三甲基胺-N-氧化物作为增重和肥胖倾向的生物标志物

摘要

本发明一般地涉及营养和健康领域。特别地，本发明涉及新生物标志物、其用途和允许其诊断抵抗饮食诱导的增重，和/或对饮食诱导的增重敏感的可能性的方法。例如，生物标志物可以是三甲基胺-N-氧化物。

说明书

本发明一般地涉及营养和健康领域。特别地，本发明涉及新生物标志物、其用途和允许其诊断抵抗饮食诱导的增重，和/或易受饮食诱导的增重的可能性的方法。例如，生物标志物可以是三甲基胺-N-氧化物。此生物标志物也可用于诊断/监测生活方式改变对对象中增重风险的影响。

肥胖已经成为21世纪中最重要的全球性健康问题，因为其升高了患其他疾病，包括2型糖尿病、肝性脂肪变性(NAFLD)、癌症、关节炎和心血管疾病(CVD)的风险。肥胖的病因学来自遗传和环境因素诸如高热量饮食、缺乏体力活动和行为的复杂相互作用。参与多种生理功能诸如肠道先天免疫系统的成熟和养分的消化/吸收的肠道微生物群也影响了若干种代谢疾病的发展并且似乎对肥胖具有显著的影响。因此，发生肥胖的个体倾向根据这些多因素原因而不同。

摄入富含脂肪和/或碳水化合物的不平衡饮食已经与脂肪组织以及瘦组织诸如肝、肌肉和心脏中的增加的甘油三酯贮藏速率相关联。此异位脂肪沉积诱导性脂毒性也与多种代谢病症诸如高甘油三酯血症、高血压、高空腹血糖和胰岛素抵抗(IR)相关联。然而，一些超重或肥胖人可能发展出多种代谢病症而其他人保持健康。例如，身体中脂肪沉积的定位影响代谢病症的发展。已经将足以释放致动脉粥样硬化的脂连蛋白并处理脂肪酸的心外膜脂肪明确地与人中心血管疾病(CVD)标志物相关联。相比较之下，已经将肝内脂肪与炎症和胰岛素抵抗相关联。Wildman等人也突出了健康中年女性中的种族与族群差异与内脏和皮下脂肪组织的差别的代谢活性相关联，这能影响发展出肥胖和CVD的族群相关的倾向。因此，在早期阶段鉴定出发展肥胖相关的代谢病症的可能性，以评价个体代谢状态和有效地预防代谢疾病的发展是相关的。

因此为本领域提供允许早期-理想地在其增重之前-鉴定当消耗富含脂肪的饮食时很可能增重的对象的方法将是合乎期望的。

本说明书中对现有技术文件的任何参考不应被认为是承认此类现有技术是广泛已知的或形成本领域中普通一般知识的一部分。

本发明的目的是提高本领域技术并且特别地是提供允许在早期有效地将人们分层为其是否很可能响应高脂肪饮食而增重的方法。

本发明人惊讶地发现本发明的目的能够通过独立权利要求的主题实现。从属权利要求进一步发展了本发明的观点。

因此，本发明提供了生物标志物，其用途和诊断抵抗高脂肪饮食诱导的增重的可能性的方法。

如本说明书中所用，词语“包含”，“含有”，和相似的词语不应以排他性或穷尽性含义解释。换言之，其旨在意为“包括，但不限于”。

本发明人已经使用了代谢组学方法以实现本发明的目的。代谢组学在今天被认为是表征代谢表型的完善建立的系统方法，其包含多种因素诸如环境、药物、饮食、生活方式、遗传学，和微生物组因素的影响。与提示生理学变化的可能性的基因表达和蛋白质组数据不同，代谢物及其在细胞、组织和器官内的动态浓度改变，代表了生理调控过程的真正终点。

因此，研究与多种饮食性干预和疾病发展关联的逐渐的代谢改变是合适的方法。最近，基于代谢组学和脂类组学的发现已经加速了我们对疾病过程的理解，并且将提供用于与代谢综合征相关联的亚临床病症的预防和营养管理的新途径。“组学”数据已经突出了能量代谢(Krebs循环)、脂类和氨基酸加工，以及炎性信号对肥胖和IR发作的贡献。

使用随时间收集的尿样品的质子核磁共振(¹H NMR)光谱学和增重监控的组合，本发明人已经在良好定义的C57BL/6小鼠模型中鉴定了由高脂肪饮食诱导的逐渐增重的新的代谢生物标志物。公知此动物模型在同基因动物中显示极端表型，即抵抗或倾向于高脂肪诱导的增重分布的动物。本发明人已经表征了用高脂肪饮食(HFD)饲喂的C57BL/6小鼠的短期(7天)和长期(60天)代谢适应并且已经建立了与HFD饲喂的小鼠(即抵抗或倾向于高脂肪诱导的增重的动物)中的表型变异性相关联的具体代谢标志。通过使用代谢组学方法，发明人已经显示线粒体代谢途径(脂肪酸β氧化、支链氨基酸分解代谢、丁酸代谢、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸途径和Krebs循环)由高脂肪烟酰胺腺嘌呤二核苷酸Krebs饲喂快速上调，这可能反映线粒体的脂肪酸饱和以及能量代谢的损害。

