免疫抑制细胞及其制造和使用方法

摘要

本发明涉及一种免疫抑制细胞及其制造和使用方法。所述免疫抑制细胞通过将一前驱细胞培养于含有GRO趋化激素之培养基中而得到。

说明书

【相关申请】

本申请要求申请日为2012年6月4日的美国临时申请 No.61/655,191的优先权，该申请的全部内容以引用方式全部合并于此。

【先前技术】

髓源性抑制细胞(MDSCs)是一群包含有早期髓系前驱细胞 /粒细胞异质群体、巨噬细胞和树突状细胞等异细胞亚群的集合体。这些细胞 通常由髓系标记Gr-1和CD11b表现其特征。髓源性抑制细胞由于可藉由增加 免疫抑制因子，例如精氨酸酶1(ARG-1)和一氧化氮合酶2(NOS2)之表 现来抑制T细胞效应之功能，而在肿瘤免疫逃逸机制、自体免疫疾病、移植 排斥反应，慢性炎症及感染等方面扮演重要角色。参见(例如)，Gabrilovich与 Nagaraj,Nat Rev Immunol 9:162-174(2009)。

由于髓源性抑制细胞所具有之免疫抑制特性，而使其能做为 治疗免疫性疾病的候选药物。因此，亟需一种藉由得自活体培养方式产生之 稳定且安全的髓源性抑制细胞。

【发明内容】

本发明基于此发现，生长调节致癌基因(GRO)趋化激素， 尤其是GRO-γ，对于人类周边血单核细胞衍生的树突状细胞(MDDCs)之分 化及功能具有抑制作用。此外，发现GRO-γ可驱动MDDCs分化成为一种类 似髓源性抑制细胞(MDSC)的表现型。

因此，本发明所描述系关于一种获得免疫抑制细胞的方法。 该方法包括：获得一种能分化成树突状细胞之前驱细胞；及将该前驱细胞培 养于含有一趋化激素之培养基中一段足够使该前驱细胞分化为树突状细胞的 时间，其中该树突状细胞系呈现一种免疫抑制表型，而藉此获得该免疫抑制 细胞。所述之趋化激素可为一种GRO趋化激素，例如，GRO-γ或GRO-α。

另一方面，本发明包含一种藉由上述方法得到之免疫抑制细 胞，及含有该细胞的组成物。

本发明亦描述一种使用上述细胞或细胞组成物治疗个体中 各种病况之方法。例如，本发明之细胞或细胞组成物可用于有需要之个体中 抑制免疫反应，调节与肿瘤发生相关之血管新生，治疗自身免疫疾病，治疗 发炎性疾病，或治疗移植物对抗宿主疾病(GVHD)。

【图式简单说明】

图1表示间叶系干细胞(MSC)-条件培养基对于MDDC分 化产生了抑制效果。将纯化来自人类PBMCS的CD14⁺单核细胞培养在有或无 MSC-条件培养基(MSC-CM)(1/2X体积)存在下培养于DC-分化培养基中。 于第5天iDC再经无或以LPS(1mg/mL)处理(mDC)两天。于第7天分 析MDDCs的表型和功能。(A)针对与DC成熟相关之表面标记进行染色， 并以流式细胞仪分析，测定10,000个细胞的平均荧光强度(MFI)。(B)未成 熟之MDDCs以荧光标记葡聚糖试剂(1mg/mL)于37℃下施予脉冲30分钟， 并藉由以流式细胞仪测量之FITC-葡聚醣摄取量分析其内吞能力。所显示于 FITC-葡聚醣摄入后之FACS图谱为：无FTIC-葡聚醣存在下的MDDCs作为 阴性对照组(NC，灰线)，iMDDCs(iDC，虚线)，及有MSC-CM存在下之 iMDDCs具(iDC+MSC-CM，黑色实线)。数据为于2位供者进行之三次独立 实验的代表性结果。(C)成熟MDDCs与同种异体之T细胞共培养4天(DC： T＝1:10)，并于以1μCi/孔之[³H]-胸苷施予脉冲16小时后测量定与胸苷的并 入量。藉由于三名供者各重复三次所测得之[³H]-胸苷并入量来测定T细胞增 生。数据以相对于无MSC-CM补充组之倍数(MFI±SD)，或以[³H]-胸苷摄取 量之CPM(平均值±SD)表示。数据代表三次独立实验之结果。(n＝3位供 者，每次实验)。*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.0001。

图2表示MSC-CM对MDDCs的抑制效果可藉由将抗-GRO-γ 中和抗体加入MSC-CM而产生逆转。(A)使用市售之人类细胞激素/趋化激 素抗体数组(RayBio)比较得自MSC条件培养基(MSC-CM)与含血清培养 基对照组的细胞激素图谱。培养基中所含细胞激素和趋化激素的量，系藉由 将所述之数组膜先与对抗特定细胞激素或趋化激素之生物素标记的抗体，之 后再与HRP-共轭的卵白素进行培养，然后将其以X-射线底片曝光而测定得。 实验重复2次。(B)以流式细胞仪分析GRO趋化激素及IL-8对于未成熟 MDDCs上之CD40之表现的影响。将人类CD14⁺单核细胞于IL-4(80ng/mL) 和GM-CSF(80ng/mL)存在下，在含有10％人类AB⁺血清之α-MEM培养基 中进行分化。于第7天，将CD14⁺单核细胞、单独之未成熟MDDCs或补充以 GRO-α、GRO-β、GRO-γ或IL-8之未成熟MDDCs进行针对CD40表现之染 色，并以流式细胞仪分析。灰线对应未染色的对照组。所示数据为对应所指 定趋化激素之CD40阳性细胞的百分比。实验结果来自三个独立实验。(C) 以抗-GRO-γ(10μg/mL)抗体或同种型匹配的对照抗体于37℃下培养60分钟， 将MSC-CM中的GRO-γ活性中和，之后放置于4℃下隔夜。将MDDCs在 有或不含MSC-CM(1/2X体积)之DC分化培养基中，于有或无中和性抗 -GRO-γ抗体存在下进行分化。利用流式细胞仪进行MDDCs表型分析，结果 以平均荧光强度相对于未经处理之iDC(MFI±SD)所获得数值的倍数表示。 结果来自两个实验，每组包括两名供者。*：p<0.05；**：p<0.01。

