用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的小核酸分子、DNA 分子、蛋白及应用

摘要

本发明公开了一种用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的小核酸分子、DNA分子、蛋白及应用。该小核酸分子为埃博拉病毒感染细胞差异化表达的微小RNA的抑制物和/或微小RNA前体的抑制物，该抑制物能够上调微小RNA的靶基因的表达，从而提高细胞对埃博拉病毒感染的抵抗力。通过本发明所提供的用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的小核酸分子、DNA分子、蛋白及它们的应用，不但提供了预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热新的药物分子，而且为相关病毒性出血热药物的开发提供了新的研究方向。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的小核酸分子、DNA分子、蛋白以及应用。

背景技术

病毒性出血热泛指由数类病毒引起的、常伴以出血症状的一种严重疾病。按照病原分属四科，即沙粒病毒科（拉沙热、胡宁和普马拉）、布尼亚病毒科（克里米亚-刚果出血热、裂谷热、汉坦出血热)、线状病毒科（埃博拉和马尔堡）以及黄病毒科（黄热病、登革出血热、鄂木斯克出血热、基萨那森林病）。

以上各种病毒性出血热虽然在病原体、寄生宿主和传播途径上各有差异，但都具有发热、出血倾向及肾脏损害的主要临床特征，都属于急性病毒性传染病。目前均无特效疗法，采用对症和支持疗法，纠正水和电解质平衡，必要时补液、输血和抗休克治疗。

其中，埃博拉出血热因其病原体是埃博拉病毒，也叫埃博拉病毒病，是目前已知的毒性最大的病毒性疾病之一，病死率高达50－90%。目前已确定了埃博拉病毒的5个亚型：埃博拉-扎伊尔型（EBO-Zaire，ZEBO）、埃博拉-苏丹型（EBO-Sudan，SEBO）、埃博拉-莱斯顿型（EBO-R，REBO）和埃博拉-科特迪瓦型（EBO-CI，ICEBO），埃博拉-本迪布乌干达型（EBO-Bundibugyo Uganda，BEBO），其中ZEBO致病性最强。

埃博拉病毒可以通过接触传播，传播速度很快。患者一旦发病，可在24小时内死亡。主要症状可表现为高热、头痛、恶心、呕吐、腹泻、体内外大出血、全身酸痛等。它属于生物安全等级四级（BSL-4）的病毒，具有极高的生物危险性。

埃博拉病毒的宿主尚未确定，最初被认为是啮齿类动物，但实验后很快被否认。实验人员发现，感染病毒后的蝙蝠一般不会死亡，因此推断其传染源为带有病毒的蝙蝠及蝙蝠的排泄物。但这只是推测，是否为蝙蝠还有待确定。

从遗传角度来看，埃博拉病毒属于单股负链RNA病毒，其基因组约19kb，具有7个基因：NP、vp35、vp40、gp、vp30、vp24和L，其中NP，VP30，VP35和RNA依赖的RNA聚合酶构成病毒体的中心，即核糖核蛋白复合物，该复合物负责转录和复制。VP40和VP24负责核壳体的形成，病毒的出芽和包装以及决定宿主范围。在这些编码的蛋白质中，GP表面糖蛋白可能介导埃博拉病毒和靶细胞的结合和融合，在埃博拉出血热的发病机理中起非常重要的作用。将GP单独转到人源化细胞或其他几种非人源化细胞中，会导致细胞变圆、脱落，细胞表面粘附因子下调；将GP转入到人或猪血管中，会增加血管的通透性，从而导致血管出血。

但由于从血样中检测特异的抗原或病毒的基因，或通过细胞培养分离或者检测病毒的IgM和IgG抗体的实验都有严重的生物危害，必须在最大限度地保证生物安全的条件下才能进行，所以，到目前为止，商业上也没有针对病毒感染建立起特异的诊断方法。

在埃博拉出血热的治疗方面，一般的抗病毒药物包括利巴韦林和干扰素都对埃博拉病毒无效。尽管有实验显示，凝固干扰素在感染埃博拉病毒的猴群中似乎可以起一些作用，但凝固干扰素在人体的效果如何尚未确定。此外，目前也尚无对人类有效的疫苗，埃博拉出血热的康复者的血清也没有太大的作用，甚至有可能带来更坏的影响。目前的治疗仍以支持治疗为主，如使病毒的侵入最小化，或及时补充损失的血小板，平衡电解质，保持血液中氧元素含量以及对并发症的治疗等。现今唯一的治疗方法为注射NPC1阻碍剂，因埃博拉病毒需透过NPC1进入细胞核进行自我复制，NPC1蛋白于细胞间进行运输胆固醇，但阻碍剂会阻挡胆固醇的运输路线造成尼曼匹克症。因此，还需要通过更多更广泛的研究思路来寻找预防和治疗埃博拉出血热疾病方面的药物。

发明内容

本发明旨在提供一种用于预防和/或治疗出血热的小核酸分子、DNA分子、蛋白以及它们在药物筛选中的应用，并提供了一种预防和/或治疗出血热的药物研发的新思路。

需要说明的是，本发明是基于背景技术部分所提到的各种病毒性出血热所引起的血管结构和功能异常而导致的渗血、出血这一共同症状的前提下，通过大量研究而得到的结果。因此，本发明下面所提到的以埃博拉病毒为主要研究对象得到的能够抑制或缓解上述症状的各种物质也适用于上述其他病毒性出血热。