发明人能够显示在HFD下肥胖抗性的小鼠与线粒体氧化途径(β氧化、丁酸代谢和亮氨酸分解代谢)的具体激活相关联，所述激活可能是针对脂肪酸过载的保护性机制。

这些结果强调了线粒体在肥胖发展中的作用并允许得出这样的结论，即，使用发明人已经鉴定的具体的生物标志物组，能够从早期代谢标志测定发展代谢病症，诸如肥胖的可能性。

发明人能够显示在高脂肪饲喂一周后(第7天)的尿代谢响应使得不仅能预测每个个体的最终增重(第60天)，还能够根据其抵抗或倾向于高脂肪诱导的增重的倾向而对动物分层。

因此，本发明涉及新的生物标志物三甲基胺-N-氧化物。

本发明还涉及三甲基胺-N-氧化物作为尿中用于检测和/或定量抵抗高脂肪饮食诱导的增重的可能性的生物标志物的用途。相似地，本发明还涉及三甲基胺-N-氧化物作为尿中用于检测和/或定量易受高脂肪饮食诱导的增重的可能性的生物标志物的用途。

本发明还涉及诊断受试者中抵抗高脂肪饮食诱导的增重的可能性的方法，所述方法包括测定先前从待测试的受试者获得的尿样品中三甲基胺-N-氧化物的水平，和比较受试者的三甲基胺-N-氧化物水平与预测定的参照值，其中预测定的参照值是基于对照群体中尿中的平均三甲基胺-N-氧化物水平，并且其中较之预测定的参照值样品中增加的三甲基胺-N-氧化物水平或缺乏改变表明抵抗高脂肪饮食诱导的增重的降低的可能性。相似地，本发明也涉及诊断受试者中易受高脂肪饮食诱导的增重的可能性的方法,所述方法包括测定先前从待测试的受试者获得尿样品中三甲基胺-N-氧化物的水平，并比较受试者的三甲基胺-N-氧化物水平与预测定的参照值，其中预测定的参照值是基于对照群体中尿中的平均三甲基胺-N-氧化物水平,并且其中较之预测定的参照值样品中降低的三甲基胺-N-氧化物水平提示易受高脂肪饮食诱导的增重的降低的可能性。

本发明的此生物标志物也可用于诊断和/或监测生活方式的改变对受试者中增重风险的影响。对于此，可以在生活方式改变之前测定生物标志物水平并且在生活方式改变之后将获得的水平可以与所述生物标志物的水平比较。

图1：在饲喂HFD的n＝56只小鼠的群体中身体增重的变异性。(A)实验设计。(B)7天和60天HFD饲喂后小鼠的体重分布。(C)在每个时间点鉴定对肥胖非响应者(NR)和强响应者(SR)小鼠。在2个时间点或在实验的整个过程中观察若干NR和SR小鼠。(D)在饮食前(t0)、HFD饲养的7天后(t1)和60天后(t2)，对照(n＝24),NR(n＝30),和SR(n＝29)小鼠的体重监控。s(n＝平均±标准误，非参数Mann和Whitney检验的p值*<0.05,**<0.001,***<0.0001.)

图2：饮食转换后7天和60天，C57BL/6HFD饲喂的或LFD饲喂的小鼠的¹H NMR尿代谢谱。(A)来自LFD饲喂的小鼠或(B)HFD饲喂的小鼠的尿的平均¹H NMR光谱。(C)7天时LFD和HFD饲喂的小鼠的尿代谢谱的OPLS-DA分数图。(D)60天时LFD和HFD饲喂的小鼠的尿代谢谱的OPLS-DA分数图。(E)从OPLS-DA系数图获得的热点图显示发现在HFD和LFD饲喂的小鼠中显著不同的代谢物。通过颜色代码展示代谢物的相关值。(红色梯度：与HFD饲喂的小鼠正相关的代谢物和蓝色梯度：负相关的代谢物)。

图3：NR和SR小鼠的具体代谢标志。(A)来自NR小鼠或(B)SR小鼠的尿的¹H NMR光谱平均值。(C)7天时和(D)60天时NR和SR小鼠的尿代谢谱的OPLS-DA分数图。(E)从OPLS-DA系数图获得的热点图显示发现在NR和SR小鼠中显著不同的代谢物。通过颜色代码展示代谢物的相关值。(红色梯度：与SR小鼠正相关的代谢物和蓝色梯度：负相关的代谢物)。

图4a和b：BCAA、丁酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸代谢、Krebs循环和β氧化中涉及的代谢物的尿排泄型的作图。条状图显示代谢物的带有标准误的平均比率在第7天至第0天或第60天至第0天的积分。Y轴提示LF、HF、NR和SR小鼠的平均值(任意单位)。LF和HF或NR和SR的平均比率之间的显著差异使用非参数Mann Whitney检验计算：*<0.05,**<0.001,***<0.0001(平均值，标准误和p值在补充表3和4中)。用虚线箭头突出间接代谢反应。