图3显示GRO-γ抑制MDDCs的分化。纯化自人类PBMCs 之CD14⁺单核细胞于有或无重组GRO-γ(250ng/mL)存在下，经过或未经 CXCR2受体竞争型拮抗剂SB225002(250nm)预处理30分钟的条件下进行 分化。于第7天，分析MDDCs的表型和功能。(A)经过表面标记标定后， 使用流式细胞仪进行MDDCs的表型分析。条形图代表相对于未经处理之 iDCS所获得之MFI的MFI倍数(MFI±SD之倍数)。数据相当于三个独立实 验之平均值，其中每个实验包括两至三名供者。(B)在37℃下，将未成熟之 MDDCs以FITC-葡聚醣(1mg/mL)施予脉冲30分钟，并以流式细胞仪测定 其摄取情形。数据系来自五个不同实验，且以相对于iDC组之MFI±SD的倍 数表示。n＝2-3。(C)将成熟MDDCs与同种异体T细胞(DC：T＝1:10)共 培养4天，并于以1μCi/孔之[³H]-胸苷施予16小时-脉冲后胸苷与测定胸苷 并入量。以[³H]-胸苷并入量来测定T细胞增生。数据以相对于未经处理之 MMDCs之CPM(平均值±SD)的倍数表示，且数据系来自五个独立的实验。 n＝2-3。*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.0001。

图4显示于GRO-γ存在下分化的MDDCs具有细胞激素耐受 性。将纯化自人类PBMCs之CD14⁺单核细胞于有或无重组GRO-γ(250ng/mL) 存在下，经过或未经CXCR2受体竞争型拮抗剂SB225002(250nm)预处理 30分钟的条件下进行分化。(A)以实时RT-PCR测定培养7天之MDDCs的 mRNA表现。将Ct值以GAPDH基因之表现量为基准归一化。以2-^△Ct法计算 差异值，且数据以相对于未经处理之DC所获得之值的百分比表示。结果代表 得自五个独立的实验重复三次的平均值±标准偏差。*：p<0.05；**：p<0.01； ***：p<0.0001。(B)培养液中的细胞激素含量以ELISA进行测定。数据系 以相对于未经处理DC所获得之值(平均值±SD)的细胞激素浓度倍数。n＝2-3。 数据来自至少三个独立的实验。*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.0001。 (C)将进行分化5天之未成熟MDDCs固定于载玻片上，并以0.1％(v/v) NP-40/PBS使其具有可通透性。藉由将MDDCs以小鼠抗-人类IDO抗体 (1/50)，及之后之山羊抗-小鼠IgG-DyLight 488标记的抗体(1/150)进行染 色，来检测细胞内的IDO表现。通过共聚焦显微镜采集影像。线段＝10μm。

图5显示受GRO-γ处理之MDDCs启动的T细胞具有耐受性 性质。将人类CD3⁺T细胞(3×10⁵个)以被3×10⁴个于有或无重组GRO-γ 存在下，经过或未经SB225002预处理之条件下进行分化之MDDCs刺激。(A) 以RT-PCR评估于纯化自MDDC的CD3⁺T细胞及T细胞共培养物中之选择 性基因IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ的mRNA表现。相对基因表现系对于 GAPDH之表现正常化。数据以相对于经DC-启动之T细胞组所得值(平均值 ±SD)的基因表现倍数表示(n＝3)。实验结果来自5个独立实验。(B)以ELISA 分析存在于收集自与T淋巴细胞共培养之经GRO-γ处理和未处理的MDDCs 之细胞培养上清中的细胞激素图谱。数据以细胞因子浓度的平均值±标准偏差 表示。n＝2-3。结果来自三个独立实验。*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.0001。

图6显示GRO-γ处理之BMDC呈现MDSC细胞之细胞图 谱。(A)自C57BL/6小鼠采集骨髓细胞，并以单独GM-CSF、GM-CSF/GRO-γ 或GM-CSF/GRO-γ/SB225002处理六天使其分化为BMDCs。以FACS分析使 用抗CD11b和GR-1抗体进行纯化自BMDCs表面标定。然后使用FACS Aria 细胞分选仪分离CD11b和GR-1双阳性细胞，并以RT-PCR测定精氨酸酶1 和诱导型一氧化氮合酶基因的转录程度。mRNA的表现系以BMDCs相对 mRNA倍数表现(对GAPDH基因表现量正常化)。数据取自三次测量平均值 ±标准偏差(n＝3)。结果来自三次独立实验。(B)以FACS Aria分选出 OT-1/CD8+T细胞，并于OVA257-264胜肽存在下与经GRO-γ处理或未经处 理的BMDC共培养3天。使用³H-胸苷并入分析来测定抗原特定刺激之T细 胞增生。(C)为于活体内分析GRO-处理细胞之免疫抑制活性的实验流程图。 步骤1：BMDCs免疫前六天，准备不同组衍生自C57BL/6小鼠骨髓细胞的 BMDCs。步骤2和步骤3：BMDCs免疫前一天将C57BL/6小鼠以1Gy照射， 然后将小鼠以静脉注射OT-1脾脏细胞(4×10⁷细胞/鼠)。第4步：收集各种不 同的BMDCs(5×10⁴细胞/小鼠)，然后于第0天以皮下注射到6-8周龄之OT-1 脾脏细胞-重建的B6小鼠。步骤5：BMDCs刺激后第7天，牺牲各实验组小 鼠并从各小鼠收集脾脏细胞，然后置于96孔U底平盘中以OVA(1μg/mL) 或对照组胜肽RAH(1μg/mL)刺激。以³H-胸腺嘧啶核苷并入法测定脾脏细 胞的增生活性(步骤6)。(D)收集来自经过或未经GRO-γ处理之C57BL/6 小鼠骨髓细胞的BMDCs，并以OVA_257-264胜肽施予脉冲。待使用清洗缓冲液 除去未结合的胜肽后，将不同的BMDCs制备物再悬浮于150μL的PBS中， 然后以皮下注射入以OT-1脾脏细胞(4×10⁷细胞/小鼠)重建之于受照射的 C57BL/6小鼠中。于BMDCs投药后第7天，从所有处理组之小鼠分离出脾脏 细胞，并于以OVA_257-264胜肽刺激12、36和60小时后分析彼等的增生活性。 (E)从(D)之经OVA_257-264胜肽刺激之细胞收集上清液，并以ELISA测定 IFN-γ和TNF-α的分泌程度。(D)和(E)中所显示之数据为得自三个独立实 验组的平均值±SD(n＝2-3)。使用Student’s t test测定统计学上的显著性，以 p值表示。*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.0001。ns：无统计学意义。nd： 无法侦测到。

图7显示在无肿瘤及肿瘤增生小鼠中各次组脾脏细胞的免疫 抑制活性。将EL4细胞以皮下注射施予8周龄的C57BL/6小鼠以产生肿瘤增 生小鼠。以仅接受PBS缓冲溶液之小鼠作为无肿瘤对照组。在第28天牺牲动 物。(A)分析有无肿瘤细胞之小鼠其脾脏细胞中出现CD11b⁺Gr1⁺表现细胞的 比例进行。(B)分析采收自无肿瘤及肿瘤增生小鼠之总体脾细胞、分选之 CD11b⁺细胞及分选之CD11b^-细胞的抑制效果进行。所示数据为来自三个独 立实验的平均值和标准偏差如图。使用Student’s t test确定显著差异性，以p 值表示。*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.0001。ns：无统计学意义。

