卵巢和子宫内膜癌的帕帕尼科拉乌测试

摘要

最近开发的基于液体的帕帕尼科拉乌(Pap)涂片不仅允许进行细胞学评估，而且允许采集用于检测宫颈癌病原体HPV的DNA。本发明测试了这些样本，以检测存在于稀少的肿瘤细胞中的体细胞突变，该肿瘤细胞一旦从子宫内膜癌和卵巢癌中排出，可在宫颈中积累。收集子宫内膜癌和卵巢癌中一组常见突变的基因并用于鉴定所有46个子宫内膜或宫颈癌组织样本中的突变。本发明还能够鉴定来自100％的子宫内膜癌(24个中的24个)和41％的卵巢癌(22个中的9个)中的液体巴氏涂片的DNA中相同的突变。本发明开发了基于序列的方法，以在没有肿瘤基因型现有知识的情况下查询单个液体巴氏涂片中12种基因中的突变。

说明书

本发明利用美国国家癌症研究所和美国国立卫生研究院的基金进行。美国政 府保留根据NCI协议N01-CN-43309和NIH资助CA129825和CA43460的条款的 特定权利。

发明领域

本发明涉及癌症筛查领域。具体地，其涉及卵巢癌和子宫内膜癌。

发明背景

由于帕帕尼科拉乌测试(帕氏测试)的推行，在经筛查的人群中宫颈癌的发 生率和死亡率已经降低了超过75％(1、2)。相反，在同一分期内由于卵巢癌和 子宫内膜癌的死亡数并没有显著降低。结果，2012年在美国超过69,000名女性被 诊断出卵巢癌和子宫内膜癌。虽然子宫内膜癌比卵巢癌更常见，但后者更为致命。 在美国，预计每年有大约15,000和8,000名女性分别死于卵巢癌和子宫内膜癌(表 1)。在世界范围内，仅今年就预计有超过200,000例由于这些肿瘤而死亡(3、4)。

为了复制宫颈癌筛查的成功，已经设计出几种早期检测子宫内膜和卵巢癌的 方法。对于子宫内膜癌，工作已经集中于细胞学和经阴道超声(TVS)。在一些情 况下，细胞学确实能够指示子宫内的赘生物，虽然具有低特异性(5)。TVS是基 于包含癌症的子宫内膜比正常的子宫内膜厚的事实、测量子宫内膜厚度的无创技 术(6)。和细胞学一样，由于良性病变如息肉也可导致子宫内膜变厚，因此利用 TVS筛查测量子宫内膜厚度缺乏足够的特异性。因此，细胞学和TVS均没有满足 筛查测试的要求(5,7)。

已经做出更大的努力来利用血清CA-125水平和TVS开发卵巢癌的筛查测试。 CA-125是在具有早期疾病的卵巢癌患者亚组中增加的体腔和苗勒源上皮所表达的 高分子量跨膜糖蛋白(8)。由于其也在多种良性状况，如盆腔炎、子宫内膜异位 和卵巢囊肿中增加的事实，CA-125的特异性受到限制(9)。TVS可显现卵巢， 但仅仅可检测大的肿瘤，且不能确定地区分良性肿瘤和恶性肿瘤。已经进行了几 种利用血清CA-125和TVS的临床筛查测试，但均没有显示生存效益。实际上， 与对照相比，一些已经显示发病率的上升，因为假阳性测试引出通过腹腔镜检查 或剖腹探查术的进一步评估(10-12)。

因此，美国预防服务工作组、美国癌症学会、美国妇产科医师协会以及美国 国家综合癌症网络，不建议在普通人群中常规筛查子宫内膜癌和卵巢癌。实际上， 这些组织提醒“潜在危害大于潜在益处”(13-16)。已经对具有卵巢癌遗传素质的 患者，例如BRCA基因种系突变的患者或具有Lynch综合征的患者进行这种建议 的例外。建议在相对较早的年龄开始每6个月用TVS和血清CA-125筛查BRCA 突变携带者。患有Lynch综合征的女性的筛查方针包括在30和35岁之间开始的 每年子宫内膜取样和TVS(15、17)。

与未检测到的妇科恶性肿瘤有关的死亡率已经使得有效筛查工具的开发被优 先考虑。启发目前的研究的重要观察发现是无症状的女性偶尔呈现在作为其常规 宫颈癌筛查程序一部分的细胞学样本中检测到异常腺细胞(AGCs)。虽然在一些 情况下AGCs与恶变前疾病或恶性疾病有关(18-22)，但通常难以将由宫颈内癌、 子宫内膜癌和卵巢癌产生的AGCs相互区分或与更良性的状况区分。本领域依然 需要在比目前所进行的更早的阶段检测这些癌症。

发明概述

根据本发明的一个方面，提供检测或监测子宫内膜癌和卵巢癌的方法。针对 在子宫内膜癌和卵巢癌中突变的一种或多种基因、mRNAs或蛋白质的遗传或外遗 传改变，测试患者的液体巴氏涂片。改变的检测指示在患者体内存在这种癌症。

根据本发明的另一方面，提供筛查子宫内膜和卵巢癌的方法。针对选自以下 的基因、mRNA或蛋白质的一种或多种突变，测试液体巴氏涂片：CTNNB1、EGFR、 PI3KCA、PTEN、TP53、BRAF、KRAS、AKT1、NRAS、PPP2R1A、APC、FBXW7、 ARID1A、CDKN2A、MLL2、RFF43和FGFR2。突变的检测指示患者体内存在这 种癌症。

本发明的另一方面是测试卵巢或子宫内膜癌的巴氏涂片样本中的一组基因的 试剂盒。试剂盒包括至少10种探针或至少10种引物对。每种探针或引物包括至 少15nt的与一组基因中的一种互补的序列。至少10个不同的基因受到检查。所 述组选自CTNNB1、EGFR、PI3KCA、PTEN、TP53、BRAF、KRAS、AKT1、NRAS、 PPP2R1A、APC、FBXW7、ARID1A、CDKN2A、MLL2、RFF43和FGFR2。

本发明的另一方面是包含至少10种连接的探针的固相支持体。每种探针包括 至少15nt的与一组基因中的一种互补的序列，其中该组选自CTNNB1、EGFR、 PI3KCA、PTEN、TP53、BRAF、KRAS、AKT1、NRAS、PPP2R1A、APC、FBXW7、 ARID1A、CDKN2A、MLL2、RFF43和FGFR2。

本发明的另一方面是包含至少10种与其连接的引物的固相支持体。每种引物 包括至少15nt的与一组基因中的一种互补的序列。该组选自CTNNB1、EGFR、 PI3KCA、PTEN、TP53、BRAF、KRAS、AKT1、NRAS、PPP2R1A、APC、FBXW7、 ARID1A、CDKN2A、MLL2、RFF43和FGFR2。