图5显示在预测NR和SR中代谢物重要性和稳健性，如通过随机森林分析所评估的。

表1：在高脂肪诱导的增重中代谢物和增重之间的关系的总结

表2:在抵抗增重(NR)和倾向增重(SR)个体中选择的代谢物随时间的变化倍数的总结

本发明部分地涉及生物标志物，其中生物标志物是三甲基胺-N-氧化物。

在本文描述的实验中，用HFD饲喂的小鼠展示出尿中三甲基胺-N-氧化物随时间增加。不希望被任何理论束缚，发明人目前认为HFD小鼠的尿中若干Krebs循环中间物和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸途径的终产物的增加可以被认为是线粒体中能量过量产生的证据。认为线粒体氧化性途径的长期增加对于线粒体是有害的，导致氧化途径和能量代谢的损害。此外，过量的游离脂肪酸可以作为甘油三酯存贮在脂肪组织以及瘦组织中，这可以促进器官功能障碍和代谢疾病诸如肝性脂肪变性或心血管疾病。

发明人已经发现三甲基胺-N-氧化物可以用作体液中的生物标志物用于检测和/或定量抵抗高脂肪饮食诱导的增重的可能性。体液可以为尿。使用尿作为体液具有这样的优势即其可以规律地、非侵入性地并且在没有医务人员的支持下获得。

在人或动物体外实施该诊断方法。通常，在先前获自待测试的受试者的体液样品中进行生物标志物检测和/或定量步骤。

尽管本发明在定量抵抗高脂肪饮食诱导的增重的可能性的角度中进行描述，本领域技术人员应清楚相同的方法也可用于定量对高脂肪饮食诱导的增重敏感的可能性。本领域技术人员理解如果生物标志物的增加的水平提示抵抗高脂肪饮食诱导的增重的增加的可能性，生物标志物的降低的水平提示对高脂肪饮食诱导的增重敏感的可能性增加，并且反之亦然。

因此本发明也涉及三甲基胺-N-氧化物作为尿中用于检测和/或定量对高脂肪饮食诱导的增重敏感的可能性的生物标志物的用途。

本发明也涉及诊断受试者抵抗高脂肪饮食诱导的增重的可能性的方法，所述方法包括测定先前从待测试的受试者获得的尿样品中三甲基胺-N-氧化物的水平，和比较受试者的三甲基胺-N-氧化物水平与预测定的参照值，其中预测定的参照值是基于对照群体中尿中的平均三甲基胺-N-氧化物水平，并且其中较之预测定的参照值样品中降低的三甲基胺-N-氧化物水平提示抵抗高脂肪饮食诱导的增重的增加的可能性。

本发明也涉及诊断受试者对高脂肪饮食诱导的增重敏感的可能性的方法，所述方法包括测定先前从待测试的受试者获得尿样品中三甲基胺-N-氧化物的水平，和比较受试者的三甲基胺-N-氧化物水平与预测定的参照值，其中预测定的参照值是基于对照群体中尿中的平均三甲基胺-N-氧化物水平，并且其中较之预测定的参照值样品中降低的三甲基胺-N-氧化物水平提示对高脂肪饮食诱导的增重的敏感性增加的可能性。

使用尿作为样品具有这样的优势，即其可以使用良好建立的方法非侵入性地获得。然后在身体外进行实际的诊断方法。

可以通过本领域中已知的任何工具检测并定量样品中三甲基胺-N-氧化物的水平。例如，可以使用¹H-NMR、质谱，例如，UPLC-ESI-MS/MS。也可以使用其他方法，诸如其他光谱方法、色谱方法、标记技术、或定量化学方法。理想地，通过相同的方法测定样品中的三甲基胺-N-氧化物水平和参照值。

预测定的参照值可以基于对照群体中测试的体液中的平均三甲基胺-N-氧化物水平。对照群体可以是具有相似遗传背景、年龄和平均健康状态的至少3个，优选至少10个，更优选至少50个人的组。

本发明允许，例如，在早期，在其增重可导致健康风险之前，对受试者分层。通过知晓是否易受高脂肪饮食诱导的增重的影响，可以在早期相应地调整生活方式和饮食。适当的生活方式，理想地伴有个人化的营养方案，允许维持健康的体格并且避免必须在热量限制和/或运动方案方面做出显著努力以重新获得该健康体格。

尽管三甲基胺-N-氧化物作为唯一的标志物是本发明的诊断方法的有效的工具，如果诊断依赖于多于仅仅一种标志物，所述诊断的品质和/或预测性力量将被改善。

因此可以与三甲基胺-N-氧化物组合使用一种或多种其他标志物，所述一种或多种其他标志物用于诊断抵抗高脂肪饮食诱导的增重的增加的可能性和/或用于诊断对高脂肪饮食诱导的增重敏感的增加的可能性。