图8显示于经过GRO-γ处理和未经处理之BMDCs中，衍 生自各种不同次组骨髓之细胞的免疫抑制活性。将小鼠BMDCs于有或无 GRO-γ存在下进行分化。从经过GRO-γ处理和未经处理之BMDCs分选出未 经分离之细胞(总体细胞)、CD11b⁺细胞和CD11b^-细胞。于各组分选细胞之 存在下，估计同种异体反应性淋巴细胞的增生活性。所示数据为来自三个独 立实验的平均值和标准偏差。使用Student’s t test确定显著差异性，以p值表 示。*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.0001。ns：无统计学意义。

图9显示GRO-γ处理的BMDCs可改善GvHD小鼠的失重 和存活率。于经过致死性照射之BALB/c小鼠(接受者,R)中，藉由以静脉 内注入分离自MHC不匹配的野生型B6小鼠(供者，D)之骨髓细胞和脾脏 细胞来诱发GvHD。将不同的细胞组群分别注射入接受者：5×10⁶个仅含分离 自供者小鼠之骨髓细胞(BM，D)(-□-)(n＝3)，5×10⁵个仅含分离自供 者小鼠之脾脏细胞(SP，D)(-△-)(n＝3)，分离自供者小鼠之BM和SP 的组合(BM(D)+SP(D))(-○-)(n＝4)，以及分离自供者小鼠之BM 和SP的组合加上于移植后第0天(-■-)、第2天(-▲-)及第7天(- ●-)注射1×10⁷个经GRO-γ处理的BMDCs(GBMDC)。于移植后监测动 物之体重变化(A)及存活率(B)达10天。以仅接受骨髓细胞的动物作为对 照组。进行Log-rank(Mantel-Cox)测试，对于存活率之p＝0.0255。表示三次实 验其中一次的结果。

【实施方式】

本发明系基于发现为特定趋化激素，例如:生长调节肿瘤 (GRO)化学趋素，可驱使人类周边血液单核细胞衍生之树突状细胞分化， 而成为具有类似髓源性抑制细胞(MDSC)的表现型。

据此，本发明系描述一种获得可呈现类MDSC表现型之免疫 抑制细胞的方法。该方法包括获得可分化为树突状细胞(DC)之前驱细胞(例 如，单核细胞衍生之DC)，并将该前驱细胞培养于一种含有趋化激素之培养 基中一段足够时间，以使该前驱细胞能分化为树突状细胞。以此培养得到之 树突状细胞展现类似MDSC之表现型，例如具有免疫抑制之表现型。

适用于本发明方法之前驱细胞包括CD14⁺单核细胞、骨髓细 胞及髓源性前驱细胞。较佳地，该前驱细胞为CD14⁺单核细胞或骨髓细胞。 前驱细胞可以该项技术领域中习知的方法，或以如下所述之方法获得。

将前驱细胞于含一或多种趋化激素之培养液中培养一段足 以使该细胞分化成为可展现类似MDSC表现型之DC的时间(例如3-7天)。 此可使用各种不同的培养基，例如:间质干细胞(MSC)-条件培养基、α-MEM 完全培养基及ROMI-1640培养基。所述之培养基可补充以其他因子，例如， 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或IL-4。该趋化激素可为GRO趋 化激素。

GRO趋化激素，亦即CXCL1/GRO-α、CXCL2/GRO-β及 CXCL3/GRO-γ含有Glu-Leu-Arg(ELR)基序，且系属于IL-8血管新生系细 胞激素家族。所述之趋化激素可得自化学来源，或使用该项技艺中习知的方 法，例如：重组蛋白质技术而制备得。人类GRO-α、GRO-β(MIP2α)和GRO-γ (MIP2β)为三种不同、非等位人类基因之产物。GRO-β及GRO-γ分别与GRO-α 共有90％及86％之胺基酸序列同源性。GRO趋化激素之胺基酸序列为该项技 艺已知者。参见，例如：NCBI参考序列NP_001502.1(人类GRO-α: AGASVATELR CQCLQTLQGI HPKNIQSVNV KSPGPHCAQT EVIATLKNGR  KACLNPASPI VKKIIEKMLN SDK(SEQ ID NO:1))；NCBI参考序列 NM_002089.3(人类GRO-β:AGAPLATELR CQCLQTLQGI HLKNIQSVKV  KSPGPHCAQT EVIATLKNGQ KACLNPASPM VKKIIEKMLK NGK(SEQ ID  NO:2))及NCBI参考序列NM_002090.2(GRO-γ:ASVVTELRCQ  CLQTLQGIHL KNIQSVNVRS PGPHCAQTEV IATLKNGKKA  CLNPASPMVQ KIIEKILNKG STN(SEQ ID NO:3))。

以上述方法获得之免疫抑制细胞具有某些特定特征(例如类 MDSC表现型)，以下做进一步详述。举例来说，这些细胞可刺激T细胞增生 的能力减低，且藉由增加IL-10和IL-4分泌使T细胞直接分化呈现免疫耐受 性表现型，增加Foxp3之表现，和减少IL-12和IFN-γ产生。免疫抑制细胞 使用习知方法，及如下所述之方法，例如ELISA、流式细胞仪及定量RT-PCR 进行特征确定。

本发明亦包括含有上述免疫抑制细胞的组成物。该组成物可 进一步包含医药上或生理上可接受之赋形剂。

本发明亦包含使用上述之细胞组成物，以于个体中方法对于 抑制免疫反应、调控与肿瘤发生相关之血管新生及和治疗各种其他免疫状况 病况，即移植物对抗宿主疾病(GVHD)、发炎性疾病、自体免疫疾病和移植 排斥。所述之免疫抑制细胞可自异源或自体的前驱细胞产生。而以前例，可 进行HLA-配对以避免或使宿主反应减至最低。

发炎性疾病包括(但不限定于)阿兹海默氏症、强直性脊柱 炎、骨关节炎、类风湿关节炎、银屑病关节炎、哮喘、动脉粥样硬化，科隆 氏病、结肠炎、皮肤炎、憩室炎、纤维肌痛、肝炎，肠易激征候群即全身性 红斑狼疮。

自体免疫疾病括(但不限定于)阿狄森氏病、Celiac疾病、皮 肌炎、葛瑞夫兹病、桥本氏甲状腺炎、多发性硬化症、重症肌无力症、恶性 贫血、类风湿性关节炎、干燥征候群，全身性红斑狼疮及第I型糖尿病。

个体系指分人类或非人类动物。非人类动物之实例包括所有 具有免疫系统之脊椎动物，例如哺乳动物，如非人类灵长类(特别是高等灵长 类)、狗、囓齿类(如小鼠或大鼠)、天竺鼠、猫、畜牧动物(如马、牛、羊 或猪)，及非哺乳类如鸟类、两栖类、爬虫类等。于较佳具体态样，所述之个 体为人类。于另一具体态样，该个体为实验动物或为适合作为疾病模型之动 物。