在阅读说明书之后对本领域技术人员显而易见的这些和其它实施方式向本领 域提供在筛查环境中利用已经常规采集的样本测定卵巢和子宫内膜癌的方法。

附图说明

图1.示意图显示本研究中所述程序的原理步骤。从卵巢癌或子宫内膜癌中排 出的肿瘤细胞被带入子宫颈内管。这些细胞可被用于进行常规巴氏涂片的刷捕获。 刷的内含物被转移至液态固定剂中，从中分离DNA。利用下一代测序，针对指示 女性生殖道中恶性肿瘤的存在的突变查询该DNA。

图2.用于同时检测12种不同基因中的突变的测定的图。显示Safe-SeqS(安 全-测序系统)实验方案的改进，用于同时询问单个样品中的多个突变。在标准 Safe-SeqS程序中，只评价一种扩增子，而新系统用于同时评价来自多个基因的多 种扩增子。

图3.巴氏涂片流体中的突变体等位基因分数。显示来自46种巴氏涂片流体 的每一种的突变体等位基因的分数。每个肿瘤的分期列于Y-轴上。X-轴显示由 Safe-SeqS测定的％突变体等位基因分数。

图4.热图显示巴氏涂片流体中12种基因的多重测试结果。y-轴上的每个方块 代表来自所示基因的30-bp的序列区组。评价的28个样本(14个来自患有癌症的 女性，14个来自不患有癌症的正常女性)表示于x-轴上。突变表示为彩色的方块， 白色表示没有突变，黄色表示0.1％至1％的突变体分数，橙色表示1％至10％的突 变体分数，红色表示>10％的突变体分数。

图5.表1.卵巢和子宫内膜肿瘤的流行病学。列出来自卵巢癌和子宫内膜癌 主要亚型的美国新病例和死亡的估计数量。

图6.表2.卵巢癌和子宫内膜癌的遗传特征。列出卵巢癌和子宫内膜癌中常 见突变的基因的频率。

图7.表S1.通过全外显子组测序研究的子宫内膜癌(子宫内膜样亚型)。列 出用于外显子组测序的22例癌症的概括特征。

图8.表S3.在巴氏涂片中评价的突变。列出46个肿瘤样本的临床特征，以 及每个病例中鉴定的突变和在巴氏涂片中鉴定的突变体等位基因分数。

图9.表S4.用于评价巴氏涂片中的特有突变的引物。成对列出用于经 Safe-SeqS测试每个突变的正向和反向引物序列(分别为SEQ ID NO:4-99)。

图10.表S5.用于同时评价巴氏涂片中12种基因的引物。成对列出每个被测 试区域的正向和反向引物序列(分别为SEQ ID NO:100-191)。

图11.表S6.通过同时评价12种基因在巴氏涂片中鉴定的突变。列出利用 该方法在巴氏涂片中鉴定的突变体等位基因的分数，并鉴定精确突变。

发明详述

发明人，已经开发出利用已经常规采集用于诊断子宫癌和HPV(人乳头瘤病 毒)感染的样本检测不同癌症的测试。利用一组基因，实现了子宫内膜和卵巢癌 的高水平检测。

已经确定一些基因在子宫内膜和卵巢癌的很大部分中突变。这些基因包括 CTNNB1、EGFR、PI3KCA、PTEN、TP53、BRAF、KRAS、AKT1、NRAS、PPP2R1A、 APC、FBXW7、ARID1A、CDKN2A、MLL2、RFF43和FGFR2。可对这些基因的 至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17种进行测试。此 外，可将其它基因添加或替换至组中，以实现更高的检测率。

通过分析核酸如DNA或mRNA或cDNA，可完成突变的测试。核酸分析物从 液体巴氏涂片样本中发现的细胞或细胞碎片中分离。合适的测试可包括任何基于 杂交或测序的测定。也可对由该组中的基因编码的蛋白质进行分析。可利用任何 合适的测试，包括但不限于质谱分析法。其它合适的测定可以包括免疫测定，例 如免疫印迹、免疫细胞化学、免疫沉淀法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免 疫测定(RIA)、免疫放射分析(IRMA)和免疫酶测定(IEMA)，包括利用单克 隆或多克隆抗体的夹心式测定。

可检测的遗传改变通常是突变，如缺失、插入、重复、替换(错义或无义突 变)、重排等。可尤其通过与个体的其它(非肿瘤)组织或液体中的野生型比较 或通过与参考序列例如数据库中的参考序列比较，来检测这些突变。个体的所有 组织中发现的突变是种系突变，然而仅仅在单一组织中发生的突变为体细胞突变。 也可检测外遗传改变。这些可为特定基因中特定位置的甲基化的丧失或获得，以 及组蛋白修饰，包括乙酰化、泛素化、磷酸化和苏素化。

测试可以以多重形式进行，其中单一反应罐被用于检测多种分析物。这些测 试的实例包括利用多种引物组的扩增、利用通用引物的扩增、基于阵列的杂交或 扩增、基于乳剂的扩增。

虽然可设计探针和引物来检查基因、mRNA或cDNA的特定突变或特定部分， 这些可能不是分开的实体。例如，探针和引物可被连接在一起以形成串联体，或 它们可被连接至一种或多种固相支持体，如小珠或阵列。

在所公开的方法中使用的试剂盒可包括各种成分的载体。载体可为容器或支 持体，形式为例如袋、盒、管、支架，且任选地为分室化的。试剂盒也包括在利 用上述检测技术检测突变中有用的各种成分。例如，检测试剂盒可包括一种或多 种寡核苷酸，其用作扩增所有或部分目标核酸的引物。检测试剂盒也可包括一种 或多种与目标核酸杂交的寡核苷酸探针。任选地，寡核苷酸附着至固相支持体， 例如，被并入包含在试剂盒中的微阵列，或分开供应。

固相支持体可包含用于检测单一基因、蛋白质、mRNA或基因部分的单一引 物或探针或抗体。固相支持体可包含多种引物、探针或抗体。其可作为一个组被 提供，该组检查所期望组基因的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、或17种的突变。该组可选自或包括CTNNB1、EGFR、PI3KCA、PTEN、 TP53、BRAF、KRAS、AKT1、NRAS、PPP2R1A、APC、FBXW7、ARID1A、CDKN2A、 MLL2、RFF43和FGFR2。

引物对可用于合成各种尺寸的扩增子。扩增子的长度可为例如50、60、75、 100、125、150、200、140、180bp。扩增子可达到例如200、250、300、400、500、 750、1000bp的长度。扩增子的尺寸可受从液体巴氏涂片中取回的模板的尺寸和/ 或质量限制。本发明中使用的探针和引物可包含野生型序列或可包含特定突变体 的序列。

在一种实施方式中，可利用随时间采集的样本进行测试。可比较测试结果的 定量或定性变化。可在潜在治愈性治疗例如手术之后使用这种分析。

Georgios Papanicolaou于1943年发表了他的开创性工作，名称为“Diagnosis of  Uterine Cancer by the Vaginal Smear”(31)。同时，他认为在理论上，指出子宫颈 内取样不仅可用于检测宫颈癌，也可用于检测在女性生殖道中发生的其它癌症， 包括子宫内膜癌。此处报道的研究使我们更接近该目的。为了纪念Papanicolaou 对早期癌症检测领域的开创性贡献，本发明已经将本文所述的方法命名为 “PapGene”测试。