发明人惊讶的看到也可以使用其他生物标志物以检测抵抗高脂肪饮食诱导的增重的增加的可能性和/或用于诊断对高脂肪饮食诱导的增重敏感的增加的可能性。

如此发明人已经鉴定了己酰甘氨酸、异戊酰甘氨酸、亮氨酸、异丁酸盐、乙酸盐的增加的尿浓度，和胍基乙酸盐、蔗糖、酒石酸、马尿酸和羟苯基乙酰甘氨酸的降低的浓度允许诊断抵抗高脂肪饮食诱导的增重的增加的可能性。

因此，本发明的方法还可包括以下步骤：测定尿样品中选自己酰甘氨酸、异戊酰甘氨酸、亮氨酸、异丁酸盐、乙酸盐、胍基乙酸盐、蔗糖、酒石酸、马尿酸和羟苯基乙酰甘氨酸的至少一种其他生物标志物的水平，并且比较受试者的至少一种其他生物标志物的水平与预测定的参照值，其中预测定的参照值基于正常健康对照群体的尿样品中的该至少一种其他生物标志物的平均水平，并且其中尿样品中较之预测定的参照值的增加的己酰甘氨酸、异戊酰甘氨酸、亮氨酸、异丁酸盐、乙酸盐和/或降低的胍基乙酸盐、蔗糖、酒石酸、马尿酸和/或羟苯基乙酰甘氨酸水平提示抵抗高脂肪饮食诱导的增重的增加的可能性。因此，尿样品中较之预测定的参照值的降低的己酰甘氨酸、异戊酰甘氨酸、亮氨酸、异丁酸盐、乙酸盐，和/或增加的胍基乙酸盐、蔗糖、酒石酸、马尿酸和/或羟苯基乙酰甘氨酸水平提示对高脂肪饮食诱导的增重敏感的增加的可能性。

也可以通过¹H-NMR或质谱，例如，UPLC-ESI-MS/MS检测和定量其他生物标志物。也可以使用其他方法，诸如其他光谱方法、色谱方法、标记技术、或定量化学方法。

理想地，通过相同的技术评价全部所评价的生物标志物。它们可以同时评价。

本发明的方法可包括评价至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、或至少7种生物标志物。

例如，三甲基胺-N-氧化物可以与三甲胺-N-氧化物共同评价。

三甲基胺-N-氧化物也可以与异戊酰甘氨酸共同评价。

三甲基胺-N-氧化物也可以与亮氨酸共同评价。

三甲基胺-N-氧化物也可以与乙酸盐共同评价。

三甲基胺-N-氧化物也可以与三甲胺-N-氧化物和异戊酰甘氨酸共同评价。

三甲基胺-N-氧化物也可以与三甲胺-N-氧化物、异戊酰甘氨酸、和亮氨酸共同评价。

三甲基胺-N-氧化物也可以与三甲胺-N-氧化物、异戊酰甘氨酸、和乙酸盐共同评价。

三甲基胺-N-氧化物也可以与三甲胺-N-氧化物、异戊酰甘氨酸、乙酸盐、和亮氨酸共同评价。

三甲基胺-N-氧化物也可以与三甲胺-N-氧化物、异戊酰甘氨酸、乙酸盐、亮氨酸、和胍基乙酸盐共同评价。

三甲基胺-N-氧化物也可以与己酰甘氨酸、异戊酰甘氨酸、乙酸盐、亮氨酸、胍基乙酸盐和马尿酸共同评价。

评价多于一种生物标志物的优势在于评价越多的生物标志物，诊断将变得越可靠。如果，例如，多于1、2、3、4、5、6或7种生物标志物表现出如上所述的浓度上升或降低，则检测和/或定量抵抗和/或对高脂肪饮食诱导的增重敏感的可能性的预测性力量越强。

优选地使用用于表征获自测试对象的三甲基胺-N-氧化物和任选地其他生物标志物的水平的相同的单位测量三甲基胺-N-氧化物和任选地其他生物标志物的参照值。因此，如果三甲基胺-N-氧化物和任选地其他生物标志物的水平是绝对值诸如以μmol/l(μM)计的三甲基胺-N-氧化物单位，在受试者的一般群体或选择的对照群体的个体中的参照值也基于以μmol/l(μM)计的三甲基胺-N-氧化物单位。

此外，参照值可以是单个截断值，诸如中位数或平均数。在获得的体液样品中三甲基胺-N-氧化物和任选地其他生物标志物的参照值，诸如平均水平，中位数水平，或“截断”水平，可以通过测定一般群体或选择的群体中的个体的大量样品并使用统计学模型诸如预测值方法来建立，所述预测值方法用于选择阳性标准或定义最优特异性(最高真阴性率)和灵敏性(最高真阳性率)的接受者工作特征曲线，如Knapp,R.G.,和Miller,M.C.(1992).Clinical Epidemiology and Biostatistics.William and Wilkins,Harual Publishing Co.Malvern,Pa.中所述，其通过引用并入本文。