欲接受治疗上述其中一病况之个体，可经由针对该特别疾病 所定之标准诊断技术加以确定。“治疗”意指将一种组成物(例如细胞组成物) 投药予已罹患，或具有发展成某一疾病之风险的个体，以治愈、减轻、缓解、 补救、延缓发病、预防或改善该疾病、该疾病的症状、该疾病之继发状态或 导致该损伤/疾病之诱因。“有效量”系指能够在受治疗之个体中产生所希望的 医疗结果之组成物的量。所述之治疗方法可以单独进行，或与其他药物或疗 程结合。

上述之免疫抑制细胞可经由注入或注射(例如，静脉内、鞘 内、肌内、管腔内、气管内、腹膜内或皮下注射)、口服、经皮或于该项技术 领域中已知的其它方法进行投药。

投药可以两个礼拜一次或一个礼拜一次，或其频率更多或更 少。剂量和频率有部份系取决于，预期以上述细胞进行治疗之疾病或失调症 的病理征兆和临床与亚临床症状的衰退状况。如习于本技术领域者所能理解， 可视各种例如病情的严重程度，个体之年龄、性别或身体状况，副作用及医 师的判断等因素，来调整剂量和投药方案。在所有上述方法中，可将细胞以 (例如)每次注射1×10⁶至1×10⁹个细胞之剂量施用予个体。

下列之特别实施例可被解释为仅具有说明性，而不是以任何 方式限制本发明所揭示的其余部分。在无进一步阐述的情况下，相信熟悉本 领域之技术人员可以根据本说明书的记载，将本发明利用至最充分的程度。 所有于本说明书中引述的公开文献，系以其全文通过引用的方式并入本文中 作为参考。

实施例

材料与方法

(1)老鼠

C57BL/6(H2b)小鼠购买自实验动物中心并饲养 于财团法人卫生研究院之实验动物中心。C57BL/6(H2b)/OT-1 转殖鼠(transgenic for the TCR-specific peptide OVA257-264, SIINFEKL)由中研院Dr.John Kung赠与。本研究使用六到八 周龄之小鼠。所有的动物实验皆按照财团法人卫生研究院的机 构动物护理和使用委员会批准的协议(协议编号: NHRI-IACUC-100003和NHRI-IACUC-097077-A)进行。

(2)化学试剂

重组人类GRO-α、GRO-β、GRO-γ、IL-4、GM-CSF 及重组小鼠GM-CSF购买自PeproTech Inc(Rocky Hill,NJ, USA)。重组小鼠GRO-α、GRO-β及GRO-γ购买自R&D系统 (Minneapolis,MN,USA)。N-(2-羟基-4-硝基苯基)-N’-(2-溴苯基) 脲(SB225002)购买自Calbiochem(San Diego,CA,USA)。脂多 糖(LPS,分离自大肠杆菌055:B5)购买自Sigma-Aldrich(St. Louis,MO,USA)。R-Phycoerythrin(PE)标记之小鼠抗-人类 CD11c、HLA-DR及CD83抗体购买自eBioscience(San Diego, CA,USA)。荧光异硫基氰酸酯(FITC)-共轭之小鼠抗-人类CD86、 DC-SIGN、CD40和CD80抗体购买自BioLegend(San Diego,CA, USA)。

(3)MSC条件培养基(MSC-CM)之制备

以先前已报告的方法(Lee et al.，2004)从脐带 血纯化得到脐带间质干细胞(uMSCs)并加以特征确定。将 uMSCs保存于含有α–MEM与10％ES-FBS(HyClone,Logan,UT, USA)的培养基。将uMSCs(3x10⁵个细胞/15mL置于15cm²- 细胞培养盘中，第7代)于补充以混合的AB型血清(Invitrogen, Carlsbad,CA,USA)之培养基中在进行两次继代培养扩增。每 次继代培养时间为5天。将3×10⁵uMSCs(p9)重新接种在含 15ml完全培养基(α-MEM含有10％混合的AB型人类血清及 1x青霉素-链霉素-谷胺酸(Invitrogen))的15cm²培养皿中， 并于湿润的二氧化碳培养箱中于37℃下培养5天。将uMSCs 的上清液在300×g及4℃下离心10分钟，以除去细胞碎片， 收集上清液并储存于-80℃下，然后使用作为条件培养基 (MSC-CM)。

(4)细胞激素/趋化激素列阵分析

使用人类细胞激素列阵C套组(传讯人类细胞激 素抗体列阵C系列1000.1,RayBio,Redwood City,CA,USA)， 按照制造商的指示操作，来建立于有或无uMSCs存在下之含有 10％混合的AB型人类血清的α-MEM中，所含细胞激素和生 长因子之分泌情形。使用ECL系统(Amersham Pharmacia  Biotech,Aylesbury,UK)，于Kodak BioMax光底片(Kodak, Rochester,NY,USA)上侦测化学发光信号。利用 AlphaImager1220分析和文文件系统(Alpha Innotech,Braintree, UK)以点密度仪量化信号强度。将每一点信号对相邻的背景值 进行校正，并对该膜的阳性对照组正常化。

(5)产生人类MDDCs

从健康供者以白血球细胞除去法产生人类单核细 胞-衍生的树突状细胞(MDDCs)。以Fycoll-Hypaque Plus(GE  Health-Pharmacia,Uppsala,Sweden)密度离心纯化得到周边血 液单核细胞(PBMC)。使用人类CD14⁺细胞分离套组(MACS, Miltenyi Biotec,Inc.,Auburn,CA,USA)，依照制造商之操作指 示，分离得到人类CD14⁺单核细胞。接着将纯化的CD14⁺细 胞(1×10⁶/mL)在有或无GRO趋化激素存在下，培养于2毫升 含有10％混合的AB型人类血清，补充以rhGM-CSF(80ng/mL) 和rhIL-4(80ng/mL)(Peprotech,NJ)之MSC-CM或α-MEM 完全培养基中，补充加入诱导其分化成为DCs。于第3天，将 额外1毫升含有相同浓度的rhGM-CSF和rhIL-4，含有或不含 GRO趋化激素之培养基，添加到每组细胞。于第5天，将一半 体积的细胞培养物，以同等体积含有相同浓度之rhGM-CSF和 rhIL-4的新鲜培养基置换。于第5天，将1μg/mL的LPS加入 iMDDCs的培养基中，再进行培养48小时，来并诱导MDDCs (成熟DCs，mMDDCs)的熟成。于第7天，利用FACS分析 来监测未成熟DC(iMDDCs)和成熟DC(mMDDCs)间的表现 型变化。该研究提案系经由中研院医学研究伦理委员会 (AS-IRB01-10113)和财团法人卫生研究院(EC1001101)研 究伦理委员会机构审查委员会批准。