在过去几年中最重要的进展之一是发现所有人类癌症均是有限的一组基因和 这些基因起作用所通过的更加有限的一组途径中突变的结果(32)。本发明呈现 的全外显子组测序数据结合之前的全基因组研究，提供了癌症常见基因特征的鲜 明实例(图6，表2)。通过分析仅仅12种基因(图11，表S5)的特定区域，本 发明可在九种不同的妇科癌症的绝大多数中检测到至少一种驱动突变(图5，表1)。 虽然这12种基因中的几种是肿瘤抑制基因，并且因此难以在治疗上靶定，但对它 们突变方式的了解为癌症诊断提供前所未有的机遇。

这篇论文中最重要的发现是大量来自子宫内膜癌和卵巢癌的细胞或细胞碎片 存在于在子宫颈中，并可通过分子遗传方法检测。子宫颈细胞学样本中来自子宫 内膜癌和卵巢癌的恶性细胞的检测相对不常见。镜检并不总能将它们相互区分、 与宫颈癌区分、或与更良性的状况区分。本发明的研究显示，100％的子宫内膜癌 (n＝24)，即使是低级别的子宫内膜癌，以及41％的卵巢癌(n＝22)，将细胞排 入子宫颈，其可从作为常规巴氏涂片一部分的采集的样本中检测。这个发现连同 允许可靠检测仅存在于DNA模板非常小的一部分中的突变的技术进步，为 PapGene测试提供了基础。

本研究显示灵敏的子宫颈内DNA测试的价值，但在获得最佳临床应用之前， 有许多问题需要解决。即使以其当前方式，该测试也表现出有希望用于筛查子宫 内膜癌，如图3中的数据显示，通过经Safe-SeqS分析巴氏涂片液体中的DNA， 即使是最低阶段的子宫内膜癌也可被检测。然而，仅41％的卵巢癌可在巴氏涂片 中检测到，即使当其肿瘤中的突变是已知的。在来自卵巢癌患者包含可检测突变 的九张巴氏涂片中的八张中，突变体等位基因分数为>0.1％，并因此在PapGene测 试目前可检测的范围内(图9，表S3)。技术的进一步改进可提高PapGene测试 的技术灵敏度并允许其检测更多的卵巢癌。提高这种灵敏度的其它方案包括身体 调节，如在骨盆检查的过程中按摩附件区域或通过在月经周期期间在指定的时间 进行PapGene测试。改进的采集方法的开发也可能能够提高灵敏度。现有液体样 本被设计用于检测宫颈癌并因此利用从外子宫颈部采集细胞且仅最低限度地穿过 子宫颈内管的刷。类似于管吸子宫内膜活检仪器、可被引入子宫内膜腔的小套管 理论上可获得更富集的来自子宫内膜、输卵管和卵巢的细胞样品(33)。

PapGene测试的高灵敏度和定量性质也开启利用其监测对激素剂(例如黄体 酮)的反应的可能性，该激素剂用于治疗具有低风险子宫内膜癌的年轻女性。这 些女性中的一些选择保持生育能力，接受药物治疗而非子宫切除(34)。症状前 的卵巢癌、甚至是晚期的卵巢癌的检测也可能是有益的。虽然并不完全类似，但 已证明卵巢癌最重要的预后指标之一是外科减积手术后的残留疾病的量。起初， 如果残余的肿瘤小于2cm，则减积手术被视为是最佳的。随后，阈值减小至1cm， 且外科医生现在尝试去除任何可见的肿瘤。随着外科减积手术的每种改进，存活 已经延长(35)。小体积的肿瘤可能比作为有症状的高级别浆液性癌的典型特征 的大体积疾病对细胞毒性化学疗法更敏感。

本文所述的筛查途径的关键方面是其应该相对廉价且容易被纳入骨盆检查。 HPV DNA的检测已经成为常规巴氏涂片测试的一部分，因为HPV分析提高了测 试的灵敏度(36、37)。PapGene测试的DNA纯化部分与用于HPV的DNA纯化 部分相同，因此该部分显然是可行的。在美国，如今DNA的制备、多重扩增和 PapGene测试部分的零售成本也可以以相当于常规HPV测试的成本进行。请注意， PapGene测试的Safe-SeqS部分提供的提高的灵敏度(参见实施例6)可在任何大 规模并行测序仪器上实现，而不仅仅是在由Illumina生产的仪器上实现。随着预期 在未来大规模并行测序成本降低，PapGene测试应该变得更便宜。

在美国，每年有数百万的巴氏涂片测试进行。PapGene测试能够在如此大量的 样本上进行吗？本发明认为可以，因为整个DNA纯化和扩增过程可自动化进行， 正如其用于HPV测试一样。虽然每年进行数百万这些复杂的基于序列的测试现在 似乎不现实，但毫无疑问当Papanicolaou发表他的原始论文时，进行广泛的常规巴 氏涂片测试也似乎不现实(31)。即使在如今，当许多子宫颈细胞学样本利用自 动化技术筛查时，相当大的百分比需要由有经验的细胞病理学家评估。相反， PapGene测试的分析完全在计算机中进行，并且测试的读出是客观和定量的。

总之，PapGene测试通过明确的子宫内膜癌和卵巢癌检测而具有提高常规细胞 学筛查效用的能力。除了分析更加大量的患有和不患有各种类型的子宫内膜癌、 卵巢癌和输卵管癌的患者，这一系列研究中的下一步是包括在宫颈癌中改变的基 因以及多重Safe-SeqS测定中的HPV扩增子(图11，表S5)。这些补充将提供可 对管理患有子宫颈瘤形成早期的患者有价值的信息，因为HPV阳性单独对宫颈癌 及其前期病灶的检测没有特异性，尤其是在年轻、性活跃的女性中，其在没有瘤 形成的情况下经常包含HPV感染。

以上公开内容大体上描述了本发明。本文所公开的所有参考文献通过引用明 确地并入。通过参考以下具体实施例，可获得更完全的理解，具体实施例在本文 中提供仅用于说明的目的，且不旨在限制本发明的范围。

实施例1

发明人推测，更复杂的分子方法可能能够以比用常规方法更高的灵敏度和特 异性检测子宫颈内样本中癌细胞的存在。具体地，本发明假设子宫内膜癌和卵巢 癌的特征性体细胞突变将在从常规基于液体的巴氏涂片(下文中称为“巴氏涂片”； 图1)中纯化的DNA中发现。不同于细胞学上异常细胞，这种致癌DNA突变是 非赘生性细胞中应当不存在的瘤形成的特异性克隆标记。然而，发明人不知道这 种DNA是否确实存在于子宫颈内样本中，且发明人不知道它们是否以足以检测它 们的量存在。进行本文所述的实验以测试本发明的假设。

针对本研究有四个部分：I、确定通常存在于子宫内膜癌和卵巢癌中的体细胞 突变；II、鉴定46名患有这些癌症的患者肿瘤中的至少一种突变；III、确定在这 些肿瘤中鉴定的突变是否也可在相同患者的巴氏涂片中检测；和IV、针对常见于 子宫内膜癌或卵巢癌中的突变、可直接评价来自巴氏涂片的细胞的技术的开发。