由于血管内皮细胞是埃博拉病毒的主要攻击的对象之一，血管内皮细胞在维持血管通透性和体液平衡方面发挥着重要作用，在埃博拉病毒感染血管内皮细胞后，通常引起血管结构和功能的异常，进而导致埃博拉出血热弥漫性血管内凝血（DIC）。由于人脐静脉（humanumbilical vein，HUV）是血管内皮细胞的常用来源，其供源丰富，取材方便，血管条件优越，混杂其他细胞较少，可获得细胞免疫原性较低的血管内皮细胞，可使实验条件和所获结果更符合人体情况。因此，本发明在进行血管内皮细胞实验时，选用人脐静脉血管内皮细胞作为细胞模型来进行研究。

根据本发明的一个方面，提供了一种用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的小核酸分子，该小核酸分子为埃博拉病毒感染细胞差异化表达的微小RNA的抑制物和/或该微小RNA前体的抑制物。

进一步地，上述小核酸分子是序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5或者SEQ ID NO.6的微小RNA及其前体的抑制物。

进一步地，上述小核酸分子的序列与SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.12具有80%以上的同源性，优选具有95%以上的同源性，更优选地，上述小核酸分子的序列为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、或者SEQ ID NO.12。

根据本发明的另一个方面，提供了一种上述小核酸分子在制备用于预防和/或治疗鄂木斯克出血热、基萨那森林病、克里米亚出血热、新疆出血热、登革出血热、基孔肯雅热、黄热病、阿根廷出血热、玻利维亚出血热、拉沙热、流行性出血热或者马尔堡病的药物中的应用。

根据本发明的又一个方面，提供了一种用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的药物，该药物包括治疗有效量的上述小核酸分子。

进一步地，上述药物进一步包括一种或多种用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热有效物质，优选地，上述用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热有效物质选自抗病毒类药物、免疫提升类药物及皮质激素类药物。

根据本发明的一个方面，提供了一种上述小核酸分子在体外抑制埃博拉病毒性出血热感染引起细胞生长脱落的应用，在细胞感染埃博拉病毒之前或之后，将上述小核酸分子转染至细胞中。

根据本发明的一个方面，提供了一种上述小核酸分子在体外筛选用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的药物中的应用，将上述小核酸分子与待测药物进行核酸同源性比对。

根据本发明的又一个方面，提供了一种DNA分子，上述DNA分子在埃博拉病毒感染细胞中的表达水平被上述一种或多种小核酸分子上调。

进一步地，上述DNA分子的序列与SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31或者SEQ ID NO.32具有80%以上的同源性，优选具有95%以上的同源性，更优选地，上述DNA分子的序列为SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31或者SEQ ID NO.32。

进一步地，上述DNA分子为序列为SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27或者SEQ ID NO.32，优选序列为SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.23或者SEQ ID NO.24。

根据本发明的又一个方面，提供了一种上述DNA分子在体外筛选用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的药物中的应用。

根据本发明的又一个方面，提供了一种上述DNA分子编码的蛋白，上述蛋白的序列与SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51或者SEQ ID NO.52具有80%以上的同源性，优选具有95%以上的同源性，更优选地，上述蛋白的序列为SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51或者SEQ ID NO.52。

进一步地，上述蛋白的序列为SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ IDNO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47或者SEQ ID NO.52，优选序列为SEQID NO.34、SEQ ID NO.43或者SEQ ID NO.44。

根据本发明的又一个方面，提供了一种上述蛋白在体外筛选用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的药物中的应用。

根据本发明的再一个方面，提供了一种用于检测埃博拉病毒性出血热的试剂盒，该试剂盒包括可特异性扩增上述小核酸分子所抑制的微小RNA的引物。

进一步地，当微小RNA的序列为SEQ ID NO.1时，逆转录引物序列为SEQ ID NO.140：GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCTGCT，荧光实时定量PCR所用到的引物：FP序列为SEQ ID NO.146：CCGCGCAATGGATTTTT，RP序列为SEQ ID NO.147：GTGCACGCTCCGAGGT；

当微小RNA的序列为SEQ ID NO.2时，逆转录引物序列为SEQ ID NO.141：GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCAAC，荧光实时定量PCR所用到的引物：FP序列为SEQ ID NO.148：CCGCGCTAGGTAGTTTCCT，RP序列为SEQ ID NO.149：GTGCACGCTCCGAGGT；

当微小RNA的序列为SEQ ID NO.3时，逆转录引物序列为SEQ ID NO.142：GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCGCCC，荧光实时定量PCR所用到的引物：FP序列为SEQ ID NO.150：TCGCGCAAAAGCTGG，RP序列为SEQ ID NO.151：GTGCACGCTCCGAGGT；

当微小RNA的序列为SEQ ID NO.4时，逆转录引物序列为SEQ ID NO.143：GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTAGA，荧光实时定量PCR所用到的引物：FP序列为SEQ ID NO.152：TCGCGCTCGAGGAGC，RP序列为SEQ ID NO.153：GTGCACGCTCCGAGGT；

当微小RNA的序列为SEQ ID NO.5时，逆转录引物序列为SEQ ID NO.144：GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAACC.，荧光实时定量PCR所用到的引物：FP序列为SEQ ID NO.154：TCGCGCTGGCAGTGT，RP序列为SEQ ID NO.155：GTGCACGCTCCGAGGT；