(6)FACS分析

将1×10⁵个细胞以对抗CD11c、HLA-DR、CD80、 CD86、CD83、CD40和DC-SIGN之荧光色团标记的抗体(Abs) 进行染色，而获得单核细胞、iMDDCs和mMDDCs的表现型图 谱。以流式细胞仪测定荧光强度。所使用相对应之同型-配对的 对照为FITC-IgG1、FITC-IgG2a、PE-IgG2a及PE-IgG2b(BD  Biosciences,San Jose,CA,USA)。使用FACS Calibur-流式细胞 仪(BD Biosciences公司)分析其表面经标记的细胞。关于细 胞纯化，系于FACS Aria细胞分选仪(BD Biosciences公司) 上进行分选。各别经分选之细胞族群的纯度系大于95％。

(7)细胞内吞测试

藉由分析FITC-葡聚醣(40KD，FD40S， Sigma-Aldrich公司)之细胞摄取量，来测量iMDDCs或mMDDCs 的内吞活性，以流式细胞仪量化。在37℃下，将细胞(5×10⁴细胞/样本/96孔V底平盘)于1mg/mL之FITC-葡聚醣的 RPMI-1640培养基中进行培养30分钟。培育后，将细胞洗涤两 次以除去游离的试剂，然后用1％多聚甲醛固定。以FACS分析 来自被细胞内吞之FITC-葡聚醣的信号。使用FlowJo5.7.2版软 件进行数据分析。取得自与不含FITC-葡聚醣之培养基进行培 养之细胞的信号作为阴性对照。

(8)MLR测试

将处于不同分化阶段之单核细胞衍生的细胞 (3×10⁴)，在使用X-射线生物照射器(X-ray R-2000,Rad Source  Technologies,Inc,Alpharetta,GA,USA)于30Gy下进行照射， 然后与经纯化的异体CD3⁺T细胞(1:10)，在完全培养基中， 于96孔U底平盘中进行培养。将经X射线照射之髓细胞和同 种异体T淋巴细胞于放置在37℃潮湿的CO₂培养箱中。经过96 小时后，将[³H]-胸苷(1μCi)加入每孔含有单核细胞、iMDDCs 或mMDDCs与T细胞混合之槽中，并再培养16小时。然后用 Filtermate 96-孔收集器收取细胞，并于Packard微量平盘闪烁 和发光计数器(Perkin-Elmer-Packard；Waltham,MA,USA)中 测定放射活性(cpm)作为细胞增生指数。

(9)RNA制备及定量RT-PCR

用Trizol试剂萃取总体RNA，并使用ReverTra  Ace set(Toyobo Life Science,Osaka,Japan)，依据制造商之操 作指示转换成为cDNA。使用ABI棱镜7900系统(Applied  Biosystems,Foster City,CA,USA)进行RT-PCR分析。将样品 依照下列程序处理：5℃下2分钟，94℃下10分钟，以及40次 包含95℃下15秒和60℃下1分钟的循环。重复进行分析三次。 对于每个样品，皆测定循环阈值(Ct)值。将结果以同一平板 上之GAPDH基因为基准归一化。使用2△CT法计算不同细胞 组的mRNA表现。设计对个别基因具特异性之跨越内含子的引 子对。其序列如下所示：人类GAPDH，GAGTCAACGGATTTGGTCGT (前向引子，F,SEQ ID NO:4),TTGATTTTGGAGGGATCTCG(反向引子， R,SEQ ID NO:5)；人类IL-10,ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCC(F, SEQ ID NO:6),AAGTCTCAAGGGGCTGGGTCAGCTATCCCA(R,SEQ ID  NO:7)；人类IDO，CGCCTTGCACGTCTAGTTCTG(F,SEQ ID NO:8), TGACCTTTGCCCCACACAT(R,SEQ ID NO:9)；人类基质-金属胜肽酶 -9(MMP-9)，GAAGATGCTGCTGTTCAGCG(F,SEQ ID NO:10), ACTTGGTCCACCTGGTTCAA(R,SEQ ID NO:11)；人类IL-4， GGCAGTTCTACAGCCACCATG(F,SEQ ID NO:12), GCCTGTGGAACTGCTGTGC(R,SQ ID NO:13)；人类IL-12p40, CGGTCATCTGCCGCAAA(F,SEQ ID NO:14), CAAGATGAGCTATAGTAGCGGTCCT(R,SEQ ID NO:15)；人类TNF-α, GGTGCTTGTTCCTCAGCCTC(F,SEQ ID NO:16), CAGGCAGAAGAGCGTGGTG(R,SEQ ID NO:17)；人类IFN-γ, CCAACGCAAAGCAATAGCTGC(F,SEQ ID NO:18), CGCTTCCCTGTTTTAGCTGC(R,SEQ ID NO:19)；人类Cox2, CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG(F,SEQ ID NO:20), GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA(R,SEQ ID NO:21)；人类PD-L1, TATGGTGGTGCCGACTACAA(F,SEQ ID NO:22), TGCTTGTCCAGATGACTTCG(R,SEQ ID NO:23)；人类PD-L2, TGACTTCAAATATGCCTTGTTAGTG(F,SEQ ID NO:24), GAAGAGTTCTTAGTGTGGTTATATG(R,SEQ ID NO:25)；人类TGF-β, GCAGAAGTTGGCATGGTAGC(F,SEQ ID NO:26), CCCTGGACACCAACTATTGC(R,SEQ ID NO:27)；人类IL-6, ATTCTGCGCAGCTTTAAGGA(F,SEQ ID NO:28), AACAACAATCTGAGGTGCCC(R,SEQ ID NO:29)；IL-1β, ACGAATCTCCGACCACCACT(F,SEQ ID NO:30), CCATGGCCACAACAACTGAC(R,SEQ ID NO:31)；小鼠GAPDH, GATGCAGGGATGATGTTC(F,SEQ ID NO:32),TGCACCACCAACTGCTTAG (R,SEQ ID NO:33)；小鼠精胺酸酶1(Arg-1), CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG(F,SEQ ID NO:34), AGGAGCTGTCATTAGGGACATC(R,SEQ ID NO:35)；小鼠iNOS, AAAGTGACCTGAAAGAGGAAAAGGA(F,SEQ ID NO:36), TTGGTGACTCTTAGGGTCATCTTGTA(R,SEQ ID NO:37)；小鼠IFN-γ, CATTGAAAGCCTAGAAAGTCTGAATAAC(F,SEQ ID NO:38), TGGCTCTGCAGGATTTTCATG(R,SEQ ID NO:39)。

(10)ELISA

从单独的MDDCs(5×10⁴)、单独的CD3⁺纯化T- 细胞(人类CD3⁺细胞单离套组,MACS,Miltenyi Biotec,Inc., 5x10⁵)或MDDCs(5×10⁴)与CD3⁺纯化T细胞(5×10⁵)共同 培养的培养物收取上清液，并使用市售之ELISA套组，根据制 造商的操作指示(R&D systems)测定存在上清液中之IL-4、 IL-10、IL-12、INF-γ、IL-6和TNF-α的浓度，重复进行三次。