实施例2

子宫内膜癌和卵巢癌中体细胞突变基因的发生率

有五种主要的卵巢癌组织病理学亚型。最普遍的亚型是高级别浆液性(占总 数的60％)，然后是子宫内膜样(15％)、明细胞(10％)和低级别浆液性癌(8％) (表1)。全基因组研究已经鉴定了在最普遍的卵巢癌亚型中最常见突变的基因(表 2)(23-25)。

对子宫内膜样和黏液亚型——其共同呈现～20％的卵巢癌病例(表1)——的 这种全面的研究还未有报道。然而，子宫内膜样和黏液亚型中常见突变的基因已 经得到报道(26)。总体而言，上皮卵巢癌中最常见突变的基因是TP53，其在这 些癌症的69％中发生突变(表2)。其它高度突变的基因包括ARID1A、BRAF、 CTNNB1、KRAS、PIK3CA和PPP2R1A(表2)。

在子宫内膜癌中，到目前为止子宫内膜样亚型是最常见的，呈现占总数的85％ (表1)。由于这种亚型的癌症非常频繁且在全基因组水平未得到分析，因此发明 人通过全外显子组测序来评价它们。自22例散发性子宫内膜样癌以及相匹配的非 赘生性组织纯化的DNA被用于生成44个适于大规模并行测序的文库。患者的临 床特点和肿瘤的组织病理学特征列于表S1中。虽然22例癌症的检查不能提供肿 瘤类型全面的基因组景象，但其足够用于诊断目的——因为这只需要鉴定最频繁 突变的基因。

在44个文库中，在靶定区域中每种碱基的平均覆盖为149.1，由至少十个读 取呈现88.4％的靶碱基。利用鉴定体细胞突变的严格标准(如材料和方法部分中所 述)，测序数据将肿瘤明确划分为两组：10例癌症(因未高度突变而称为N组) 每个肿瘤含有<100个体细胞突变(中位数为32，范围为从7至50)，而12例癌 症(因高度突变而称为H组)每个肿瘤含有>100个体细胞突变(中位数为674， 范围为从164至4,629)(图7，表S1)。

H组肿瘤中大量的突变与DNA修复的缺陷相一致。12例H组肿瘤中的8例 具有微卫星不稳定性(MSI-H，表S1)，支持了这一推测。此外，H组肿瘤中的6 例包含错配修复基因MSH2或MSH6的体细胞突变，而N组癌症均不包含错配修 复基因的突变。已知错配修复缺陷在子宫内膜癌中是常见的，且这些肿瘤在19-71％ 的具有错配修复基因遗传性突变的女性(即，患有遗传性非息肉病性结直肠癌的 患者)中发生(27)。

在22例癌症中鉴定了12,795个体细胞突变。最常见突变的基因包括PIK3通 路基因PTEN和PIK3CA(28)、APC通路基因APC和CTNNB1、成纤维细胞生 长因子受体FGFR2、接头蛋白FBXW7和染色质修饰基因ARID1A和MLL2(表2)。 这些通路中的基因在N组和H组肿瘤中都发生突变。本发明的结果与已经评价小 数量的基因的子宫内膜样子宫内膜癌的现有研究相一致，然而并未意识到FBXW7、 MLL2和APC中突变的发生如本发明所发现的那样频繁。同样有趣的是，在这些 子宫内膜癌中发现很少的TP53突变(5％)(表2)，该发现也与现有研究相一致。

子宫内膜的乳头状浆液性癌占子宫内膜癌的10-15％，这种肿瘤亚型最近的全 基因组测序研究已经发表(29)。这种亚型中最常见的突变列于表2中。子宫内 膜癌最不常见的亚型是明细胞癌，其发生<5％。从文献中获得了报道的在这些癌症 中突变的基因(表2)。

实施例3

鉴定肿瘤组织中的突变

发明人从46名癌症患者中获得肿瘤，其中可提供巴氏涂片。这包括24名患 有子宫内膜癌的患者和22名患有卵巢癌的患者；临床和组织病理学特征列于表S3 中。

通过如上所述的全外显子组测序或通过卵巢癌或子宫内膜癌最常见亚型中频 繁突变的基因的靶定测序，鉴定46例肿瘤中的体细胞突变(表2)。利用包括与 一组感兴趣基因区域互补的寡核苷酸(“捕获探针”)的自定义固相捕获测定，实现 这些基因的富集。对于癌基因，发明人只靶定了它们常见突变的外显子，但发明 人靶定了肿瘤抑制基因的整个编码区。

Illumina的DNA测序文库从肿瘤和它们相匹配的非赘生性组织生成，然后利 用上述测定捕获。在通过PCR扩增之后，在Illumina的GA IIx仪器上每个通道测 序4至8个捕获的DNA文库。在46个病例的每一例中，发明人鉴定了至少一个 由独立测定确定的体细胞突变(表S3)，如下所述。

实施例4

鉴定巴氏涂片中的体细胞突变

在如今常规使用的基于液体的巴氏涂片技术中，临床医师在盆腔检查的过程 中将小刷插入子宫颈内管并转动该刷，以便其将松散连接的细胞或细胞碎片取出 并与其粘着。然后，将该刷置于一小瓶固定液(例如ThinPrep)中。来自小瓶的 液体中的一些用于制备用于细胞学分析或用于纯化HPV DNA的载玻片。在本发明 的研究中，从液体中纯化的DNA的等份试样用于评价来自上述46名患者癌的 DNA的存在。初步研究显示通过以1,000g离心5分钟而形成团块的、液体中固定 的细胞或细胞碎片，包含小瓶中>95％的总DNA。因此，当可提供的液体的量大于 3mL时(如在一些基于液体的巴氏涂片试剂盒中出现)，发明人纯化了来自细胞 团块的DNA，且为了方便，当试剂盒中液体的量较少时，纯化来自液体和细胞的 DNA。在所有的病例中，纯化的DNA有相对高的分子量(95％>5kb)。从46张 巴氏涂片中回收的DNA的平均量为49.3±74.4ng/ml(表S3)。

发明人预测，如果全部存在，源自巴氏涂片液体中赘生性细胞的DNA的量与 源自从子宫颈内管刷下的正常细胞的DNA相比相对较少。这使能够应用可靠地鉴 定大大过量的野生型等位基因中极少的突变体等位基因群体的分析技术成为必 要。在(30)中所述的Safe-SeqS(安全-测序系统)程序之一的改进被设计用于此 目的(图2)。

简而言之，对一组基因特异性引物进行有限数量的PCR循环。这些引物之一 包含14个位于其基因特异性序列5'的简并N碱基(为A、C、G或T的概率相等)， 且两种引物均包含允许在下一个步骤中通用扩增的序列。14个N形成每个原始模 板分子的唯一标示符(UID)。用通用引物生成的随后的PCR产物在Illumina MiSeq 仪器上纯化和测序。如果突变在模板分子中先存在，该突变应该存在于每个包含 该UID的子分子中，这些突变称为“超突变体(超突变体)”(30)。未在原始模 板中发生的突变，如在扩增步骤的过程中或通过碱基判定中的错误发生的突变， 不应当造成超突变体。此处所用的Safe-SeqS途径能够检测5,000至1,000,000种野 生型模板中的1种突变体模板，这取决于扩增子和扩增子中被查询的位置(30)。