本领域技术人员将知道如何赋予正确的参照值因其随例如，性别、种族、基因遗传、健康状态或年龄而变化。

在本发明的方法中，抵抗高脂肪饮食诱导的增重的降低的可能性提示发展出与超重和/或肥胖相关的病症的可能性。

“超重”定义为成年人具有25和30之间的BMI。“身体重量指数”或“BMI”意为以kg计的重量除以以米计算的身高的平方的比率。“肥胖”是这样的病况，其中存贮于动物，特别是人和其他哺乳动物中的脂肪组织中的天然能量储备增加至与某些健康病况或增加的死亡率相关联的点。“肥胖的”定义为成年人具有大于30的BMI。

与超重和/或肥胖相关联的病症可以是心脏代谢疾病和/或代谢去调控。

本发明的方法允许其例如测定受试者对饮食诱导的增重的易感性程度。因此本方法可以允许根据患者基于高热量-特别是高脂肪-饮食而增重的可能性对患者分层，独立于其是否目前重量不足、正常、超重或肥胖。成年人如果具有等于或低于18.5的BMI，那么被认为是重量不足的。

本发明的方法也可以在重量不足、正常、超重或肥胖受试者中实施。特别地在重量不足、超重或在肥胖受试者中，本发明的方法可以帮助揭示受试者的遗传倾向。基于其上-并且理想地进一步考虑其一般健康状态和生活方式-可以开发个人化的营养方案，其可以帮助维持或重新获得健康状态。

本发明的方法不限于人。其也可以在动物中使用，诸如伴侣动物。可以分析伴侣动物，诸如猫或狗。基于其上可以设计营养方案，其将有助于伴侣动物健康长寿。

本申请中呈现的研究提供了涉及HF(高脂肪)诱导的肥胖发展的生理机制的认知并特别地突出了与肥胖表型变异性相关联的具体代谢适应。高脂肪摄取引起了线粒体代谢途径的快速和一致的上调，导致更多能量生产和增加的线粒体脂肪酸饱和。在HF饲喂的小鼠中，鉴定了抵抗肥胖的(NR)小鼠，其特别地激活特异性的线粒体代谢途径(β氧化、丁酸代谢和亮氨酸分解代谢)并且似乎维持能量内稳态(与LFD比较的Krebs循环活性)。发明人的结果因此提示线粒体氧化性途径的特异性激活可能使得能够保持能量内稳态并且保护线粒体免受燃料过载。因此，线粒体在肥胖及其相关的代谢病症的发展中的作用似乎是关键的。因此，对构成对HFD饲喂的异质性适应的基础的机制的此全面的分析提供了用于重量管理计划和个人化的营养解决方案的新的和有希望的前景。

因此，如果本发明的方法允许鉴定抵抗高脂肪饮食诱导的增重的降低的可能性-或易受高脂肪饮食诱导的增重的增加的可能性-这可以提示缺少线粒体氧化性途径的特异性激活。

相反地，如果本发明的方法允许鉴定抵抗高脂肪饮食诱导的增重的增加的可能性-或对高脂肪饮食诱导的增重敏感的降低的可能性-这可以提示线粒体氧化性途径的特异性激活。

线粒体氧化性途径可以选自β氧化、丁酸代谢和亮氨酸分解代谢。

由于本发明的方法允许对受试者分层而无需具有素因的症状可见，其对于例如儿童、青少年、年轻人和/或处于发展出超重或肥胖的受试者是适合的。

通过觉察，此类风险可以在饮食和生活方式方面适当地应对并且可以消除在以后的生活中源自超重或肥胖的可能的风险。

因此，本方法可用于为具体的受试者的组设计分层的饮食或为具体的受试者设计个人化的饮食。

本领域技术人员将理解他们可以自由地组合本文公开的本发明的全部特征。特别地，对于本发明的用途所描述的特征可与本发明的方法组合并且反之亦然。此外，可以组合对于本发明的不同实施方案所描述的特征。

尽管本发明已经通过实例的方式进行描述，应当理解可以进行变型和修饰而不背离如权利要求书中所定义的本发明的范围。

此外，当存在具体特征的已知的等价物时，如同在本说明书中具体引用的那样并入此类等价物。本发明的其他优势和特征从附图和非限制性实施例中是显而易见的。

实施例：

动物处理程序和样品制备：

在雀巢研究中心(NRC,瑞士)在适当的国家指南下进行实验。在单独的笼中在12h-12h的光照-黑暗方案下维持并在整个实验过程中随意饲喂小鼠。总计80只C57BL/6小鼠首先接受标准CHD(基线3437,)为时若干周并且在此处理后(t0)进行尿的第一次收集。然后将小鼠分为2组：24只小鼠用不同CHD(低脂肪D12450B，组成参见补充附图)饲喂，其中蛋白质、微生物、矿物质和碳水化合物的比率不同于第一种标准饮食。另56只小鼠用HFD饲喂(高脂肪D12492)，其中饮食组成除了碳水化合物和脂肪的水平以外，能够与第二组CHD相当。这两组分别表征为对照组和DIO组。再一次，在饮食更换7天(t1)和60天(t2)后收集尿样品。将全部样品速冻于-80C直到分析。也在t0、t1、t2对全部小鼠称重以监控HFD和对照组中的增重。HFD和LFD以及NR和SR在增重中的差异通过非参数检验(Wilcoxon-Mann-Whitney U检验)评估。也在t1和t2记录每只小鼠的食品摄入(FI)。HFD饲喂的小鼠的FI较之LFD饲喂的小鼠随时间显著降低。SR小鼠也在两个时间点均具有比NR小鼠更高的FI。通过Wilcoxon-Mann-Whitney U检验计算组间FI的差异。