(11)共聚焦显微镜

于有或无GRO-γ存在下产生MDDCs，然后分析 细胞内IDO蛋白的表现。将细胞(5×10⁴)平布置于涂覆有聚-L- 赖氨酸的玻片上15分钟，之后迅速用0.5mL PBS洗涤两次。加 入0.5mL 1％多聚甲醛(Sigma-Aldrich)固定细胞10分钟，然 后用PBS清洗3次，并在室温下于0.5mL的1％BSA/PBS中静 置30分钟。细胞以0.1％(v/v)NP-40/PBS洗涤三次，然后与 0.5％BSA/PBS(含1:50稀释后的小鼠抗人类IDO抗体 (Chemicon Inc,Temecula,CA,USA))于室温下反应1小时。 细胞进一步用0.1％(体积/体积)NP-40/PBS清洗以除去未结合 的抗体，然后与1:150稀释的与DyLight488共轭之抗小鼠IgG 抗体(Sigma-Aldrich)在室温下反应1小时。以0.1％(v/v) NP-40/PBS进行最终洗涤三次后，将玻片包封于10％甘油/PBS 中，并用指甲油密封。使用Leica TCS SP5相机取得荧光图像 (Leica Camera AG,Solms,Germany)。

(12)老鼠BMDCs之生成

如先前所描述(Song et al，2011)，收集小鼠骨 髓衍生之树突状细胞(BMDCs)并将其分化成树突状细胞。简 单地说，将取自C57BL/6小鼠的骨髓细胞以2×10⁵个细胞/mL 之密度，在有或无重组小鼠GRO趋化激素存在下培养于含有 10毫升添加有200U/mL(20ng/mL)重组小鼠GM-CSF之完全 RPMI-1640培养基的培养盘中。于第3天，将一半体积的培养 基更换以，由含有20ng/mL rhGM-CSF(有或无与GRO组合)之 完全RPMI培养基。于第6天，从各培养盘收集来自不同处理 组的BMDCs，将其清洗并进行特征鉴定。

(13)于体外和体内测量经小鼠GRO-处理之细胞 的免疫抑制活性

通过测量以OVA-启动之DC刺激所产生对OVA 特异性OT-1 CD8⁺纯化T细胞的增生抑制作用，分析经GRO-γ 处理细胞之体外免疫抑制活性。于第6天，收集在有或无GRO-γ 存在下进行分化之小鼠(C57BL/6)BMDCs，然后再悬浮于LCM 培养基(补充5％胎牛血清、50μg/mL庆大霉素、20.25mM  HEPES，50μM 2-ME和100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素 之RPMI1640培养基)。使用FACS Aria流式细胞仪进行细胞分 选，来收集OT-1 CD8⁺T细胞(2×10⁵细胞/孔)，然后单独培养， 或与BMDC(1×10⁵细胞/孔)或BMDC/GRO-γ细胞(1×10⁵细 胞/孔)组合，在有OVA_257-264CTL抗原表位(1μg/mL)或人类 乳头状瘤病毒的RAH对照胜肽(1μg/mL)的存在下，培养于含 200μL LCM培养基的96孔U底微量平盘中。将培养物在37℃， 5％CO₂培养箱中培养3天，将[³H]胸苷(1μCi)加入到各孔中， 之后再额外培育16小时。然后使用半自动化的样品收集器收取 细胞，并在Packard微量平盘闪烁及发光计数器测定放射活性 (cpm)，作为细胞增生的指标。

对于活体内的免疫抑制分析，系于第(-6)天准 备欲进行不同处理的小鼠BMDCs。于第(-1)天，制备OT-1 脏细胞(4×10⁷/小鼠)并将其以静脉注射投药予6-8周龄预先以 X射线(1Gy)照射的B6小鼠。收集在有或无GRO-γ存在下进 行分化之BMDCs，并于进行转移当天，与或不与OVA_257-264胜 肽(1μg/mL)在37℃下进行培育1小时，然后加以洗涤以除去 未结合的胜肽。然后在第0天，将各种BMDC制剂(5×10⁴细胞 /小鼠)以皮下注射入OT-1脾脏细胞重建的B6小鼠，来引发活 体内的抗原特异性活化作用。于第7天，将各组以HBSS、 BMDCs、BMDCs/GRO-γ、BMDCs/OVA或BMDCs/GRO-γ/OVA 处理之小鼠牺牲。从个别小鼠收取脾脏细胞(2×10⁵个细胞/孔)， 并置于96孔U底平盘中以OVA(1μg/mL)，或对照组RAH (1μg/mL)胜肽刺激。将培养物在37℃5％CO₂下培育12、36 及60小时。藉由³H-胸苷并入法测定得自HBSS组，或不同组 BMDCs引发小鼠之脾脏细胞的增生。实验重复两次。数据为以 每组三只老鼠于三个独立实验中获得之代表性结果。

(14)统计分析

使用GraphPad棱镜，版本5.02(GraphPad  Software,Inc)进行分析统计。数据系以得自至少三个独立实验 的平均值±平均值标准偏差的(SEM)表示。使用one-tailed  Student’s t-test分析各组间的统计学显著差异。

我们认为p值<0.05是显著的，且显著程度如下 所示：*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

结果

(1)MSC-条件培养基可对MDDC分化和功能产 生抑制效果。

本发明建立一种用以诱导人类CD14⁺单核细胞 分化为MDDCs之活体外标准操作程序，并建立用于在髓源性 细胞之分化途径的每一阶段鉴定其表现型特征之分析。

为研究MSC-条件培养基(MSC-CM)是否会影响 MDDCs分化，遂在人类周边血液CD14⁺单核细胞的分化和成 熟过程中，将培养基替换以MSC-CM。我们观察到，相较于未 经处理之未成熟MDDCs(iDCS)，于经过MSC-CM处理之iDCS 上的CD40、CD80、DC-SIGN、CD83、CD11C和HLA-DR表面 表现显著减少(图1A，上列比较组)。在以经由于至少两天培 养期间施予LPS刺激而产生的成熟MDDCs(MDCS)所进行之 实验，也获得类似的结果(图1A，下列比较组)。

为了进一步检查MSC-CM是否会影响iDCS之内 吞活性，用流式细胞仪分析测定FITC-葡聚醣摄取。结果显示， 得自MSC-CM处理组之iDC的内吞能力显著降低(图1B)。在 混合淋巴细胞反应中刺激同种异体T细胞增生的能力(MDDCs 的另一项功能)，也在从MSC-CM培养产生之mDC中受到减量 调节(图1C)。综合上述，此等结果显示MSC-CM对于MDDC 分化和功能呈现抑制功效。

