备方法存在的合成周期长、粗肽纯度低、3对二硫键形成过程操作繁杂、总收率低等技术难题。本发明所采用的技术方案为：首先采用固相法合成齐考诺肽的4个片段肽[19-25]A、[12-18]B、[6-11]C、[1-5]D；再按照顺序依次将全保护肽片段B、C、D连接到肽树脂A上，裂解得到齐考诺肽线性肽；最后通过条件温和，操作精简，后处理容易，环保的液相一步氧化得到齐考诺肽。此技术方案可以大大缩短合成周期，降低合成、纯化难度和生产成本，提高线性肽纯度和产物的总收率；利于工业大规模生产。

说明书

技术领域

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种片段法固相合成齐考诺肽的方法。

背景技术

齐考诺肽(Ziconotide)，商品名Prialt，由爱尔兰Elan公司开发，2005年1月11日首次在美国获批上市，2005年2月获得欧盟许可，2007年，联合镇痛会议专门小组推荐齐考诺肽作为一线鞘内镇痛药。它是一种N-型钙通道阻滞剂，是从圆锥型蜗牛软体动物体内分离出的ω-芋螺毒素MVIIA的合成形式，可用于鞘内给药的非阿片类镇痛药物。齐考诺肽通过特异而有效的结合N-VSCC(N-type voltage-sensitive calcium channels)来阻断致痛递质的释放，进而实现其药理学作用，适用于适合鞘内注射而其他治疗方法(比如全身性镇痛药、辅助治疗或鞘内注射吗啡)不能耐受或无效的严重慢性疼痛的成人患者的治疗，相比于阿片类镇痛药物，具有疗效好、无耐药性和无成瘾性等优势。

齐考诺肽是由3对二硫键连接在内的25个氨基酸组成的多肽，分子量为2639.12，肽序较长且结构复杂，C1-C16、C8-C20和C15-C25三对二硫键使多肽折叠成为ω结，除此之外还有3股β折叠进一步稳定其空间结构。其氨基酸序列和二硫键桥接模式如下所示：

关于齐考诺肽的合成方法报道较少，国外的相关专利主要集中在药理和治疗方面；国内关于其制备的专利如：CN200710301598.8、CN200910188686.0、CN201110139661.9、CN201310202216.1均采用固相合成方法，以单个Fmoc保护的氨基酸为原料，依次逐个接上氨基酸进行合成；专利CN201310202089.5中线性肽的合成使用了Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH共3种二肽片段作为原料，避免了 [+Gly] -齐考诺肽和[-Gly]-齐考诺肽杂质的产生。但以上固相合成方法都存在合成周期长，粗肽的纯度和收率较低的问题。

关于齐考诺肽合成步骤中氧化形成二硫键的方法，专利CN200710301598.8、CN201110139661.9以及CN201310202216.1均公开了采用3种不同巯基保护基的Cys合成线性肽，利用保护基的自身稳定性，采用分步氧化形成三对二硫键的制备策略；虽然形成的二硫键定向性好，但是此策略中间步骤多，操作繁琐。专利CN200910188686.0采用一步氧化同时形成三对二硫键的制备策略，虽然简化了工艺，但是脱除Acm所用的金属盐类化合物对人体危害性大，也不利于环保。专利CN201310202089.5中公开了碘、H₂O₂等作为氧化剂，氧化形成二硫键，但这类氧化剂易造成齐考诺肽肽链中Met的氧化。

以上技术方案存在以下不足：在合成肽链的过程中采用逐个氨基酸进行偶联的方法，合成周期长，线性粗肽纯度低；在二硫键形成过程中存在操作繁杂，难以实现规模放大生产，总收率低的技术难题。

发明内容

本发明提供一种片段法固相合成齐考诺肽的方法，既能大大缩短合成周期，又能提高粗肽的纯度和收率，降低纯化难度，而且氧化条件温和，步骤精简，便于操作，适合于工业生产。

为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

    一种片段法固相合成齐考诺肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：

    (1)采用氨基树脂为固相载体，再按序列依次偶联7个Fmoc保护氨基酸，得侧链保护的齐考诺肽片段A [19-25]肽树脂；

齐考诺肽片段A [19-25]肽树脂为：

H-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Arg(pbf)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-氨基树脂；