¹H NMR光谱

将40μl体积的尿在含有叠氮化钠(3mM)和TSP(0.5mM)的20μl缓冲溶液(NaHPO₄,0.6M pH＝7)中稀释。在离心后，通过使用针头将样品转移在1.7mm直径NMR管中。然后通过实施具有64k数据点的标准序列的64次扫描，在600.13MHz分光仪上记录¹H NMR光谱。将NMR实验的温度维持在300K。通过使用软件TOPSPIN 2.0(Bruker Biospin,Rheinstetten,德国)进行尿光谱的处理。对于每个光谱，在通过傅里叶变换仪转化为光谱前，通过对应于1Hz的线增宽的指数函数对FID增倍。然后手动校正光谱相位和基线。通过在δ0使用TSP信号校准化学位移。通过使用STOCSY(Statistical TOtal Correlation SpectroscopY)，光谱数据库和公开的分配实现光谱分配。

数据处理和多变量数据分析：

光谱数据(从δ0.2至δ9.5)最终输入Matlab软件(版本,the mathworksInc,Natwick MA)并转化为22K数据点。从每个光谱移出水共振峰(δ4.7-5.05)以消除与水共振预饱和相关联的变异性。然后在总面积上归一化¹H NMR光谱并且通过使用“单位方差”缩放应用不同的多变量统计学(PCA、OPLS、和OPLS-DA)。使用回复缩放(back-scaling)方法可以展示OPLS回归系数。以此方式，我们可以估计负责模型中的组差别的每个NMR变量的方差的比例。构建显示具有最高系数值的代谢物的热图提供了对于HFD饲喂的短程和长程代谢应答的简单比较。通过取得辨别HFD/LFD或SR/NR的代谢物的相关系数的值生成热图。通过颜色图展示高于0.3的截断值的相关系数(根据每种代谢物中的协方差值梯度从红色到蓝色)。因此热图提供了对于肥胖发展的短程和长程代谢应答的简单比较。

单变量数据分析

对可在尿1H NMR光谱上分配的来自β氧化、BCAA氧化、Krebs循环和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸途径的中间代谢物进行积分以评估在LFD、HFD、NR和SR组中在饮食更换7天和60天后这些代谢物的尿排泄。对于每种代谢物，用7天和60天处的积分除以第0天(在预干预时期过程中)的积分以根据基线归一化这些代谢物的尿排泄。使用非参数Mann和Whitney检验在每个时间点在LFD、HFD、NR和SR组之间比较每种代谢物获得的比例。

主要发现和亮点：

饲喂HFD的C57BL/6J小鼠中的增重变异性。

为了研究饮食对肥胖发展的贡献，在1周的预干预期期间用饲料(CHD)饲喂60C57BL/6J小鼠，之后进行饮食转换其中用LFD(n＝20)或HFD(n＝40)饲喂小鼠60天。在预干预期期间和饮食更换后7和60天测量体重(图1.A)。重量监控显示整个实验中HFD饲喂的小鼠中较之LFD饲喂的小鼠的显著重量增加。特别地，HFD饲喂小鼠的平均重量比对照小鼠在7天时高1.5g(p＝3.9x10^-7)并且在60天时高4.5g(p＝2.36x10^-8)。重量分布也揭示了7天时HFD组间的强异质性(变异系数CV＝0.05)，这在60天时甚至更值得注意(CV＝0.120)(图1.B)。此观察突出了HFD组中的强表型变异性的存在并且提示与这些肥胖亚表型相关联的具体代谢标志的存在。

为了表征对HF饲喂的“强响应者(SR)”和“非响应者(NR)”，我们根据HF饲喂7天和60天后的身体增重(BWG)对小鼠群体分层。一贯地在BWG分布的前三分之一和后三分之一的小鼠分别命名为NR和SR小鼠，例外是在60天时3只SR小鼠在BWG分布的前一半。选择该阈值以在每个组中获得足够的样品(NR小鼠n＝10SR小鼠＝14)并进行有力的统计学检验以及鉴定这两个组之间的代谢标志中的显著差异。NR、SR和LF饲喂的小鼠随时间的平均重量轨迹(图1.D)揭示了在实验过程中SR小鼠比NR小鼠和LF饲喂的小鼠获得了显著更多的重量。令人感兴趣的是，在7天时NR组和LFD组之间体重没有显著差异(p＝0.10)，但我们鉴定了60天时体重中的显著差异(p＝7.67x10^-5)。此外，NR小鼠的身体增重轨迹(回归系数＝3.85)与LF饲喂的小鼠相似，突出了随时间NR小鼠的增重行为与LF小鼠是相当的，而SR小鼠倾向于更快地积累重量。身体增重轨迹的此早期和持续的偏转，定义了强响应者和非响应者的亚组，提示在C57BL/6J小鼠中存在对饮食诱导的肥胖(DIO)的差异的素因。因此，我们将在此研究中测试基于早期代谢谱预测HFD饲喂的小鼠中增重轨迹的能力。