(2)GRO-γ在介导MSCs对于MDDCs分化和功 能的抑制作用方面扮演关键性角色。

本发明研究在MSC-CM中是何种可溶性因子负责 对于MDDC分化的抑制活性。于MSC-CM中检测到GRO浓度 显著增加(图2A)。我们进一步检验不同亚型的GRO对于人类 iMDDCs之表现型的生物学效应。据发现，仅仅GRO-α和GRO-γ 对于CD40表现具有显著的抑制效果(图2B)。由于GRO-α强 度于细胞激素/趋化激素数组中只有微小增加(图2A)，故在后 续的实验中仅针对GRO-γ之特性进行研究。为了进一步确定存 在于MSC-CM中之GRO-γ对于MDDC分化的作用，吾等显示 条件培养基对于iDC和mDC二者的抑制效果，部分可经由添加 中和性抗-GRO-γ抗体而逆转，但不受其同种型对照影响(图 2C)。在这种抗体的存在下，相较于以同种型对照组或MSC-CM 处理的细胞，DC-SIGN、CD80和CD83于iDC的表面-表现量 显著增加(图2C，上列比较组)。同样，抗-GRO-γ抗体会实质 上逆转MSC-CM对于CD80、DC-SIGN、CD40和CD11C在成 熟DC上之表面表现的抑制效果(图2C，下列比较组)。

评估重组GRO-γ抑制MDDC分化及抑制其功能 的能力。当单核细胞iDC分化时有GRO-γ存在下，相较于无 GRO-γ存在下进行培养之细胞，CD40、CD83、CD80、CD11c、 CD86和DC-SIGN在iDC上的表面表现量显著降低(图3A，上 列比较组)。于mDC易观察到类似的结果，惟，DC-SIGN表现 并没有受到添加GRO-γ影响(图3(a)，下列比较组)。另外， 于培养基中加入CXCR2受体竞争型拮抗剂SB225002，会显著 逆转GRO-γ对于此等所选择之位于iDCS和mDC上的表面标记 物表现的抑制效果(图3A)。同样地，DC-SIGN于iDC和mDC 上的表现并没有受到添加SB225002影响。关于MDDCs的功能， GRO-γ会分别显著减量调节iDC的内吞活性，及mDC于混合 淋巴细胞反应中刺激T细胞增生的能力。此等功效亦会因添加 SB225002而受阻断(图3B和图3C)。

这些数据证明，由MSC分泌之GRO-γ在抑制 MDDCs之分化和功能上扮演着关键的角色。

(3)GRO-γ驱动MDDC分化趋向类似髓源性抑制 细胞的免疫表现型。

GRO-γ除了对MDDCs分化及功能具有抑制功效 外，GRO-γ也影响MDDC分化前间的细胞激素表现。进行 RT-PCR来检测在得自7天培养物之MDDCs中所选定基因的相 对mRNA浓度。结果显示，当有GRO-γ存在时，发炎性细胞激 素基因(即TNF-α、IFN-γ和IL-12)之mRNA，在MDDC分化期 间被显著下调(图4A)。IL-10、IL-4、TGF-β、IL-1β和IL-6的 基因及其他编码COX-2、编程死亡配体(PD-L1和PD-L2)、基 质-金属胜肽酶9(MMP-9)及特别地IDO之基因的表现程度受 到增量调节(图4A)。人类MDSC特征在于其具有能分泌IL-10、 IL-4、IL-1β和IL-6，及表现COX-2、PD-L1、MMP-9和IDO 的能力。定量PCR分析显示，和未处理之MDDCs对照组相比， 以GRO-γ处理之MDDCs会增加此等MDSC标记基因的表现(图 4A)。

为了进一步分析所释出之细胞激素在各组已分化 细胞中之分布情形，遂于培养7天后收集MDDCs，洗净后再培 养3天。进行ELISA，测量于从不同的实验组取得之上清液中 的细胞激素浓度。与RT-PCR之数据相符，于得自在有GRO-γ 存在下进行分化之MDDCs的上清液中，侦测到IL-4和IL-10 浓度升高，而IFN-γ和IL-12浓度降低(图4B)。以DyLight 488- 共轭之抗-IDO抗体进行之胞内染色亦显示，于GRO-γ存在下进 行分化之MDDCs中，IDO的细胞内表现量增加(图4C)。

这些结果指出，GRO-γ不仅抑制MDDC分化，也 会驱动朝向类似MDSC的免疫表现型进行分化。

(4)GRO-γ引发之MDDCs驱动T细胞趋向耐受性 免疫表现型进行分化

为进一步探讨经GRO-γ处理之MDDCs对于T细 胞反应的影响，遂将使用人类CD3⁺细胞分离套组纯化得之CD3⁺T细胞暴露于有或无以GRO-γ处理之已分化自体MDDCs细胞。 进一步以相同的方法，自T/MDDCs混合物分离出CD3⁺T细胞。 萃取出RNA，并以RT-PCR检测所选细胞激素基因之表现。实 验发现，相较于与未经处理的MDDCs共同培养之T细胞，与 经GRO-γ-引发之MDDCs共培养的CD3+T细胞会表现较高量之 IL-4和IL-10mRNA，但表现较低量的IFN-γ和IL-12mRNA(图 5A)。亦使用ELISA分析MDDCs/T细胞共培养培养基中的细 胞激素分布。与RT-PCR数据一致，吾等发现，相较于取自未 经引发之MDDCs的T对照组上清液，与GRO-γ引发之MDDCs 共培养的T细胞之上清液中IL-4和IL-10的分泌量显著升高(图 5B)。在GRO-γ引发之MDDCs的存在下，IL-12和IFN-γ于共 培养培养基中的浓度显著降低(图5B)。

这些数据表示，GRO-γ引发之MDDCs可驱动T 细胞朝向更具耐受性的表现型。

(5)GRO-γ处理的BMDCs显示于活体内具有类 MDSC特征。

为了进一步于活体内探讨GRO-γ-引发之DCs的 功能，我们于老鼠系统中研究DCs在有或无GRO-γ存在下的分 化。收集分化的BMDCs，并使用CD11b和GR-1荧光抗体针对 小鼠MDSC标记进行染色。分选出双阳性CD11b⁺Gr-1⁺细胞做 进一步分析。我们发现，BMDCs中双阳性CD11b⁺Gr-1⁺细胞的 百分比不因GRO-γ的存在下而变化(图6A，上列比较组)。不 过，我们分析ARG-1基因和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)基 因的表现，彼等已知于小鼠会在MDSCs中受到增量调节，而抑 制T细胞增殖和细胞凋亡(Condamine与Gabrilovich,2011)。 正如预期，于经GRO-γ处理的BMDC中ARG-1和iNOS的mRNA 浓度升高培养上清中(图6A，下列比较组)，且CXCR2受体竞 争型拮抗剂SB225002可逆转于经GRO-γ处理之BMDC中对于 这两个基因的诱导作用。我们的数据显示，GRO-γ之免疫抑制 活性不因CD11b⁺Gr-1⁺双阳性细胞数量增加而影响，却是属于 BMDC特性中功能改变的结果。