    (2)采用CTC树脂为固相载体，按照以下序列从C端向N端依次进行缩合反应得到侧链全保护的齐考诺肽片段B[12-18]肽树脂、片段C[6-11]肽树脂和片段D[5-1]肽树脂；

齐考诺肽片段B [12-18]肽树脂为：

Fmoc-Met-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-CTC树脂；

齐考诺肽片段C [6-11]肽树脂为：

Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Leu-CTC树脂；

    齐考诺肽片段D [1-5]肽树脂为：

Fmoc- Cys(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-CTC树脂；

   (3)将片段B、C、D的肽树脂进行裂解，得到全保护肽片段B、C、D，其结构为：

齐考诺肽片段B [12-18]为：

Fmoc-Met-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-OH；

齐考诺肽片段C [6-11]为：

Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Leu-OH；

    齐考诺肽片段D [1-5]为：

Fmoc- Cys(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-OH；

    (4)齐考诺肽片段A [19-25] 肽树脂与全保护肽片段B在缩合剂存在下发生接肽反应，生成14个氨基酸的肽树脂，再按照同样的操作依次连接全保护肽片段C和D，最后脱除Fmoc，完成齐考诺肽线性肽树脂的制备。

齐考诺肽线性肽树脂的结构如下：

 (5)肽树脂经裂解试剂裂解得到齐考诺肽的线性肽粗品；

    (6)将齐考诺肽的线性肽用乙酸铵和EDTA的缓冲水溶液溶解后；加入辅助氧化剂，调节溶液pH值至7.5~8.5，2~8℃下低温静置反应，HPLC监测反应终点，得到含二硫键的齐考诺肽粗品；

    (7)将齐考诺肽粗品溶液pH值调至3-6后经制备色谱纯化，冻干得到齐考诺肽精肽。

优选的，步骤(1)所述氨基树脂为Rink Amide树脂和Rink Amide-AM树脂中的一种，优选的树脂的替代度为0.2~0.5mmol/g。

优选的，步骤(2)中所述的CTC树脂的替代度为0.6~1.2mmol/g。

优选的，步骤(3)中全保护肽树脂裂解试剂组合为TFE/DCM、TFA/DCM、AcOH/TFE/DCM、HFIP/DCM中的一种。

    优选的，步骤(5)中所述的线性肽的裂解试剂为加入体积比1-20%清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水和三异丙基硅烷中的一种或几种。

优选的，步骤(5)中所述线性肽的液相氧化的具体步骤为：

配制乙酸铵和EDTA的缓冲水溶液，加入线性肽溶解，再加入辅助氧化剂，调节PH值至7.5~8.5，2~8℃下低温静置反应，HPLC监控反应进程。

更为优选的，线性肽的液相氧化体系中控制线性肽的浓度为0.5~2mg/ml，乙酸铵的浓度为0.5~0.7mol/L，EDTA的浓度为0.5-1.5mmol/L。

   辅助氧化剂组合为GSH(还原型谷胱甘肽)/GSSG(氧化型谷胱甘肽)和半胱氨酸/胱氨酸中的一种；优选的氧化剂组合GSH(还原型谷胱甘肽)/GSSG(氧化型谷胱甘肽)中GSH(还原型谷胱甘肽)的加入浓度为0.1-10mmol/L，GSSG(氧化型谷胱甘肽)的加入浓度为0.05-1mmol/L；优选的，氧化剂组合半胱氨酸/胱氨酸中半胱氨酸的加入浓度为0.1-10mmol/L，胱氨酸的加入浓度为0.05-1mmol/L。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明采用片段法固相合成齐考诺肽线性肽，4个片段可以同时合成，大大缩短了合成周期。降低合成难度，使线性肽粗肽纯度超过80%；提高产物的总收率至50%以上。降低了纯化难度，使最终产品的纯度超过99.5%，进一步降低了纯化成本。同时线性肽的氧化方法具有条件温和，操作精简，后处理容易，环保的特点，利于工业大规模生产。

具体实施方式

下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但本发明的保护范围并不仅限于此；根据本发明改变原料的投料比、反应溶剂或缩合剂等，均在本发明的保护范围内。