发明人设计了Safe-SeqS引物(表S4)，以检测来自表S3中所述的46名患 者的每一名中的至少一种突变。在来自患有子宫内膜癌的患者的24张巴氏涂片中， 鉴定每个病例中存在于肿瘤中的突变(100％)。突变体等位基因的中位分数为 2.7％，范围为从0.01％至78％(图3和表S3)。将来自非赘生性组织的DNA的 扩增用作这些实验中的阴性对照，以限定每个查询的突变的检测限值。在所有的 病例中，突变体等位基因的分数与由阴性对照确定的背景突变水平显著不同 (P<0.001，二项式检验)。突变体等位基因的分数和组织病理学亚型或癌症的阶 段之间没有明显的关联(图3和表S3)。

在两个子宫内膜癌病例中，在巴氏涂片中评价肿瘤DNA中发现的两种突变(表 S3)。在两个病例中，在来自巴氏涂片的DNA中鉴定到突变(表S3)。此外， 巴氏涂片中的两种突变的突变体等位基因分数之间的比率与相应的肿瘤样本的两 种突变的突变体等位基因分数之间的比率有关。例如，在病例PAP 083的巴氏涂 片中，CTNNB1和PIK3CA突变的突变体等位基因分数分别为0.143％和0.064％- 比率为2.2(＝0.14％比0.064％)。在来自PAP 083的初始肿瘤中，相应的比率为 2.0(79.5％比39.5％)。

来自卵巢癌患者的巴氏涂片DNA的相似分析在22名患者(41％)中的9名 中显示可检测突变。突变体等位基因分数比子宫内膜癌中小(中位数为0.49％，范 围为0.021％至5.9％；参见图3和表S3)。除了一个具有可检测突变的病例外， 其余所有的具有可检测突变的病例为上皮肿瘤；这个例外是无性细胞瘤，其为卵 巢的恶性生殖细胞肿瘤(表S3)。如子宫内膜癌一样，突变体等位基因分数和组 织病理学标准之间没有统计学上显著的关联。然而，大多数卵巢癌仅在晚期检测 到，且这在本发明的群组中可获得的患者中得到反映。

实施例5

用于筛查目的的遗传测试

上述结果证明来自大多数子宫内膜癌和一些卵巢癌的突变体DNA分子可在常 规采集的巴氏涂片发现。然而，在图3所示的所有46个病例中，已知在肿瘤中发 生一种特定的突变，随后设计测定来确定该突变是否也存在于相应的巴氏涂片中。 在筛查设定中，在测试之前显然没有已知的肿瘤。因此发明人设计了基于Safe-SeqS 的原型测试，其可用于筛查设定中(图2)。

这种多重方法包括50个引物对，其扩增241至296bp含有DNA频繁突变区 域的片段。待扩增的区域从第I节中所述结果中选择，并包括来自APC、AKT1、 BRAF、CTNNB1、EGFR、FBXW7、KRAS、PIK3CA、PPP2R1A、PTEN和TP53 的外显子。在对照实验中，显示50种扩增子中的46种提供关于最少2,500种模板 的信息；所测序的模板的数量可直接从基于SafeSeqS的测序中确定(图2)。鉴 于SafeSeqS的精确性，这个数量足以容易地检测在>0.1％的模板分子中存在的突 变(30)。由这46种扩增子覆盖的包含10,257bp的区域(表S5)，被预测能够 检测>90％的子宫内膜癌或卵巢癌中的至少一种突变。

这种测试应用于14个病例的巴氏涂片——12个子宫内膜和2个卵巢——以及 14张从正常女性采集的巴氏涂片。14个癌症病例任意地选自突变体等位基因分数 >0.1％的癌症病例(表S3)并因此超过多重测定的检测限值。在所有14张患有癌 症的女性的巴氏涂片中，预期存在的突变(表S3)得到鉴定(图4和表S6)。多 重测试中的突变体等位基因分数与每个扩增子仅使用一个Safe-SeqS引物对在同一 样本的原始分析中观察的突变体等位基因分数相似(表S3和表S6)。重要的是， 在来自不患有癌症的女性的14张巴氏涂片中没有检测到突变(图4；参见材料和 方法)。

实施例6

材料和方法

患者样本

使用由约翰霍普金斯医学院机构审查委员会(Baltimore,MD)、纪念斯隆-凯 特琳癌症中心(New York,NY)、圣保罗大学(Sao Paulo,Brazil)和ILSbio,LLC (Chestertown,MD)认可的方案，获得用于此研究的所有样本。对每个病例采集 人口统计、临床和病理分期数据。所有组织病理学由委员会认证的病理学家集中 重新审查。分期基于2009年FIGO标准(38)。

委员会认证的病理学家通过冰冻切片分析手术切除的卵巢和子宫内膜赘生物 的新鲜-冰冻组织样本，以评价赘生性细胞密度。利用连续的冰冻切片来引导最适 切割温度(OCT)化合物包埋的冰冻组织块的修剪，以富集赘生性细胞部分用于 DNA提取。

由委员会认证的病理学家(Propath LLC,Dallas,TX)评价福尔马林固定石蜡 包埋(FFPE)的组织样本的肿瘤细胞密度并从而界定高肿瘤细胞密度区域。用剃 须刀片显微切割来自原始肿瘤块的载玻片上的连续10微米切片的肿瘤组织，以富 集赘生性细胞部分用于DNA提取。

正常DNA的来源是匹配的全血或非赘生性正常的邻近组织。

基于液体的巴氏涂片利用来自Digene HC2DNA采集装置(Qiagen)或ThinPrep 2000系统(Hologic)的子宫颈刷和运送培养基采集，并利用制造商的推荐进行储 存。

除非另有指明，所有与患者相关的值报告为平均值±1标准差。

DNA提取

根据制造商的说明书使用AllPrep试剂盒(Qiagen)从肿瘤和正常组织以及基 于液体的巴氏涂片中纯化DNA。通过按照制造商的实验方案添加3mL的RLTM 缓冲液(Qiagen)并随后结合至AllPrep DNA柱(Qiagen)，从肿瘤组织中纯化 DNA。当液体的量小于3mL时，通过添加5体积的RLTM缓冲液从巴氏涂片液 体中纯化DNA。当液体的量为>3mL时，在1,000×g下使细胞和细胞碎片形成团 块5分钟，将团块溶解于3mL的RLTM缓冲液中。在所有病例中，使用qPCR、 利用前述引物和条件(39)定量DNA。