当微小RNA的序列为SEQ ID NO.6时，逆转录引物序列为SEQ ID NO.145：GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGCTGT，荧光实时定量PCR所用到的引物：FP序列为SEQ ID NO.156：TCGCGCTGCGGG，RP序列为SEQ ID NO.157：GTGCACGCTCCGAGGT。

根据本发明的再一个方面，提供了一种用于检测埃博拉病毒性出血热的试剂盒，该试剂盒包括可特异性扩增上述DNA分子的引物。

进一步地，当DNA分子的序列为SEQ ID NO.13时，引物的FP序列为SEQ ID NO.100：AAGCAGGATCTTCTAAGGTT，RP序列为SEQ ID NO.101：AGTGTTGTTCTTGGTCTCTC；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.14时，引物的FP序列为SEQ ID NO.102：GTCACTTGCTTCCTTACTTAG，RP序列为SEQ ID NO.103：TGAGCCATAACCACAGAG；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.15时，引物的FP序列为SEQ ID NO.104：ACCAATCAGTGCTCAGTAT，RP序列为SEQ ID NO.105：TCAACCTCCACATCTCTATC；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.16时，引物的FP序列为SEQ IDNO.106：TGGTCATCATCTGCTTGTG，RP序列为SEQ ID NO.107：TTCCTATTCGGTCACTCTCT；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.17时，引物的FP序列为SEQ ID NO.108：GGTAGAACTGAACAACGATAG，RP序列为SEQ ID NO.109：CAGCAATGGTATAGCAACTT；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.18时，引物的FP序列为SEQ ID NO.110：CGACGAACAGTAGACAGTATT，RP序列为SEQ ID NO.111：CAGCAATTCCATCTTCATCACT；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.19时，引物的FP序列为SEQ IDNO.112：CTAATTCTCCAGCCTCATTG，RP序列为SEQ ID NO.113：ATGGTAATCGTCCGTTCA；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.20时，引物的FP序列为SEQ ID NO.114：ACCATTAGTGTTGCTGAGA，RP序列为SEQ ID NO.115：GTGTGAAGTTGACCTGAATAG；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.21时，引物的FP序列为SEQ ID NO.116：GATTCTCTTCCACAGACTATATG，RP序列为SEQ ID NO.117：CCTTCCTCATCCAGTTCATG；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.22时，引物的FP序列为SEQ IDNO.118：TTCATCTCCGCTTCTTGTG，RP序列为SEQ ID NO.119：TGTTCTTCAGTGAGTTCCTT；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.23时，引物的FP序列为SEQ ID NO.120：GCCTGCTGCTTAATCTTG，RP序列为SEQ ID NO.121：CATCATCCGCCTTGAATG；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.24时，引物的FP序列为SEQ ID NO.122：AGGCAAGATAAGCAAGGAGAAG，RP序列为SEQ ID NO.123：AGGTCTATTCTGTGGATGTTCT；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.25时，引物的FP序列为SEQ IDNO.124：GAACCTCAGTGCCTACAACAC，RP序列为SEQ ID NO.125：GGAAGTCACCTCAGAGTCCAG；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.26时，引物的FP序列为SEQ ID NO.126：TTGCTCAGACCTTACACATAG，RP序列为SEQ ID NO.127：GCTTGGAGATGGCATATAAGA；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.27时，引物的FP序列为SEQ ID NO.128：CAGAACATACCACGACAAG，RP序列为SEQ ID NO.129：CTGGAAGGAGTAGAGGATGT；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.28时，引物的FP序列为SEQ ID NO.130：GAGCCTGAGACTTGTGTATC，RP序列为SEQ ID NO.131：CGTATTCTGGGAAGTGTTG；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.29时，引物的FP序列为SEQ IDNO.132：GGCGTGGTATCTGTCTGT，RP序列为SEQ ID NO.133：CTGTTGTGTCATCCTGTTC；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.30时，引物的FP序列为SEQ ID NO.134：TATCTGAAGGACGGTTCTGG，RP序列为SEQ ID NO.135：TTATCTCTGAGGTGGCATAC；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.31时，引物的FP序列为SEQ ID NO.136：GGTTGGTGTTGATTCAGAC，RP序列为SEQ ID NO.137：GCAGAGGCTTCAGATAGT；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.32时，引物的FP序列为SEQ IDNO.138：ATTAGCAAGAGTCCTCAGA，RP序列为SEQ ID NO.139：ATGGCGGAATAAGCAGATA。

应用本发明的技术方案，通过利用本发明的小核酸分子，能够抑制埃博拉病毒感染细胞差异化表达的微小RNA和/或微小RNA前体的表达，进而能够上调微小RNA的靶基因的表达，从而提高细胞对埃博拉病毒性出血热感染的抵抗力。通过本发明所提供的用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的小核酸分子、DNA分子、蛋白及它们的应用，不但提供了预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热新的药物分子，而且为相关病毒性出血热药物的开发提供了新的研究方向。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了示出了Ad-GP重组腺病毒上清及Ad-△E1重组腺病毒上清（对照病毒上清）感染人脐静脉血管内皮细胞不同时间点细胞存活率的情况；

图2示出了Ad-GP重组腺病毒上清及Ad-△E1重组腺病毒上清（对照病毒上清）感染人脐静脉血管内皮细胞不同时间点后提取的总RNA电泳图谱；

图3示出了Ad-GP重组腺病毒上清及Ad-△E1重组腺病毒上清（对照病毒上清）感染人脐静脉血管内皮细胞，分别在感染前24h转染微小RNA抑制剂，并在感染后48h进行MTS实验检测细胞的存活率；

