一种从复杂环境样品筛选与计数产淀粉酶真菌的培养基

摘要

本发明提出了一种从复杂环境样品中筛选产淀粉酶真菌的培养基，该种培养基组成为：NaNO

说明书

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体地说是涉及一种从复杂环境样品筛选与计数产淀 粉酶真菌的培养基。

背景技术

复杂环境样品如土壤样品，酒曲样品等含有众多数量和种类的微生物，各种功能相同或 者相近的微生物集合体构成了不同的微生物功能群，如本发明关注的淀粉降解微生物功能 群。微生物功能群的研究在工业，农业，微生物治理，医学和基因工程方面均有重要的现实 意义。

研究微生物功能群其中重要的方法包括应用特定的选择培养基进行分离培养和计数。但 是该种方法在培养过程中主要面临三个问题：环境样品成分复杂，细菌众多，容易造成污染； 真菌生长速度太快，很快占领整个平板培养基，这样真菌之间的界限很难确定，不能准确计 数；真菌种类众多，不能直观的选择出目标微生物，例如产淀粉酶真菌。对于产淀粉酶真菌 的筛选，现有报道中的解决办法一般是分两步完成：先用含有细菌抗生素的真菌培养基如马 铃薯培养、查氏培养基、或者马丁氏琼脂培养基分离所有优势真菌，然后将分离到的真菌接 种到淀粉培养基进行鉴定。但是该种方法需要配制大量培养基，总培养时间长，工作量大。 对于产淀粉酶真菌的计数则少有报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有产淀粉酶真菌计数与筛选培养基的不足，提出一种对于产淀 粉酶真菌快速培养、分离计数与筛选的新型培养基，该种培养基是含细菌和真菌抗生素混合 的培养基，具有能完全抑制细菌生长，能一次对复杂环境中产淀粉酶真菌进行培养、分离、 计数，且配制简单，计数操作简单易行。

本发明新型培养基的配制与筛选步骤：

1、配制下述培养基

(1)配制S培养基(基础培养基)，其成分为NaNO₃2g，K2HP0₄1g，KCl 0.5g，MgSO₄0.5g， FeSO₄0.01g，可溶性淀粉10g，琼脂15g，曲利苯蓝0.1g，水1000mL；

配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加 入其他成分，溶化后补足水分至1000mL。121℃灭菌30min，待用。

(2)配制5种细菌抗生素培养基(共8种)

a)SC培养基(S培养基中加氯霉素至终浓度97.5mg/L)，

b)SK培养基(S培养基中加卡那霉素至终浓度分别为18μg/mL、36μg/mL、54μg/mL、 72μg/mL，分别编号为SK1、SK2、SK3、SK4。)，

c)SP培养基(S培养基中加氨苄青霉素至终浓度112.5mg/L)，

d)SS培养基(S培养基中加链霉素至终浓度30mg/L)，

e)ST培养基(S培养基中加四环霉素至终浓度30mg/L)。

(3)配制含细菌和真菌抗生素混合培养基(共16种)

在SK3培养基中加入制霉菌素溶液至终浓度分别为0.9μg/mL、1.8μg/mL、3.6μg/mL、 7.2μg/mL，编号为SK3N1、SK3N2、SK3N3，SK3N4；(4种)

在SK3培养基中加入酮康唑溶液至终浓度分别为2.5μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL， 编号为SK3K1、SK3K2、SK3K3；(3种)

在SK3培养基中加入两性霉素溶液至终浓度分别为0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20 μg/mL，编号为SK3A1、SK3A2、SK3A3；(3种)

在SK3培养基中加入灰黄霉素溶液至终浓度分别为0.3μg/mL、0.6μg/mL、1.2μg/mL， 编号为SK3G1、SK3G2、SK3G3；(3种)

在SK3培养基中加入克霉唑溶液至终浓度分别为1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL， 编号为SK3C1、SK3C2、SK3C3。(3种)

(4)配制其他培养基：在基础培养基(S)中按马丁氏琼脂培养基配方加入孟加拉红稀 释液至终浓度33mg/L，加入链霉菌素稀释液至终浓度30μg/mL。(1种)

2、白云边中温大曲样品的处理

取粉碎后的白云边中温大曲样品10g，置于装有90mL无菌水带玻璃珠的三角瓶中，在 37℃的摇床中(120r/min)，震荡30min。将处理好的样品，进行系列稀释，取10^-2、10^-3和 10^-4为最终涂布平板浓度。