接着，我们使用卵清蛋白(OVA)特异-挑战系统， 来分析取自活体受GRO-γ处理而诱导之MDSCs是否于体外和 活体内具有耐受性。收集OT-1小鼠脾脏细胞，并且使用FACS  Aria细胞分选仪分离出OT-1/CD8⁺T细胞。将分选出之OT-1/ CD8⁺T细胞置于96-孔平盘中，进一步于OVA257-264胜肽存 在下以经GRO-γ处理或未经处理之BMDCs进行刺激。以[³H] 胸苷并入法测定T细胞增生。结果显示，于第3天以OVA257-264 胜肽脉冲下，经由活体外分化之BMDCs刺激OT-1/CD8⁺T细胞 增生的作用，在呈现受到GRO-γ-引发之BMDCs减量调节(图 6B)。

接着在活体内试验GRO-γ产生的MDSCs对T细 胞的抑制效果。图6C列示所设计用于分析GRO-γ产生的MDSCs 之功能的实验流程图。将骨髓细胞于有或无GRO-γ存在下，以 GM-CSF进行分化六天。将小鼠以各种经过OVA257-264胜肽施 予脉冲之BMDC制剂进行免疫。于BMDCs注射前一天，将受 体小鼠施予照射(1Gy)，并以取自相同单倍型(haplotype)之OT-1 脾脏细胞重建。然后收集各种不同的BMDCs制剂，并以皮下注 射入适应OT-1脾脏细胞之B6小鼠。然后在以经过OVA257-264 胜肽施予脉冲之BMDCs免疫后第7天将动物牺牲，从免疫之小 鼠收集脾脏细胞，并于活体物以OVA257-264胜肽刺激12、36 和60小时。结果指出，取自以GRO-γ引发之BMDCs注射的老 鼠之脾脏细胞，其受OVA257-264胜肽刺激的增生作用，相较 于取自接受BMDCs对照组之细胞接受在OVA257-264胜肽刺激 后，于36和60小时的增生显著降低(图6D)。亦使用ELISA 分析取自不同实验组以OVA257-264胜肽刺激的脾脏细胞上清 液中细胞激素的分泌情形。我们观察到，于经GRO-γ引发之 BMDCs组中之IFN-γ和TNF-α浓度，相较于未经处理之BMDCs 组有降低的现象(图6E)。

这些数据显示，由GRO-γ引发之iDC在活体内表 现出类MDSC-表现型和功能。

(6)经GRO-γ处理的BMDC之CD11b⁺和CD11b^-次组呈现免疫抑制效果。

我们分析经GRO-γ处理和未处理的BMDCs中 CD11b⁺Gr1⁺细胞的数量和特性。研究结果表明，于BMDC分化 期间有GRO-γ存在时，不仅Arg-1基因、iNOS基因及MDSC 相关之基因的表现受到增量调节，经过GRO-γ处理之BMDCs 中Arg-1和iNOS之蛋白表现和酵素活性也增加。另一方面，在 CD11b⁺Gr1⁺细胞的出现频率方面，控制组和经GRO-γ处理之 BMDCs相似。

由于目前对于MDSC细胞的体内发育调节机转并 不清楚，大部分研究者仅能从带有肿瘤的老鼠体内获得MDSC。 为了了解利用GRO处理的免疫抑制细胞其抑制免疫的能力与 体内生成之MDSC的异同，如先前之报告所述，吾等建立能够 在活体内发展MDSCs之带有肿瘤的小鼠。参见Youn et al.,J  Immunol 181:5791-5802(2008)。将EL4细胞以皮下注射投入8 周龄的C57BL/6小鼠，以产生带有肿瘤的小鼠。接受PBS缓 冲液的小鼠当做无肿瘤对照组。于第28天牺牲动物，并评估脾 脏中CD11b⁺Gr1⁺细胞之生成比例(图7A)。在正常小鼠中， CD11b⁺Gr1⁺MDSCs约占脾脏细胞的2％左右，但是在带有肿瘤 的小鼠中增加到19％(图7A)。评估各种细胞(包括总体脾细胞 及CD11b⁺和CD11b^-分选次组(纯度>95％))在带有肿瘤和无 肿瘤小鼠中的抑制活性。数据显示，只有CD11b⁺次组(而非总 体脾脏细胞或CD11b^-次组)在无肿瘤小鼠中能实质地抑制同种 异体混合型淋巴细胞反应(同种异体的MLR)(图7B)。另一方 面，从带有肿瘤的小鼠收取之总体脾脏细胞不论CD11b⁺细胞及 CD11b^-次组都表现出惊人的抑制MLR能力(图7B)。

此外，本发明亦证明，收取自没有GRO-γ之 BMDCs的总体脾脏细胞、CD11b⁺和CD11b^-细胞，对同种异体 之MLR没有显著影响(图8)。然而，所有三组取自经GRO-γ 处理的BMDCs之细胞，皆表现出显著抑制淋巴细胞增生(图8)。 我们的数据显示，经GRO-γ处理之BMDCs其CD11b⁺和CD11b^-次组皆具有免疫抑制功效，此组细胞呈现的免疫抑制能力与从 带有肿瘤小鼠体内分离的细胞效果相近。

(7)经GRO-γ处理之BMDCs可改善GvHD mice 小鼠的失重和生存率。

藉由以静脉内灌流将分离自MHC不匹配的野生 型B6小鼠(供者，D)之5×10⁶骨髓细胞和5×10⁵脾脏细胞， 注入经致死照射之BALB/c小鼠(接受者)来诱发GvHD。将得 自供者小鼠之不同细胞组以静脉内注射到接受者，即单独5×10⁶ 个小鼠骨髓细胞、单独5×10⁵个脾脏细胞、骨髓细胞与脾脏细 胞之组合，及与脾脏细胞与1×10⁷经GRO-γ处理之与接受者同 源之BMDCs，于移植后第0、2及7天注射到小鼠中。对照组 小鼠只接受骨髓细胞。监测接受者之生存率、食物摄取量、失 重及临床的GvHD。

对照组小鼠在移植后显示体重量有小量变化(图 9A)。而接受脾脏细胞的小鼠显示其在移植后体重显著减少(图 9A)。于移植后第2天和第7天，接受经与接受者同源之GRO-γ 处理之BMDCs的老鼠，体重恢复(图9A)。对照组小鼠相较于 同时接受骨髓细胞和脾脏细胞的接受者，有显著较高的存活率 (100％)(图9B)。接受经与接受者同源之GRO-γ处理之BMDCs 的小鼠，其存活率高于只接受骨髓和脾脏细胞的小鼠(图9B)。

数据表明，经GRO-γ处理之BMDCs可改善GvHD 小鼠的失重情形和生存率。

其它实施例

所有在本说明书中公开的特征可以被任意组合。在本说明书中 公开的每个特征可被相同的，等效的或类似目的。因此，除非 另有说明，所披露特征仅是一个示例相同或相似的功能。从上 面的描述中，本领域技术人员可以很容易地确定本发明的本质 特征，不脱离发明精神和范围的情况下，可以作出各种变化和 修改本发明，以使其适应各种用途和条件。因此，其它实施例 也在下列申请专利范围之内。