说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下：

Fmoc             9-芴甲氧羰基

Acm              乙酰胺甲基

tBu               叔丁基

Pbf               2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基

Trt               三苯甲基

Boc              叔丁氧羰基

CTC树脂         2-氯三苯甲基氯树脂

DCM             二氯甲烷

DMF             N,N-二甲基甲酰胺

DIPEA            N,N-二异丙基乙胺

DIC              N,N-二异丙基碳二亚胺

HBTU            苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐

HATU            2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯

TBTU            O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸

HOBT            1-羟基苯并三唑

HOAT            1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑

TFA              三氟乙酸

TFE              三氟乙醇

EDTA            乙二胺四乙酸

GSH              还原型谷胱甘肽

GSSG            氧化型谷胱甘肽

HFIP             六氟异丙醇

实施例1：Fmoc- Cys(Trt)-Rink Amide Resins的合成

准确称取Rink Amide树脂20.0g(sub=0.33mmol/g)放入合成柱中，用160mL DMF 洗涤两次，加入160mL DCM溶胀30min，抽滤掉DCM后，用160mL DMF 洗涤两次；加入20%哌啶/DMF溶液160ml脱保护2次，分别反应10min和15min；然后用100ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；抽滤掉DMF，加入Fmoc-Cys(Trt)-OH/DIC/HOBT的混合DMF溶液[称取7.73g(13.2mmol) Fmoc- Cys(Trt)-OH和1.96g(14.52mmol) HOBT置于锥形瓶中，加入100mL DMF溶液搅拌溶解，低温(0℃)下加入2.25ml(14.52mmol) DIC，活化3min]；反应2h，抽掉反应液，用160mL DMF洗涤两次，加入封端试剂120mL(24ml乙酸酐、20.4ml吡啶、75.6mL DCM)反应2h，抽滤掉反应液，分别用DMF、DCM、甲醇洗涤3次，真空干燥后得Fmoc-Cys(Trt)-Rink Amide resins 22.06g；取少量树脂，测替代度为0.29mmol/g。

实施例2：Fmoc- Cys(Trt)-Rink Amide-AM Resins的合成

准确称取Rink Amide-AM树脂20.0g(sub=0.32mmol/g)放入合成柱中，用160mL DMF 洗涤两次，加入160mL DCM溶胀30min，抽滤掉DCM后，用160mL DMF 洗涤两次；加入20%哌啶/DMF溶液160ml脱保护2次，分别反应10min和15min；然后用100ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；抽滤掉DMF，加入Fmoc-Cys(Trt)-OH/DIC/HOBT的混合DMF溶液[称取3.75g(6.4mmol) Fmoc- Cys(Trt)-OH和0.95g(7.04mmol) HOBT置于锥形瓶中，加入100mL DMF溶液搅拌溶解，低温(0℃)下加入1.09ml(7.04mmol) DIC，活化3min]；反应2h，抽掉反应液，用160mL DMF洗涤两次，加入封端试剂120mL(24ml乙酸酐、20.4ml吡啶、75.6mL DCM)反应2h，抽滤掉反应液，分别用DMF、DCM、甲醇洗涤3次，真空干燥后得Fmoc-Cys(Trt)-Rink Amide-AM resins 24.30g；取少量树脂，测替代度为0.18mmol/g。

实施例3: Fmoc-Gly-CTC Resins的合成

称取CTC树脂70.0g(sub=1.00mmol/g)置于合成柱中，用420mL DMF 洗涤两次，加入420mL DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，加入溶有41.62g Fmoc-Gly-OH的DCM溶液250ml，低温(0℃)下加入DIPEA 25.45ml，反应60min，抽掉反应液，加入DCM/CH₃OH/DIPEA (体积比17：2：1) 混合溶液420ml封端30min；然后用DMF、DCM、甲醇分别洗涤3次，真空干燥得Fmoc-Gly-CTC Resins 86.50g；测替代度为0.80mmol/g。

实施例4: Fmoc-Leu-CTC Resins的合成

称取CTC树脂30.0g(sub=1.10mmol/g)置于合成柱中，用180mL DMF 洗涤两次，加入180mL DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，加入溶有23.32g Fmoc-Leu-OH的DCM溶液100ml，低温(0℃)下加入DIPEA12.00ml，反应60min，抽掉反应液，加入DCM/CH₃OH/DIPEA (体积比17：2：1) 混合溶液180ml封端30min；然后用DMF、DCM、甲醇分别洗涤3次，真空干燥得Fmoc-Leu-CTC Resins 39.90g。测替代度为0.82mmol/g。