图4示出了Ad-GP重组腺病毒上清及Ad-△E1重组腺病毒上清（对照病毒上清）感染人脐静脉血管内皮细胞，分别在感染后3h转染微小RNA抑制剂，并在感染后48h进行MTS实验检测细胞的存活率；

图5a、5b、5c示出了荧光定量PCR法验证微小RNA的抑制物能够上调靶基因的表达情况；

图6和图7a、7b示出了Ad-GP重组腺病毒上清及Ad-△E1重组腺病毒上清（对照病毒上清）感染人脐静脉血管内皮细胞，分别在感染前24h转染微小RNA抑制剂，并在感染后24h检测微小RNA靶基因蛋白的表达情况；其中，图6是蛋白杂交印迹图；图7a、7b是对图6中的统计学分析图；

图8a和图8b示出了微小RNA的类似物对海肾荧光素标记的野生型靶基因和突变靶基因的mRNA表达的影响；

图9示出了采用双链寡核苷酸干扰RNA方法降低微小RNA靶基因的表达会降低Ad-GP感染HUVEC细胞的存活率；

图10示出了采用过量表达的方法使微小RNA靶基因过量表达会显著降低GP过表达所致的细胞脱落漂浮的比率；以及

图11示出了采用过量表达的方法同时使多个不同微小RNA的靶基因过量表达会显著降低GP过表达所致的细胞脱落漂浮的比率。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

首先，需要声明的是，在本发明中，除有特殊说明外，所有涉及到DNA或RNA序列的，均是指从5’端到3’端的碱基序列。此外，在本发明中，FP表示正向引物，RP表示反向引物。

在本发明一种典型的实施方式中，提供了一种用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的小核酸分子，该小核酸分子为埃博拉病毒感染细胞差异化表达出的微小RNA的抑制物和/或其前体的抑制物。本发明所提供的小核酸分子是与现有技术中治疗和/或预防埃博拉病毒性出血热的药物作用机理完全不同的物质。细胞感染埃博拉病毒性出血热后引起细胞内微小RNA的表达量发生明显改变，通过本发明所提供的小核酸分子，能够直接与上述微小RNA序列互补而显著抑制大量表达的微小RNA。通过利用本发明的微小RNA的抑制物及其前体的抑制物，可以有效抑制感染埃博拉病毒性出血热的细胞中的微小RNA的表达，使得细胞变圆、脱落的现象明显减弱，进而使细胞的存活率显著提高，从而能够有效地治疗和/或预防埃博拉病毒性出血热。

由于微小RNA的成熟过程需要经过形成茎环结构的前体形式，然后经过剪切加工形成具有双链结构的微小RNA二聚体，但在发挥功能阶段还需要去除其中的正义链形成真正起到抑制靶基因功能的成熟微小RNA。因此，影响形成上述能够真正发挥抑制靶基因功能的成熟微小RNA的前体的抑制物也适用于本发明的上述小核酸分子。

本发明所提供的上述小核酸分子是指任何一个在细胞感染埃博拉病毒性出血热后表达量明显上升的微小RNA的抑制物。例如，埃博拉病毒包膜糖蛋白GP感染人脐静脉血管内皮细胞后表达量能够明显上调至少2倍的序列为SEQ ID NO.1的hsa-miR1246、SEQ ID NO.2的hsa-miR196b-5p、SEQ ID NO.3的hsa-miR320a、SEQ ID NO.4的hsa-miR151a-5p、SEQ ID NO.5的hsa-miR34a-5p或SEQ ID NO.6的hsa-miR744a，上述微小RNA的抑制物均属于本发明的上述小核酸分子。上述小核酸分子均能有效地抑制埃博拉病毒感染的细胞中相应微小RNA的表达，抑制细胞变圆脱落的现象，提高细胞的存活率。

此外，除了上述的表达量上调至少2倍的微小RNA外，在埃博拉病毒感染不同时间长度的细胞中还存在一些与细胞变圆脱落相关的差异表达的微小RNA，此处的差异表达是指表达量上调或下调至少2倍。比如序列为SEQ ID NO.53的hsa-miR-152、SEQ ID NO.54的hsa-miR-22-3p、SEQ ID NO.55的hsa-miR-424-5p、SEQ ID NO.56的hsa-miR-374a-5p、SEQ IDNO.57的hsa-miR-24-3p、SEQ ID NO.58的hsa-miR-222-3p、SEQ ID NO.59的hsa-miR-4521、SEQ ID NO.60的hsa-miR-15b-5p、SEQ ID NO.61的hsa-miR-93-5p、SEQ ID NO.62的hsa-miR-193a-5p、SEQ ID NO.63的hsa-miR-29a-3p或者SEQ ID NO.64的hsa-miR-29c-3p，这些微小RNA的差异表达也与埃博拉病毒感染细胞有关，表达量上调的用相关微小RNA的抑制物，通过抑制相关微小RNA的表达来证实其与埃博拉病毒感染表型之间的关系；表达量下调的用相关微小RNA的类似物，通过微小RNA的过量表达来证实其与埃博拉病毒感染之间的关系。因此，不论是上述差异表达微小RNA的抑制剂还是类似物，均适用于本发明。

在本发明一种优选的实施例中，上述小核酸分子为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或者SEQ ID NO.6的微小RNA的抑制物，在埃博拉病毒感染的细胞中抑制相应微小RNA的表达的作用更明显，细胞变圆脱落现象明显改善，进而更有效地提高了细胞的存活率。