微卫星不稳定性测试

根据制造商的说明书，利用MSI分析系统(Promega)检测微卫星不稳定性， 该系统包含5个单核苷酸重复(BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24和MONO-27) 和2个五核苷酸重复基因座。在扩增之后，在Applied Biosystems 3130毛细管电泳 仪(Invitrogen)上测量荧光PCR产物的大小。肿瘤样本指定如下：如果与种系 DNA相比在长度上变化两个或更多个单核苷酸，为MSI-高；如果仅有一个基因座 变化，为MSI-低；如果与种系相比没有变化，为微卫星稳定(MSS)。在所有病 例中，五核苷酸基因座鉴定相同。

用于外显子组测序的Illumina DNA文库和捕获物的制备

根据制造商的推荐，进行用于外显子组的和靶定DNA捕获物的Illumina基因 组DNA文库制备。简言之，利用TruSeqDNA样品制备试剂盒(Illumina)，将1-3 μg的基因组DNA用于文库制备。将DNA声波剪切(Covaris)成～200bp的目标 尺寸。随后末端修复这些片段，以将突出端转换成平端。然后，将单个“A”核苷酸 添加至平片段的3’端，以防止它们随后自身连接；接头分子3’端上相应的“T”提供 互补的突出端。在连接至接头之后，用8-14个PCR循环扩增文库，以确保外显子 组和靶定的基因捕获物的产量分别为0.5和4μg。

根据制造商的实验方案，利用SureSelect人外显子组试剂盒V 4.0(Agilent) 进行外显子组捕获，并在杂交混合物(AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACT CCAGTCAC-XXXXXX-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGT(SEQ ID NO:1)中 添加TruSeq标志特异性区段，其中六碱基对“XXXXXX”表示12种样品特异性标 志中的1种)。

靶定基因的富集

通过改进前述方法进行靶定基因的富集(40、41)。简言之，所选癌基因和 肿瘤抑制基因的靶定区域由Agilent Technologies合成为寡核苷酸探针。36个碱基 的探针被设计以捕获DNA的正链和负链，并具有33个碱基重叠。通过在室温下 与3mL 35％的氢氧化铵温育5小时，从芯片中切割寡核苷酸。将溶液转移至两个 2ml的管中，在真空下干燥，并再溶解于400μL不含核糖核酸酶(RNase)和脱 氧核糖核酸酶(DNase)的水中。利用与所有探针共有的12个碱基的序列互补的 引物，5微升的溶液用于PCR扩增，该引物为：5'-TGATCCCGCGACGA*C-3'(SEQ ID NO:2)和5'-GACCGCGACTCCAG*C-3'(SEQ ID NO:3)，*表示硫代磷酸 键。PCR产物用MinElute纯化柱(Qiagen)纯化，用End-IT DNA末端修复试剂 盒(Epicentre)进行末端修复，然后用MinElute纯化柱(Qiagen)纯化。连接PCR 产物以形成所述串联体(40)。

(40、41)中所述的实验方案与本研究中使用的实验方案之间的主要区别包 括连接的PCR产物的扩增和固相捕获方法。改进如下：使用REPLI-g Midi试剂盒 (Qiagen)以及在27.5μL的反应体系中添加2.5nmol生物素-dUTP(Roche)，扩 增50ng连接的PCR产物。反应体系在30℃下温育16个小时，聚合酶在65℃下 灭活3分钟。扩增的探针用QiaQuick PCR纯化柱(Qiagen)纯化。对于捕获，4-5 μg的文库DNA与1μg制备的探针在如前所述的杂交混合物(40)中温育。随后， 使用500μgMyOne链霉抗生物素(Invitrogen)纯化生物素化的探针 和捕获的文库序列。在按照制造商的推荐洗涤之后，捕获的序列用0.1M的NaOH 洗脱，随后用1M的Tris-HCl(pH 7.5)中和。使用QIAquick MinElute柱(Qiagen) 以20μL脱盐和浓缩中和的DNA。在100μL的Phusion Hot Start II(Thermo  Scientific)反应体系中扩增洗脱物，该反应体系包含1×Phusion HF缓冲液、0.25mM dNTPs、各自为0.5μM的正向和反向TruSeq引物和2U的聚合酶，循环条件如下： 98℃30s；98℃10s、60℃30s、72℃30s，14个循环；和72℃5min。含有富集的 靶定序列的扩增的库使用Agencourt AMPure XP系统(Beckman)纯化，并使用 2100Bioanalyzer(Agilent)定量。

下一代测序和体细胞突变鉴定

在捕获靶定序列之后，使用Illumina GA IIx基因组分析仪的配对末端测序从 每个片段提供2×75的碱基读取。经过过滤的序列标签与人基因组参考序列(hg18) 进行比对，在CASAVA 1.6软件(Illumina)中使用ELANDv2算法进行随后的变 量-调用分析。在dbSNP中记载的已知多态性从分析中移除。如前所述(24)进行 高置信度突变的鉴定。

评价低频率突变

引物设计。发明人试图设计引物对以检测本文所述的46例癌症中的突变。如 (30)所述，利用Primer 3设计引物(42)。60％的引物扩增期望的片段；在其它 40％中，需要设计第二组或第三组引物来减少引物二聚体或非特异性扩增。

测序文库制备。如前所述(30)扩增模板，其改进将在别处完整描述。简而 言之，使用2至4个循环的扩增子特异性PCR(UID指定PCR循环，参见图2)， 用14个碱基的唯一标示符(UID)——包括简并N碱基(为A、C、G或T的相 等概率)——编码每个模板分子的每条链。虽然正向和反向基因特异性引物在其 5'端均包含通用标签序列——提供引物结合位点用于第二轮扩增——只有正向引 物包含UID，其位于5'通用标签和3’基因特异性序列之间(反向引物中包含4个N 碱基，以促进测序在配对末端文库上完成)(表S4)。UID指定PCR循环包含 50μL的反应体系中的Phusion Hot Start II(Thermo Scientific)，该反应体系包含 1×Phusion HF缓冲液、0.25mM dNTPs、各自为0.5μM的正向(包含14个N碱 基)和反向引物、以及2U聚合酶。将剩余的包含UID的引物传递至第二轮扩增 可使模板定量复杂化(30)，通过在37℃核酸外切酶消化以降解未并入的引物， 并随后用AMPure XP珠(Beckman)纯化和在10μL TE(10mM Tris-HCl,1mM EDTA，pH 8.0)中洗脱，使该传递最小化。

利用引物在第二轮PCR中扩增洗脱的模板，该引物包含与Illumina GA IIx流 式细胞在其5’端杂交所必需的移植序列(图2)和两端的3’硫代磷酸，以保护其免 受剩余核酸外切酶活性的影响(30)。反向扩增引物另外包含位于5’移植和3’通 用标签序列之间的标志序列，以使得能够在序列分析仪的相同流式细胞隔室中同 时分析来自多个个体的PCR产物(30)。第二轮扩增反应体系包含1×Phusion HF 缓冲液、0.25mM dNTPs、各自为0.5μM的正向和反向引物、和2U聚合酶，共 50μL。在98℃2分钟的初始热激活步骤之后，利用以下循环条件进行23个循环的 PCR：98℃10s，65℃15s和72℃15s。利用每个样品6个独立的扩增以及表S5 中所述的引物，以类似的方式进行多重测定。PCR产物使用AMPure XP珠纯化并 直接用于在Illumina MiSeq或GA IIx仪器上测序，其结果相同。