实施例5：齐考诺肽[19-25]肽树脂A的制备

准确称取实施例1中替代度为0.29mmol/g Fmoc-Cys(Trt)-Rink Amide resins 20.69g(合成规模6mmol)置于合成柱中，加入120ml DCM溶胀30min，抽滤掉DCM后，120ml DMF洗涤2次；加入20%哌啶/DMF溶液160ml脱保护2次，分别反应10min和15min；然后用120ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入Fmoc-Lys(Boc)-OH 5.62g(12mmol)、HOBT 1.78g(13.2mmol)和DIC2.04ml(13.2mmol)的DMF溶液100ml，鼓N₂搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用120ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH。肽树脂制备完后，用120ml DCM和甲醇分别洗涤3次，真空干燥得肽树脂28.56g。

实施例6：齐考诺肽[19-25]肽树脂A的制备

准确称取实施例2中替代度为0.18mmol/g Fmoc-Cys(Trt)-Rink Amide-AM resins 16.67g(合成规模3mmol)置于合成柱中，加入100ml DCM溶胀30min，抽滤掉DCM后，100ml DMF洗涤2次；加入20%哌啶/DMF溶液120ml脱保护2次，分别反应10min和15min；然后用100ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入Fmoc-Lys(Boc)-OH 2.81g(6mmol)、HOBT 0.89g(6.6mmol)和DIC1.02ml(6.6mmol)的DMF溶液80ml，鼓N₂搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用100ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH。肽树脂制备完后，用100ml DCM和甲醇分别洗涤3次，真空干燥得肽树脂20.43g。

实施例7：齐考诺肽[12-18]肽树脂B的制备

准确称取实施例3中替代度为0.80mmol/g Fmoc-Gly-CTC Resins 37.50g(合成规模30mmol)置于合成柱中，加入240ml DCM溶胀30min，抽滤掉DCM后，240ml DMF洗涤2次；加入20%哌啶/DMF溶液240ml脱保护2次，分别反应10min和15min；然后用240ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入Fmoc- Thr(tBu)-OH 23.85g(60mmol)、HOBT 8.92g(66mmol)和DIC10.22ml(66mmol)的DMF溶液160ml，鼓N₂搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用240ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Met-OH。肽树脂制备完后，用240ml DCM和甲醇分别洗涤3次，真空干燥得肽树脂77.32g。

实施例8：齐考诺肽[6-11]肽树脂C的制备

准确称取实施例4中替代度为0.82mmol/g Fmoc-Leu-CTC Resins 36.58g(合成规模30mmol)置于合成柱中，加入240ml DCM溶胀30min，抽滤掉DCM后，240ml DMF洗涤2次；加入20%哌啶/DMF溶液240ml脱保护2次，分别反应10min和15min；然后用240ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入38.93g(60mmol)Fmoc-Arg(pbf)-OH 、8.92g(66mmol)HOBT和10.22ml(66mmol) DIC的DMF溶液160ml，鼓N₂搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用240ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH。肽树脂制备完后，用240ml DCM和甲醇分别洗涤3次，真空干燥得肽树脂71.95g。

实施例9：齐考诺肽[1-5]肽树脂D的制备

准确称取实施例3中替代度为0.80mmol/g Fmoc-Gly-CTC Resins 37.50g(合成规模30mmol)置于合成柱中，加入240ml DCM溶胀30min，抽滤掉DCM后，240ml DMF洗涤2次；加入20%哌啶/DMF溶液240ml脱保护2次，分别反应10min和15min；然后用240ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入28.12g (60mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、 8.92g(66mmol))HOBT和10.22ml (66mmol) DIC的DMF溶液160ml，鼓N₂搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用240ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH 、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH 、Fmoc-Cys(Trt)-OH。肽树脂制备完后，用240ml DCM和甲醇分别洗涤3次，真空干燥得肽树脂61.89g。