上述微小RNA的抑制物能够通过与微小RNA序列互补从而抑制微小RNA与靶基因的序列进行互补，从而抑制了微小RNA对靶基因表达的抑制作用，使得靶基因的表达相对升高，进而提高了被感染细胞的存活率。对于微小RNA的抑制物，只要其部分序列能够与微小RNA的序列进行互补起到抑制微小RNA表达的功能的抑制物均可用于本发明。

在本发明一种优选的实施例中，上述小核酸分子的序列与SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.12具有80%以上的同源性，优选具有95%以上的同源性，更优选地，小核酸分子的序列为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.12。其中，SEQ ID NO.7为hsa-miR1246的抑制剂、SEQ ID NO.8为hsa-miR196b-5p的抑制剂、SEQ ID NO.9为hsa-miR320a的抑制剂、SEQ ID NO.10为hsa-miR151a-5p的抑制剂、SEQ ID NO.11为hsa-miR34a-5p的抑制剂以及SEQID NO.12为hsa-miR744a的抑制剂。

上述小核酸分子的序列具有与SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.12具有80%以上的同源性时能够很好地抑制与其序列部分互补的微小RNA的表达，从而抑制了细胞变圆脱落的表型，提高了埃博拉病毒感染细胞的存活率。上述小核酸分子的序列具有与SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.12具有95%以上的同源性时，抑制与其序列互补的微小RNA的表达的作用较强，使得微小RNA的表达下降的更多，进而提高埃博拉病毒感染细胞的存活率的作用较明显。当小核酸分子的序列为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.12时，其序列与微小RNA的序列完全互补，抑制微小RNA表达的作用更强，对提高埃博拉病毒感染的细胞的存活率的作用也更明显。

本领域技术人员熟知的是，引起病毒性出血热的病毒有13种，共同的特点是都能引起血管内皮细胞的出血。由于本发明的上述小核酸分子能够有效地抑制血管内皮细胞变圆脱落，使其受到的损伤更小，进而起到保护血管提高细胞存活率的功能，因此，本发明所提供的上述小核酸分子也适用于预防和/或治疗鄂木斯克出血热、基萨那森林病、克里米亚出血热、新疆出血热、登革出血热、基孔肯雅热、黄热病、阿根廷出血热、玻利维亚出血热、拉沙热、流行性出血热、马尔堡病或埃博拉病毒性出血热。

本发明的另一方面在于提供了一种用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的药物，该药物包括治疗有效量的上述小核酸分子。包含治疗有效量的上述小核酸分子的药物能够有效地抑制被埃博拉病毒感染的细胞中微小RNA的表达，从而提高被埃博拉病毒感染的细胞的存活率。

在本发明所提供的上述药物中，只要包括治疗有效量的上述小核酸分子的药物均可用于本发明，对于药物中的有效物质的种类并无特殊要求。在本发明一种优选的实施例中，上述药物进一步包括一种或多种用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热有效物质。包含一种或多种用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热有效物质的药物均能有效地预防和/或治疗病毒性出血热。在本发明又一种优选的实施例中，上述用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热有效物质选自抗病毒类药物、免疫提升类药物及皮质激素类药物。本发明选择上述有效物质对于受埃博拉病毒感染的细胞的损伤及脱落程度有明显的改善，同时能够更明显地提高细胞的存活率。

本发明的再一方面在于提供了上述小核酸分子在体外抑制埃博拉病毒感染导致细胞生长变圆脱落的应用，该应用是在细胞感染埃博拉病毒之前或之后将小核酸分子转染至细胞中。在埃博拉病毒基因组编码的7个蛋白中，GP蛋白的内源性表达导致细胞生长变圆脱落的表型最显著，因此，通常用GP蛋白来模拟埃博拉病毒体外感染细胞生长变圆脱落的实验。

在本发明上述应用中，优选上述小核酸分子在体外抑制埃博拉病毒糖蛋白GP感染细胞导致细胞生长变圆脱落的应用。将上述小核酸分子在细胞感染埃博拉病毒的糖蛋白GP之前转染至细胞中，能够在感染引起细胞中微小RNA表达上调时及时抑制微小RNA的表达，进而解除了微小RNA对其靶基因的抑制作用，使得靶基因能够大量表达，从而降低了埃博拉病毒糖蛋白GP导致的细胞变圆脱落的几率，同时提高了细胞抗埃博拉病毒糖蛋白GP的细胞毒性的能力，从而能够及时地防治埃博拉病毒的感染。

同理，在感染埃博拉病毒糖蛋白GP之后将小核酸分子转染至细胞中，是在引起细胞中微小RNA大量表达之后及时抑制其进一步的表达和微小RNA进一步对靶基因表达的抑制，进而提高了细胞在感染后对埃博拉病毒的细胞毒性的抵抗力，降低了细胞损伤程度，从而提高了细胞的存活率。

本发明另外还提供了一种上述小核酸分子在体外筛选用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的药物中的应用，该应用是将小核酸分子与待测药物进行核酸同源性比对。由于本发明所提供的上述小核酸分子能够很好地抑制被埃博拉病毒包膜糖蛋白GP引起的细胞变圆脱落的表型，提高感染细胞的抗感染能力，其作用机理在于该小核酸分子能够与被埃博拉病毒包膜糖蛋白GP所引起的表达上调的微小RNA的序列进行部分互补，进而抑制感染细胞内微小RNA的表达。因此，通过将该小核酸分子与待测药物进行核酸同源性比对，根据同源性越高越好的原则，便可在体外筛选用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的药物。