数据分析。如前所述分析高质量序列读取(30)。简而言之，其中包含UID 的14个碱基(代表一条原始模板链；参见图2)每一个的质量分值≥15的读取按 照它们的UID进行分组。只保留由多于一个读取支持的UIDs用于进一步分析。 包含预期扩增引物序列的读取的模板特异性部分与利用自定义脚本(根据需求可 从作者获得)设定的参考序列相匹配。通过要求>50％的共有相同UID的读取包含 相同的突变(“超突变体”；参见图2)，在样品制备和/或测序步骤过程中引入的人 工突变得到消除。对于查询单个扩增子的46个测定，发明人要求突变体等位基因 的分数与自阴性对照确定的背景突变水平显著不同(P<0.001，二项式检验)。由 于在筛查环境中突变不是已知的，发明人利用了更加不可知的度量来检测多重测 定中的突变。将每个样品的阈值超突变体频率限定为等于所有超突变体的平均频 率加上平均值的6个标准差。只有超过该阈值的超突变体被指定为突变并在图4 和表S6中报告。

参考文献

引用的每篇参考文献的公开内容明确地并入本文。

1.M.Arbyn,A.Anttila,J.Jordan,G.Ronco,U.Schenck,N.Segnan,H.Wiener,A. Herbert,L.von Karsa,European Guidelines for Quality Assurance in Cervical Cancer  Screening.Second edition--summary document.Ann Oncol 21,448-458(2010).

2.R.M.DeMay,Practical principles of cytopathology.(ASCP Press,Chicago, 2010),pp.xi,402p.

3.F.Bray,J.S.Ren,E.Masuyer,J.Ferlay,Global estimates of cancer prevalence for 27sites in the adult population in 2008.Int J Cancer,(2012).

4.J.Ferlay,H.R.Shin,F.Bray,D.Forman,C.Mathers,D.M.Parkin, GLOBOCAN 2008 v2.0,Cancer Incidence and Mortality Worldwide(IARC  CancerBase No.10,Lyon,France,2010).

5.S.B.Sams,H.S.Currens,S.S.Raab,Liquid-based Papanicolaou tests in  endometrial carcinoma diagnosis.Performance,error root cause analysis,and quality  improvement.Am J Clin Pathol 137,248-254(2012).

6.P.Smith,O.Bakos,G.Heimer,U.Ulmsten,Transvaginal ultrasound for  identifying endometrial abnormality.Acta Obstet Gynecol Scand 70,591-594(1991).

7.H.Mitchell,G.Giles,G.Medley,Accuracy and survival benefit of cytological  prediction of endometrial carcinoma on routine cervical smears.Int J Gynecol Pathol 12,34-40(1993).

8.K.J.Carlson,S.J.Skates,D.E.Singer,Screening for ovarian cancer.Ann Intern  Med 121,124-132(1994).

9.H.Meden,A.Fattahi-Meibodi,CA 125in benign gynecological conditions.Int J  Biol Markers 13,231-237(1998).

10.S.S.Buys,E.Partridge,A.Black,C.C.Johnson,L.Lamerato,C.Isaacs,D.J. Reding,R.T.Greenlee,L.A.Yokochi,B.Kessel,E.D.Crawford,T.R.Church,G.L. Andriole,J.L.Weissfeld,M.N.Fouad,D.Chia,B.O'Brien,L.R.Ragard,J.D.Clapp, J.M.Rathmell,T.L.Riley,P.Hartge,P.F.Pinsky,C.S.Zhu,G.Izmirlian,B.S. Kramer,A.B.Miller,J.L.Xu,P.C.Prorok,J.K.Gohagan,C.D.Berg,Effect of  screening on ovarian cancer mortality:the Prostate,Lung,Colorectal and Ovarian (PLCO)Cancer Screening Randomized Controlled Trial.JAMA 305,2295-2303(2011).

11.ACOG Practice Bulletin.Clinical Management Guidelines for  Obstetrician-Gynecologists.Number 60,March 2005.Pregestational diabetes mellitus. Obstet Gynecol 105,675-685(2005).

12.E.Partridge,A.R.Kreimer,R.T.Greenlee,C.Williams,J.L.Xu,T.R.Church,B. Kessel,C.C.Johnson,J.L.Weissfeld,C.Isaacs,G.L.Andriole,S.Ogden,L.R. Ragard,S.S.Buys,Results from four rounds of ovarian cancer screening in a  randomized trial.Obstet Gynecol 113,775-782(2009).

13.American Cancer Society.Detailed guide:ovarian cancer—can ovarian cancer be  found early？(Available at  http://www.cancer.org/Cancer/OvarianCancer/DetailedGuide/ovarian-cancer-detection).

14.Screening for ovarian cancer:recommendation statement.U.S.Preventive Services  Task Force.Am Fam Physician 71,759-762(2005).

15.ACOG Committee Opinion:number 280,December 2002.The role of the  generalist obstetrician-gynecologist in the early detection of ovarian cancer.Obstet  Gynecol 100,1413-1416(2002).

16.National Comprehensive Cancer Network Practice Guidelines in Oncology:ovarian  cancer and genetic screening.(Available at  http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/PDF/genetics_screening.pdf).

17.N.M.Lindor,G.M.Petersen,D.W.Hadley,A.Y.Kinney,S.Miesfeldt,K.H.Lu, P.Lynch,W.Burke,N.Press,Recommendations for the care of individuals with an  inherited predisposition to Lynch syndrome:a systematic review.JAMA 296, 1507-1517(2006).

18.J.P.Marques,L.B.Costa,A.P.Pinto,A.F.Lima,M.E.Duarte,A.P.Barbosa,P. L.Medeiros,Atypical glandular cells and cervical cancer:systematic review.Rev Assoc  Med Bras 57,234-238(2011).

19.R.P.Insinga,A.G.Glass,B.B.Rush,Diagnoses and outcomes in cervical cancer  screening:a population-based study.Am J Obstet Gynecol 191,105-113(2004).

20.K.E.Sharpless,P.F.Schnatz,S.Mandavilli,J.F.Greene,J.I.Sorosky,Dysplasia  associated with atypical glandular cells on cervical cytology.Obstet Gynecol 105, 494-500(2005).

21.C.P.DeSimone,M.E.Day,M.M.Tovar,C.S.Dietrich,3rd,M.L.Eastham,S.C. Modesitt,Rate of pathology from atypical glandular cell Pap tests classified by the  Bethesda 2001 nomenclature.Obstet Gynecol 107,1285-1291(2006).

22.C.S.Geier,M.Wilson,W.Creasman,Clinical evaluation of atypical glandular  cells of undetermined significance.Am J Obstet Gynecol 184,64-69(2001).

23.Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma.Nature 474,609-615(2011).