尿代谢制谱指出与高脂肪诱导的肥胖相关联的持续的代谢标志

为了研究与饮食诱导的肥胖发展相关联的具体代谢标志，我们使用¹HNMR光谱在饮食介入1周前，7和60天后获得尿代谢谱(图2.A,2.B)。然后通过使用OPLS-DA模型在每个时间点比较LF和HF饲喂的小鼠的尿代谢谱。通过使用一个预测性和若干个正交组分计算每个模型。通过R²Y和Q²Y拟合优度统计学测定正交组分的最优数。7天时(图2.C)和60天时(图2.D)模型的OPLS-DA分数图显示沿着预测性组分(Tpred)突出了与HF饲喂相关联的强代谢变异同时说明第一正交组分(Torth)的第二轴反映了组内与不依赖于饮食的作用相关联的变异性。

对于每种模型，鉴定并在热图(图2.E)中总结了具有最高相关系数的代谢物，所述热图提示LF和HF小鼠之间的尿代谢变异。具体而言，在7天和60天时HF组中，肉碱、己酰甘氨酸，和BCAA氧化的中间物(异戊酰甘氨酸,α-酮-β甲基戊酸和α-酮-戊酸)的水平显著增加。相反地，在整个实验过程中HF组中从微生物胆碱代谢产生的甲胺衍生物(三甲胺(TMA)，和三甲胺-N-氧化物(TMAO))以及通过肠道细菌对苯胺降解的终产物(苯乙酰甘氨酸)的水平降低。特别地，在7天和60天之间TMAO的尿水平中的变异程度提示了在HFD饲喂下TMA至TMAO的转化的时间依赖性移动。因此，HFD治疗可暗示肠道微生物群活性的显著改变。对HFD饲喂的时间依赖性代谢适应也由饲喂HF 7天的小鼠的尿中硫酸吲哚酚的显著降低表征。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)途径的终产物(N1-甲基-2-吡啶酮-5-甲酰胺:2PY和N1-甲基-4-吡啶酮-3-甲酰胺:4PY)也与饲喂HF 60天的小鼠正相关。HFD饲喂的组中异戊酰甘氨酸、α-酮-β-甲基戊酸和α-酮异戊酸的排泄较之LFD饲喂的组中随时间显著并一致地增加，因而其构成了DIO的定性和稳定的候选生物标志物。

NR和SR小鼠的尿代谢制谱突出了与肥胖倾向和抵抗肥胖表型相关联的具体代谢适应

SR和NR小鼠的代谢谱的建立使得能够鉴定与增重中最高趋异相关联的代谢物。使用配对OPLS-DA模型在7天和60天时进行NR和SR之间的¹H NMR光谱数据的比较(图3.A,3.B)。在7天(图3.C)，和60天(图3.D)时OPLS-DA分数图展示了沿预测性组分(Tpred)NR和SR小鼠之间良好的辨别。第二轴说明了对强肥胖相关联的应答的正交变异。令人感兴趣的是，在饮食更换前没有鉴定出NR和SR小鼠的尿代谢谱中的差异，这突出了当用饲料饲养时C57BL/6J小鼠全部具有相似的表型和代谢型。

总结了参与组分离的代谢物的热图(图3.E)展示了在HF饲喂的短程期间(7天)和长程期间(60天)与NR和SR小鼠相关联的差异代谢谱。特别地，涉及亮氨酸分解代谢、β氧化和短链脂肪酸生产的具体代谢标志与肥胖的分级相关联。事实上，在整个实验过程中己酰甘氨酸、异戊酰甘氨酸、亮氨酸、乙酸盐和异丁酸盐与SR小鼠负相关。由于这些标志物在SR小鼠中一致下调，它们构成了抵抗肥胖表型的稳定的候选标志物。7天和60天时SR和NR小鼠之间的代谢谱的比较也显示与表型变异性相关联的时间依赖性代谢标志。在HFD 7天后在SR小鼠中观察到了较低的乙酸盐的尿排泄。相比较而言，在相同的时间在SR小鼠中注意到了较高的蔗糖的尿排泄。令人惊讶地，牛磺酸在HF饲喂7天后与SR小鼠正相关并在60天后与SR小鼠负相关。HFD 60天后SR小鼠的尿代谢谱的特征也为肌酸、胍基乙酸盐、酒石酸盐、马尿酸盐，和羟苯基乙酰甘氨酸的增加。令人感兴趣的是，表征为DIO的定性候选标志物的三甲基胺-N-氧化物和异戊酰甘氨酸，也被鉴定为是抵抗肥胖表型的稳定的候选标志物。这些结果指出在线粒体中发生的亮氨酸分解代谢和β氧化受HF饲喂的强烈影响并且其特异性调控可能贡献于肥胖的发作。