本发明的又一个方面提供了一种DNA分子，该DNA分子在埃博拉病毒感染细胞中的表达水平可被上述一种或几种小核酸分子上调。被上述一种或几种小核酸分子上调表达的DNA分子，即为相应微小RNA能够抑制的靶基因。这些微小RNA的靶基因的上调表达能够有效降低埃博拉病毒所致的细胞受损伤的程度，提高细胞对埃博拉病毒引起的细胞毒性的抵抗力，进而提高细胞的存活率。

在本发明所提供的上述DNA分子中，能够被上述一种或几种小核酸分子上调表达的有很多种，只要能够被上述的一种或几种小核酸分子上调表达同时又能降低埃博拉病毒导致的细胞受损伤的程度，提高细胞对埃博拉病毒感染的抵抗力，进而提高细胞的存活率的DNA分子均适用于本发明。在本发明一种优选的实施例中，上述DNA分子的序列与SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31或者SEQ ID NO.32具有80%以上的同源性，优选具有95%以上的同源性，更优选地，小核酸分子的序列为SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31或者SEQ ID NO.32。其中，DNA分子序列SEQ ID NO.13至SEQ ID NO.32对应的基因分别为：HLTF、DAG1、LAMA4、UBE2H、MCTP1、KIAA1249、SDCBP、CPD、FRMD6、SKIL、TFPI、CFLAR、DPP3、RCAN1、TRIM24、RPAIN、IP6K1、ESM1、SLC9A6、ZCCHC6。

在本发明所提供的上述优选的实施例中，上述DNA分子的序列与SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31或者SEQ ID NO.32具有80%以上的同源性。从生物进化的角度看，同源性越高的DNA分子之间具有相同或相似功能的可能性就比较高，属于功能保守的同源基因的可能性就比较大。因此，具有与上述序列的DNA分子具有80%以上同源性的DNA分子能够起到与具有上述序列的DNA分子相同或相似的抑制埃博拉病毒导致的细胞变圆脱落的表型，提高细胞抗埃博拉病毒感染的能力的可能性就比较大。

当本发明所提供的上述DNA分子的序列与SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31或者SEQ ID NO.32具有95%以上的同源性时，该DNA分子能够起到与具有上述序列的DNA分子相同或相似的抑制埃博拉病毒包膜糖蛋白GP导致的细胞变圆脱落的表型，提高细胞抗埃博拉病毒感染的能力的可能性就更大。

当本发明所提供的上述DNA分子的序列为SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31或者SEQ ID NO.32时，由于具有上述序列的DNA分子的表达受到上述小核酸分子的上调，其上调表达能够更加有效地抑制感染细胞变圆脱落的表型，进而更有效地提高细胞抗埃博拉病毒感染的能力。

本发明所提供的上述DNA分子的表达均能被上述小核酸分子明显上调至少2倍，都具有提高埃博拉病毒感染细胞的抗细胞毒性能力。在本发明一种典型的实施例中，上述DNA分子为序列为SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27或者SEQ ID NO.32，优选序列为SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.23或者SEQ ID NO.24。序列为SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.27或者SEQ ID NO.32的DNA分子，不仅在信使RNA表达水平上明显表现为上调；而且在蛋白表达水平上也明显被上调。序列为SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.23或者SEQ ID NO.24的DNA分子在信使RNA表达水平和蛋白表达水平上上调的程度更加明显，对于埃博拉感染细胞受损伤、脱落变圆具有更加显著的改善效果。

在本发明另一种典型的实施方式中，还提供了一种上述DNA分子在体外筛选用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的药物中的应用，该应用能够以上述DNA分子为对象在体外开展用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的药物筛选，能够使上述DNA分子表达上调的药物均适用于本发明。

本发明还提供了一种上述DNA分子编码的蛋白，该蛋白的序列与SEQ ID NO.33、SEQ IDNO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51或者SEQ ID NO.52具有80%以上的同源性，优选具有95%以上的同源性，更有选地，蛋白的序列为SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37、SEQID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51或者SEQ ID NO.52。

本发明所提供的上述DNA分子编码的蛋白，当其序列与SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51或者SEQ IDNO.52具有80%以上的同源性时，与具有上述序列的蛋白的同源性比较高，具有相同生物学功能的可能性就高。当上述DNA分子编码的蛋白的序列与上述序列具有95%以上的同源性时，其与具有上述序列的蛋白起到相同生物学功能的可能性就更高。具有上述序列的蛋白的表达被上述小核酸分子上调，其表达的上调能够更加明显地降低埃博拉病毒感染细胞受损伤的程度，提高细胞的存活率。其中，上述序列从SEQ ID NO.33至SEQ ID NO.52的蛋白分别由序列从SEQ ID NO.13至SEQ ID NO.32的DNA分子所编码。

在本发明一种优选的实施例中，上述蛋白的分子序列为SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47或者SEQ IDNO.52。分子序列为SEQ ID NO.34的DAG1蛋白、SEQ ID NO.38的KIAA1249蛋白、SEQ IDNO.40的CPD蛋白、SEQ ID NO.43的TFPI蛋白、SEQ ID NO.44的CFLAR蛋白、SEQ ID NO.46的RCAN1蛋白、SEQ ID NO.47的TRIM24蛋白或者SEQ ID NO.52的ZCCHC6蛋白过量表达之后对细胞抗埃博拉病毒感染的能力的提高有更显著的效果。进一步地优选序列为SEQ IDNO.34、SEQ ID NO.43或者SEQ ID NO.44的蛋白。