3、真菌的培养与计数

3.1细菌抗生素种类的筛选

取活化的白云边中温大曲菌悬液10^-2、10^-3和10^-4三个梯度各100μL，在SC、SP、SS、 ST、SK3培养基上涂布平板，并S培养基平板为空白对照。每种处理3个重复。28℃培养。 每隔12h观察菌落形态，并计数。(共6*3*3＝54次)

对照培养基S上2～3d后长满细菌，数量大于为350个，如图1。而加入了细菌抗生素 的平皿培养基上细菌数目均为个位数，不影响真菌计数，说明该实验所加入的细菌抗生素均 能有效抑制细菌生长。在培养过程中，分离得到真菌一共有4种，其中1种数量占绝大数， 另外3种每个平皿培养基上仅有1～2个菌落。培养基SP、ST、SS、SC上菌落形态基本一致， 菌丝丝绒状，为白色，，贴附于培养基表面，菌落不规则，如图2、3、4、5；培养基SK3上 菌落在培养4d后仍较小且规则，如图6。因此，最优培养基为添加卡那霉素的培养基SK3。

3.2卡那霉素浓度的筛选

为筛选最适卡那霉素浓度取活化的白云边中温大曲菌悬液10^-2、10^-3和10^-4三个梯度各 100μL，在SK1、SK2、SK3、SK4培养基上涂布平板，S培养基平板为空白对照。每种处理3 个重复。28℃培养。每隔12h观察菌落形态，并计数。(共4*3*3＝36次)

对照组培养基S上1～2d后细菌布满平板如图7。培养3d后，SK1培养基平板上出现少 量细菌菌落，如图8；SK2、SK3、SK4培养基平板无细菌菌落出现，如图9-11。培养5d后， SK2和SK3培养基平板上真菌菌落菌落边缘清晰，形态较规则；培养基SK4上真菌数目仍较 少，到6～7d真菌数目接近35个。故培养基中抑制细菌生长的最适卡那霉素浓度为54μg/mL。

3.3真菌抗生素种类和浓度的筛选

为筛选最适真菌抗生素，取活化的白云边中温大曲菌悬液10^-2、10^-3和10^-4三个梯度各 100μL，分别在SK3N1--4、SK3K1--3、SK3A1--3、SK3G1--3和SK3C1--3培养基上涂布平板。 每种处理3个重复。28℃培养。每隔12h观察菌落形态，并计数。(共16*3*3＝144次) 2d后，SK3K1--2培养基平板上出现真菌。培养3d后，SK3K1--3培养基培养平板上真菌菌落 较小，丝状，难以计数，其中SK3K1培养基平板真菌菌落如图12。SK3C1--3培养基平板在 5d后真菌菌落仅有几个，其中SK3C1培养基平板如图13。SK3G1--3培养基平板培养近2d后 占据整个平板，其中SK3G3培养基平板真菌菌落生长如图14。SK3A1-3培养基平板在培养近 2d后开始出现真菌菌落，菌落较小，不规则，不容易计数,培养3d后SK3A1和SK3A3培养基 平板真菌菌落真菌生长如图15和图16。SK3N1-2培养基平板在2d后出现菌落，菌落为圆形 或椭圆形，菌丝贴附培养基表面。培养3d后，SK3N3培养基平板开始出现菌落。培养5d后， SK3N4培养基平板未出现真菌菌落，SK3N1--2培养基平板菌落数基本不变，菌落形态为圆形 或椭圆形，单个菌落容易辨认，SK3N3培养基平板上菌落数仍较少，只有十几个，SK3N2和 SK3N3培养基平板上真菌菌落如图17和图18。故最优真菌抗生素为制霉菌素，终浓度为0.9～ 1.8μg/mL。

综上得SK3N1、SK3N2培养基最佳，得到最佳抗生素处理为卡那霉素54μg/mL，制霉菌 素0.9～1.8μg/mL。

4.本发明培养基与其他培养基的对比

取活化的白云边中温大曲菌悬液10^-2、10^-3和10^-4三个梯度各100μL，在其他培养基和 SK3N2培养基上涂布平板，并以S培养基为空白对照，每种处理做三个重复。28℃培养，每 隔12h观察菌落形态，并计数。

S培养基培养1d后长满细菌，如图19，培养2d后菌落生长情况如图20。3d后出现真 菌菌落，菌落稀疏有重叠，不能计数，如图21。

其他培养基平板培养1d后，10^-2稀释度平板长满真菌，无法计数。10^-3稀释度平板菌落 较大，不规则，平均菌落数约为56，如图22。培养2d，10^-3稀释度平板菌落数增加，菌落变 大，菌落边缘重叠，不能很好计数，如图23。培养3d和5d平板菌落生长情况如图24和图 25。