若干种代谢物的尿排泄图式指出HF小鼠和SR小鼠中线粒体代谢的特定去调控

在补充的单变量数据分析方法(参见方法)的帮助下进一步研究HFD饲喂的小鼠中线粒体代谢的调控。β氧化中间体：己酰甘氨酸、肉碱和酰基肉碱的尿排泄在HF饲喂的小鼠的尿中较之LF饲喂的小鼠一致地增加，这提示线粒体中脂肪酸溢流的增加和β氧化的激活。在HFD饲喂后烟酰胺腺嘌呤二核苷酸途径的终产物(2PY,4PY)也在小鼠尿中不断增加，这提示β氧化和过氧化物酶体增殖子的上调。积分确认了亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸以及BCAA分解代谢的中间物(异戊酰甘氨酸,α-酮-β甲基戊酸和α-酮戊酸)在HF饲喂的小鼠中显著并一致地增加，支持了HFD相关联的BCAA分解代谢的上调的假设。Krebs循环也在HF饲喂的小鼠中部分地受调节，因为HF饲喂的小鼠的尿中与LF饲喂的小鼠相比恒定升高，我们观察到了在HFD 7天后在小鼠中琥珀酸盐的短期尿增加。这些结果支持了假设，即缬氨酸和异亮氨酸分解代谢上调，诱导形成琥珀酰-CoA和产生以下Krebs循环中间物。令人惊讶地，其他Krebs循环中间物(柠檬酸盐、顺乌头酸酶、α-酮戊二酸)在LF和HF饲喂的小鼠中并非显著不同，提示亮氨酸分解代谢和β氧化生产乙酰-CoA，和Krebs循环之间断开。具体的代谢调控能够使乙酰-CoA的流量朝着其他代谢途径转向。特别地，HF饲喂的小鼠的尿中增加的乙烯乙酰甘氨酸水平提示乙酰-CoA能够朝向乙酰乙酰-CoA再定向，所述乙酰乙酰-CoA与丁酸代谢和乙烯乙酰甘氨酸的形成相联系。这些结果确认了HFD诱导线粒体氧化性途径和Krebs循环的上调，这可能导致能量生产的增加。

单变量数据分析也使我们能够更好地理解在表型变异性的背景下β氧化、BCAA分解代谢和Krebs循环之间的关联。BCAA分解代谢中间物的积分显示NR小鼠的尿中仅异戊酰甘氨酸较之SR小鼠或LF小鼠显著更高，提示抵抗肥胖的小鼠仅与亮氨酸分解代谢的破坏相关联。在整个实验过程中NR小鼠的尿中己酰甘氨酸较之SR小鼠显著更高，然而肉碱和酰基肉碱的尿排泄保持不变。因此，尽管β氧化在NR小鼠中似乎受影响，朝向线粒体的脂肪酸流动在NR和SR小鼠之间是一致的。此外，我们观察到了NR小鼠的尿中乙烯乙酰甘氨酸的显著增加，提示乙酰-CoA重新定向朝向丁酸代谢。令人感兴趣的是，在HFD 7天后，未观察到NR和SR小鼠之间Krebs循环活性的差异。在60天时，在SR小鼠的尿中琥珀酸盐显著更高，突出了Krebs循环的上调。如先前观察到的，其他Krebs循环中间物(柠檬酸盐、α-酮戊二酸、顺乌头酸)的尿排泄在NR和SR小鼠之间未改变，支持了Krebs循环中的特异性调控的假说。我们的结果提示在长时程HFD后，倾向肥胖的小鼠与能量代谢的损害相关联，所述损害特征在于Krebs循环的去调控。在抵抗肥胖的小鼠中β氧化、亮氨酸分解代谢和丁酸代谢的快速激活可能是针对脂肪酸溢流的保护机制，其使得能够维持能量内稳态。

使用代谢物尿浓度(如通过¹H NMR光谱所测量的)，从基线(T0)的改变倍数，和与尿肌酸的比例(如通过¹H NMR光谱所测量的)，评价突出的代谢物与增重的关系。强调基于对饮食挑战的短期代谢应答预测增重和将个体分层为NR或SR的能力(即T7时)。在表1中总结了相关系数值，同时在表2中报道了改变倍数。为了选择更稳健的标志物，使用“袋外”数据的％平均准确性降低作为可变的重要特征。以这种方式，能够测定根据其增重易感性(NR和SR表型，图5)更好地辨别受试者的变量，提示己酰甘氨酸、异戊酰基甘氨酸、TMAO和乙酸盐是用于将受试者分层为NR或SR表型的最稳健的代谢标志物。