在本发明一种典型的实施方式中，还提供了一种上述DNA分子编码的蛋白在体外筛选用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的药物中的应用，该应用能够以上述蛋白为对象在体外开展用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的药物筛选，能够上调上述蛋白表达的药物亦可应用于治疗或预防埃博拉病毒性出血热。

本发明进一步提供了一种用于检测埃博拉病毒性出血热的试剂盒，该试剂盒包括可特异性扩增上述小核酸分子所抑制的微小RNA的引物。

在本发明所提供的上述试剂盒中，根据所要检测的微小RNA的不同，其所提供的用于特异扩增上述微小RNA分子的引物序列也不同。当微小RNA的序列为SEQ ID NO.1时，逆转录引物序列为SEQ ID NO.140：GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCTGCT，荧光实时定量PCR所用到的引物：FP序列为SEQ ID NO.146：CCGCGCAATGGATTTTT，RP序列为SEQID NO.147：GTGCACGCTCCGAGGT；当微小RNA的序列为SEQ ID NO.2时，逆转录引物序列为SEQ ID NO.141：GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCAAC，荧光实时定量PCR所用到的引物：FP序列为SEQ ID NO.148：CCGCGCTAGGTAGTTTCCT，RP序列为SEQ ID NO.149：GTGCACGCTCCGAGGT；当微小RNA的序列为SEQ ID NO.3时，逆转录引物序列为SEQ IDNO.142：GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCGCCC，荧光实时定量PCR所用到的引物：FP序列为SEQ ID NO.150：TCGCGCAAAAGCTGG，RP序列为SEQ ID NO.151：GTGCACGCTCCGAGGT；当微小RNA的序列为SEQ ID NO.4时，逆转录引物序列为SEQ IDNO.143：GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTAGA，荧光实时定量PCR所用到的引物：FP序列为SEQ ID NO.152：TCGCGCTCGAGGAGC，RP序列为SEQ ID NO.153：GTGCACGCTCCGAGGT；当微小RNA的序列为SEQ ID NO.5时，逆转录引物序列为SEQ IDNO.144：GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAACC.，荧光实时定量PCR所用到的引物：FP序列为SEQ ID NO.154：TCGCGCTGGCAGTGT，RP序列为SEQ ID NO.155：GTGCACGCTCCGAGGT；当微小RNA的序列为SEQ ID NO.6时，逆转录引物序列为SEQ ID NO.145：GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGCTGT，荧光实时定量PCR所用到的引物：FP序列为SEQ ID NO.156：TCGCGCTGCGGG，RP序列为SEQ ID NO.157：GTGCACGCTCCGAGGT。

本发明进一步提供了一种用于检测埃博拉病毒性出血热的试剂盒，该试剂盒包括可特异性扩增上述DNA分子的引物。利用本发明的试剂盒中提供的引物能够有效地扩增出埃博拉感染细胞中能被上述小核酸分子明显上调表达的DNA分子。

在本发明所提供的上述试剂盒中，根据所要检测的DNA分子的序列不同，其所提供的用于特异扩增上述DNA分子的引物序列也不同。当DNA分子的序列为SEQ ID NO.13时，引物的FP序列为SEQ ID NO.100：AAGCAGGATCTTCTAAGGTT，RP序列为SEQ ID NO.101：AGTGTTGTTCTTGGTCTCTC；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.14时，引物的FP序列为SEQ IDNO.102：GTCACTTGCTTCCTTACTTAG，RP序列为SEQ ID NO.103：TGAGCCATAACCACAGAG；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.15时，引物的FP序列为SEQ ID NO.104：ACCAATCAGTGCTCAGTAT，RP序列为SEQ ID NO.105：TCAACCTCCACATCTCTATC；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.16时，引物的FP序列为SEQ ID NO.106：TGGTCATCATCTGCTTGTG，RP序列为SEQ ID NO.107：TTCCTATTCGGTCACTCTCT；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.17时，引物的FP序列为SEQ IDNO.108：GGTAGAACTGAACAACGATAG，RP序列为SEQ ID NO.109：CAGCAATGGTATAGCAACTT；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.18时，引物的FP序列为SEQ ID NO.110：CGACGAACAGTAGACAGTATT，RP序列为SEQ ID NO.111：CAGCAATTCCATCTTCATCACT；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.19时，引物的FP序列为SEQ ID NO.112：CTAATTCTCCAGCCTCATTG，RP序列为SEQ ID NO.113：ATGGTAATCGTCCGTTCA；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.20时，引物的FP序列为SEQ ID NO.114：ACCATTAGTGTTGCTGAGA，RP序列为SEQ ID NO.115：GTGTGAAGTTGACCTGAATAG；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.21时，引物的FP序列为SEQ IDNO.116：GATTCTCTTCCACAGACTATATG，RP序列为SEQ ID NO.117：CCTTCCTCATCCAGTTCATG；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.22时，引物的FP序列为SEQ ID NO.118：TTCATCTCCGCTTCTTGTG，RP序列为SEQ ID NO.119：TGTTCTTCAGTGAGTTCCTT；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.23时，引物的FP序列为SEQ ID NO.120：GCCTGCTGCTTAATCTTG，RP序列为SEQ ID NO.121：CATCATCCGCCTTGAATG；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.24时，引物的FP序列为SEQ ID NO.122：AGGCAAGATAAGCAAGGAGAAG，RP序列为SEQ ID NO.123：AGGTCTATTCTGTGGATGTTCT；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.25时，引物的FP序列为SEQ IDNO.124：GAACCTCAGTGCCTACAACAC，RP序列为SEQ ID NO.125：GGAAGTCACCTCAGAGTCCAG；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.26时，引物的FP序列为SEQ ID NO.126：TTGCTCAGACCTTACACATAG，RP序列为SEQ ID NO.127：GCTTGGAGATGGCATATAAGA；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.27时，引物的FP序列为SEQ ID NO.128：CAGAACATACCACGACAAG，RP序列为SEQ ID NO.129：CTGGAAGGAGTAGAGGATGT；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.28时，引物的FP序列为SEQ ID NO.130：GAGCCTGAGACTTGTGTATC，RP序列为SEQ ID NO.131：CGTATTCTGGGAAGTGTTG；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.29时，引物的FP序列为SEQ IDNO.132：GGCGTGGTATCTGTCTGT，RP序列为SEQ ID NO.133：CTGTTGTGTCATCCTGTTC；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.30时，引物的FP序列为SEQ ID NO.134：TATCTGAAGGACGGTTCTGG，RP序列为SEQ ID NO.135：TTATCTCTGAGGTGGCATAC；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.31时，引物的FP序列为SEQ ID NO.136：GGTTGGTGTTGATTCAGAC，RP序列为SEQ ID NO.137：GCAGAGGCTTCAGATAGT；当DNA分子的序列为SEQ ID NO.32时，引物的FP序列为SEQ IDNO.138：ATTAGCAAGAGTCCTCAGA，RP序列为SEQ ID NO.139：ATGGCGGAATAAGCAGATA。