24.S.Jones,T.L.Wang,M.Shih Ie,T.L.Mao,K.Nakayama,R.Roden,R.Glas,D. Slamon,L.A.Diaz,Jr.,B.Vogelstein,K.W.Kinzler,V.E.Velculescu,N. Papadopoulos,Frequent mutations of chromatin remodeling gene ARID1A in ovarian  clear cell carcinoma.Science 330,228-231(2010).

25.S.Jones,T.L.Wang,R.J.Kurman,K.Nakayama,V.E.Velculescu,B. Vogelstein,K.W.Kinzler,N.Papadopoulos,M.Shih Ie,Low-grade serous carcinomas  of the ovary contain very few point mutations.J Pathol 226,413-420(2012).

26.S.A.Forbes,N.Bindal,S.Bamford,C.Cole,C.Y.Kok,D.Beare,M.Jia,R. Shepherd,K.Leung,A.Menzies,J.W.Teague,P.J.Campbell,M.R.Stratton,P.A. Futreal,COSMIC:mining complete cancer genomes in the Catalogue of Somatic  Mutations in Cancer.Nucleic Acids Res 39,D945-950(2011).

27.E.Barrow,L.Robinson,W.Alduaij,A.Shenton,T.Clancy,F.Lalloo,J.Hill,D. G.Evans,Cumulative lifetime incidence of extracolonic cancers in Lynch syndrome:a  report of 121 families with proven mutations.Clin Genet 75,141-149(2009).

28.K.Oda,D.Stokoe,Y.Taketani,F.McCormick,High frequency of coexistent  mutations of PIK3CA and PTEN genes in endometrial carcinoma.Cancer Res 65, 10669-10673(2005).

29.E.Kuhn,R.C.Wu,B.Guan,G.Wu,J.Zhang,Y.Wang,L.Song,X.Yuan,L. Wei,R.B.Roden,K.T.Kuo,K.Nakayama,B.Clarke,P.Shaw,N.Olvera,R.J. Kurman,D.A.Levine,T.L.Wang,I.M.Shih,Identification of Molecular Pathway  Aberrations in Uterine Serous Carcinoma by Genome-wide Analyses.J Natl Cancer  Inst,(2012).

30.I.Kinde,J.Wu,N.Papadopoulos,K.W.Kinzler,B.Vogelstein,Detection and  quantification of rare mutations with massively parallel sequencing.Proc Natl Acad Sci  U S A 108,9530-9535(2011).

31.H.F.Traut,G.N.Papanicolaou,Cancer of the Uterus:The Vaginal Smear in Its  Diagnosis.Cal West Med 59,121-122(1943).

32.B.Vogelstein,K.W.Kinzler,Cancer genes and the pathways they control.Nat  Med 10,789-799(2004).

33.J.M.Cooper,M.L.Erickson,Endometrial sampling techniques in the diagnosis of  abnormal uterine bleeding.Obstet Gynecol Clin North Am 27,235-244(2000).

34.C.C.Gunderson,A.N.Fader,K.A.Carson,R.E.Bristow,Oncologic and  reproductive outcomes with progestin therapy in women with endometrial hyperplasia  and grade 1 adenocarcinoma:a systematic review.Gynecol Oncol 125,477-482(2012).

35.R.E.Bristow,R.S.Tomacruz,D.K.Armstrong,E.L.Trimble,F.J.Montz, Survival effect of maximal cytoreductive surgery for advanced ovarian carcinoma  during the platinum era:a meta-analysis.J Clin Oncol 20,1248-1259(2002).

36.M.H.Mayrand,E.Duarte-Franco,I.Rodrigues,S.D.Walter,J.Hanley,A. Ferenczy,S.Ratnam,F.Coutlee,E.L.Franco,Human papillomavirus DNA versus Papanicolaou screening tests for cervical cancer.N Engl J Med 357,1579-1588(2007).

37.P.Naucler,W.Ryd,S.Tornberg,A.Strand,G.Wadell,K.Elfgren,T.Radberg,B. Strander,B.Johansson,O.Forslund,B.G.Hansson,E.Rylander,J.Dillner,Human  papillomavirus and Papanicolaou tests to screen for cervical cancer.N Engl J Med 357, 1589-1597(2007).

38.S.Pecorelli,Revised FIGO staging for carcinoma of the vulva,cervix,and  endometrium.Int J Gynaecol Obstet 105,103-104(2009).

39.C.Rago,D.L.Huso,F.Diehl,B.Karim,G.Liu,N.Papadopoulos,Y.Samuels,V. E.Velculescu,B.Vogelstein,K.W.Kinzler,L.A.Diaz,Jr.,Serial assessment of  human tumor burdens in mice by the analysis of circulating DNA.Cancer Res 67, 9364-9370(2007).

40.J.Wu,H.Matthaei,A.Maitra,M.Dal Molin,L.D.Wood,J.R.Eshleman,M. Goggins,M.I.Canto,R.D.Schulick,B.H.Edil,C.L.Wolfgang,A.P.Klein,L.A. Diaz,Jr.,P.J.Allen,C.M.Schmidt,K.W.Kinzler,N.Papadopoulos,R.H.Hruban,B. Vogelstein,Recurrent GNAS mutations define an unexpected pathway for pancreatic  cyst development.Sci Transl Med 3,92ra66(2011).

41.J.He,J.Wu,Y.Jiao,N.Wagner-Johnston,R.F.Ambinder,L.A.Diaz,Jr.,K.W. Kinzler,B.Vogelstein,N.Papadopoulos,IgH gene rearrangements as plasma  biomarkers in Non-Hodgkin's lymphoma patients.Oncotarget 2,178-185(2011).

42.S.Rozen,H.Skaletsky,Primer3 on the WWW for general users and for biologist  programmers.Methods Mol Biol 132,365-386(2000).

43.N.Howlader,A.M.Noone,M.Krapcho,N.Neyman,R.Aminou,S.F.Altekruse, C.L.Kosary,J.Ruhl,Z.Tatalovich,H.Cho,A.Mariotto,M.P.Eisner,D.R.Lewis,H. S.Chen,E.J.Feuer,K.A.Cronin,SEER Cancer Statistics Review,1975-2009 (National Cancer Institute.Bethesda,MD,2012).

44.A.Malpica,M.T.Deavers,K.Lu,D.C.Bodurka,E.N.Atkinson,D.M. Gershenson,E.G.Silva,Grading ovarian serous carcinoma using a two-tier system.Am  J Surg Pathol 28,496-504(2004).

45,L.A.G.Ries,J.L.Young,G.E.Keel,M.P.Eisner,Y.D.Lin,M-J.Horner,SEER  Survival Monograph:Cancer Survival Among Adults:US SEER Program,1988-2001, Patient and Tumor Characteristics(NIH Pub.No.07-6215.National Cancer Institute, Bethesda,MD,2007).

46.C.A.Hamilton,M.K.Cheung,K.Osann,L.Chen,N.N.Teng,T.A.Longacre,M. A.Powell,M.R.Hendrickson,D.S.Kapp,J.K.Chan,Uterine papillary serous and  clear cell carcinomas predict for poorer survival compared to grade 3 endometrioid  corpus cancers.Br J Cancer 94,642-646(2006).