实施例10：齐考诺肽中间体片段B、C、D的制备

按照TFE：DCM为1:4的比例配制2.8L混合溶液。分别将实施例7、8、9中得到的肽树脂放入3个圆底烧瓶中，按照每1g树脂10ml溶液的比例分别加入上述溶液，室温搅拌反应4-5h。分别过滤除去树脂，滤液减压浓缩后，用-20℃预冷的甲基叔丁基醚沉降、离心、洗涤5次，干燥后得到中间体片段B、C、D分别为45.52g、42.36g、31.76g，收率分别为90.93%、91.02%、91.46%。

实施例11：齐考诺肽线性肽肽树脂的制备

将实施例5中6mmol的[19-25]肽树脂A放入合成管中，加入180ml的DCM溶胀30min；抽滤掉DCM，用180ml的DMF洗3次；加入20%哌啶/DMF溶液120ml脱保护2次，分别反应10min和15min；然后用120ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入中间体片段B 30.04g(18mmol)、HOAT 2.68g(19.8mmol)和DIC 3.07ml(19.8mmol)的DMF溶液80ml，鼓N₂搅拌反应3-4h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用180ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，依次连接中间体片段C和D，脱去最后一个氨基酸的Fmoc保护基，用180ml DCM和甲醇分别洗涤3次，真空干燥得肽树脂48.56g。

实施例12：齐考诺肽线性肽肽树脂的制备

将实施例6中3mmol的[19-25]肽树脂A放入合成管中，加入120ml的DCM溶胀30min；抽滤掉DCM，用120ml的DMF洗3次；加入20%哌啶/DMF溶液120ml脱保护2次，分别反应10min和15min；然后用120ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入中间体片段B 11.45g(9mmol)、HOAT1.34g(9.9mmol)和DIC 1.53ml(9.9mmol)的DMF溶液50ml，鼓N₂搅拌反应3-4h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用120ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，依次连接中间体片段C和D，脱去最后一个氨基酸的Fmoc保护基，用120ml DCM和甲醇分别洗涤3次，真空干燥得肽树脂30.46g。

实施例13：齐考诺肽线性肽的制备

称取实施例11所得齐考诺肽肽树脂48.56g置于1000ml圆底烧瓶中，冰浴下加入500ml裂解试剂(三氟醋酸/苯酚/苯甲硫醚/水/乙二硫醇=82.5/5/5/5/2.5，体积比)，N₂保护搅拌反应4h后，抽滤除去树脂，将滤液缓慢倾倒入-20℃预冷的5L甲基叔丁基醚中，冰柜内静置1h，离心得到的固体，用甲基叔丁基醚洗涤6次后真空干燥得粗肽17.78g，纯度81.23%，收率112.03%。

实施例14：齐考诺肽线性肽的制备

称取实施例12所得齐考诺肽肽树脂30.46g置于1000ml圆底烧瓶中，冰浴下加入330ml裂解试剂(三氟醋酸/苯酚/苯甲硫醚/水/乙二硫醇=82.5/5/5/5/2.5，体积比)，N₂保护搅拌反应4h后，抽滤除去树脂，将滤液缓慢倾倒入-20℃预冷的3.5L甲基叔丁基醚中，冰柜内静置1h，离心得到的固体，用甲基叔丁基醚洗涤6次后真空干燥得粗肽8.65g，纯度81.23%，收率108.94%。

实施例15：齐考诺肽的制备

配制0.5mol/LM和1mmol/L的乙酸铵和EDTA的缓冲溶液，加入实施例13中的5.00g齐考诺肽线性肽(浓度为2mg/ml)，再加入GSH(还原型谷胱甘肽)和GSSG(氧化型谷胱甘肽)，使其浓度分别为0.5mmol/L和0.1mmol/L，用冰乙酸和氨水调节PH值至7.8，放于2~8℃低温静置反应，HPLC监测反应终点 。反应结束后经纯化、冻干得到齐考诺肽精肽3.06g，纯度99.62%，收率61.20%。

实施例16：齐考诺肽的制备

配制0.6mol/L和1.5mmol/L的乙酸铵和EDTA的缓冲溶液，加入实施例14中的5.00g齐考诺肽线性肽(浓度为1mg/ml)，再加入半胱氨酸和胱氨酸使其浓度分别为1.0mmol/L和0.1mmol/L，用冰乙酸和氨水调节PH值至8.2，放于2~8℃低温静置反应，HPLC监测反应终点。反应结束后经纯化、冻干得到齐考诺肽精肽3.22g，纯度99.70%，收率64.40%。