本发明培养基SK3N2培养1d后，10^-2稀释度出现真菌菌落，平板平均菌落数为15个。 10^-3稀释度平板未出现菌落。培养2d稀释度为10^-2平板上真菌菌落变大，菌落数增加，但菌 落仍较规则。如图26。培养3d后菌落数增加不明显，真菌开始出现孢子，较容易区分真菌 种类。培养5d后，真菌菌落数不变，菌落形态规则，边缘清晰，其中10^-2稀释度平板平均菌 落数为90个。如图27。

本发明的基本原理和特点

本发明的培养基是采用含细菌和真菌抗生素混合培养基，能完全抑制复杂环境样品中细 菌生长，淀粉为唯一碳源保证在该培养基中生长真菌为产淀粉酶真菌，水解圈由曲利苯兰显 色从而可通过水解圈大小选择性的筛选产淀粉酶能力强的真菌，不需要纯化后再分离筛选， 操作简单，筛选周期短。

并且由于该种培养基上真菌菌落较小，菌丝较短，菌落与菌落重叠少，很方便对复杂环 境样品中产淀粉酶真菌计数，从而便于分析复杂环境样品中产淀粉酶真菌群落数量结构特 征。

附图说明

图1-6分别为S、SP、ST、SS、SC和SK3培养基平板在培养3d后菌落生长情况。

图7-11分别为S、SK1、SK2、SK3和SK4培养基平板在培养3d后菌落生长情况。

图12为SK3K1培养基平板在培养3d后菌落生长情况。

图13为SK3C1培养基平板在培养5d后菌落生长情况。

图14为SK3G3培养基平板在培养2d后菌落生长情况。

图15和16为SK3A1和SK3KA3培养基平板在培养3d后菌落生长情况。

图17和18为SK3N2和SK3N3培养基平板在培养5d后菌落生长情况。

图19、图20和图21为S培养基平板在培养1d、2d和3d后菌落生长情况。

图22、图23、图24和图25分别是其他培养基平板在培养1d、2d、3d和5d后菌落生 长情况。

图26和图27分别是SK3N2培养基平板在培养2d、5d后菌落生长情况。

具体实施例

实施例1配制含细菌和真菌抗生素混合培养基SK3N1

(1)S培养基(基础培养基)成分：NaNO₃2g，K₂HP0₄1g，KCl 0.5g，MgSO₄0.5g，FeSO₄0.01g，可溶性淀粉10g，琼脂15g，水1000mL，曲利苯蓝0.1g。

配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边 加入其他成分，溶化后补足水分至1000mL。121℃灭菌30min。

(2)加入卡那霉素至终浓度54mg/L，再加入制霉菌素溶液至终浓度为1.8μg/mL、配 制成含细菌和真菌抗生素混合培养基SK3N2，将其保存备用。

实施例2

选择复杂环境样品‐‐‐‐白云边中温大曲样品并处理

取粉碎后的白云边中温大曲样品10g，置于装有90mL无菌水带玻璃珠的三角瓶中，在 37℃的摇床中(120r/min)，震荡30min。将处理好的样品，进行系列稀释，取10^-2、10^-3和 10^-4为最终涂布平板浓度。

实施例3

真菌的培养与计数

取活化的白云边中温大曲菌悬液10^-2、10^-3和10^-4三个梯度各100μL，在SK3N1培养基 上涂布平板做3个重复。28℃培养。每隔12h观察菌落形态，并计数。

SK3N2培养基平板在1d后出现菌落，菌落为圆形或椭圆形，菌丝贴附培养基表面。培养 5d后，SK3N2培养基平板菌落数基本不变，菌落形态为圆形或椭圆形，单个菌落容易辨认。 真菌菌落较小，菌丝较短，菌落与菌落重叠少，很方便对复杂环境样品中产淀粉酶真菌计数， 从而便于分析复杂环境样品中产淀粉酶真菌群落数量结构特征。

SK3N2培养基完全抑制复杂环境样品中细菌生长，淀粉为唯一碳源保证在该培养基中生 长真菌为产淀粉酶真菌，水解圈由曲利苯兰显色从而可通过水解圈大小选择性的筛选产淀粉 酶能力强的真菌，不需要纯化后再分离筛选，操作简单，筛选周期短。