由于本发明所提供的小核酸分子、DNA分子以及DNA分子所编码的蛋白的变化与出血热的发病机制有关，因此，围绕上述分子可以展开各种诊断和/或治疗病毒性出血热的方法。

下面将结合具体的实施例来说明本发明的有益效果。

实施例一、构建细胞脱落模型

1.实验材料

人脐静脉血管内皮细胞Human umbilical vein endothelial cells(HUVEC;Science II)；293A细胞；

内皮细胞培养基（Endothelial Cell Medium，ECM）(Science II)：含5%胎牛血清(FBS，ScienceII,货号为0025)，1%内皮细胞生长添加剂(endothelial cell growth supplement，ECGS,Science II,货号为1052)和1%青霉素链霉素溶液（penicillin/streptomycin solution，P/S Science II,货号为0503)；

加入了巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）强启动子的经过序列改造的pEAK13质粒，该质粒上带有有氨卡青霉素和嘌呤霉素抗性基因，分别可用于原核细胞和真核细胞的筛选，含有NheⅠ、NotⅠ、BspHⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ多克隆酶切位点。

腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV；腺病毒骨架载体pAdEasy-1；

细胞培养皿；荧光显微镜。

2.实验方法

2.1）将序列为SEQ ID NO.65的埃博拉（扎伊尔型）病毒糖蛋白GP的基因序列插入pAdTrack-CMV质粒中，构建pAdTrack-CMV-GP质粒。

2.2）pAdTrack-CMV-GP质粒及不含GP的对照空载体与与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1重组，分别构建pAdTrack-CMV-GP/pAdEasy-1重组质粒（以下简称Ad-GP）和pAdTrack-CMV/pAdEasy-1重组质粒（以下简称Ad-△E1）。重组腺病毒构建具体步骤参照：Jinyong Luo,Zhong-Liang Deng,Xiaoji Luo，etal.A protocol for rapid generation of recombinant adenovirusesusing the AdEasy system.Nature.17May2007;doi:10.1038/nprot.2007.135。(注：腺病毒骨架质粒是腺病毒复制缺陷型质粒，即缺失E1基因区，简写为△E1)

2.3）细胞脱落模型的建立

a）将HUVEC用ECM重悬成单细胞溶液，种到12孔板，每孔10⁵个/mL细胞，每孔体积1ml；24h后分别加入等量的Ad-GP和Ad-△E1重组的腺病毒，感染复数（MOI）为500；

b）用荧光显微镜观察细胞形态的变化，从附图1中可以看出，在感染48h后，Ad-GP重组腺病毒感染的细胞组中近45%的细胞明显变圆、脱落，而Ad-△E1重组腺病毒感染的细胞组中并未受到明显的影响，长势良好。因此，GP蛋白所致的细胞脱落模型构建成功。

实施例二、寻找Ad-GP和Ad-△E1重组的腺病毒感染的HUVEC中差异表达的微小RNA

2.1.实验材料：同实施例一

2.2.实验方法

将HUVEC用ECM重悬成单细胞溶液，分为实验组和对照组，分别种到两个10cm板上，每孔10⁵个/ml细胞，每板体积10ml；

24小时后分别向实验组和对照组中加入等量的Ad-GP和Ad-△E1重组的腺病毒，感染复数（MOI）为500；

分别在感染3h，6h，12h，24h，36h，48h后用1ml Trizol（invitrogen）裂解细胞，提取总RNA（具体步骤参见Trizol使用操作指南）；

利用北京贝瑞和康生物技术有限公司的Illumina Hiseq2500对所提的总RNA进行高通量测序。为了分析Ad-GP和Ad-△E1重组的腺病毒感染的细胞中差异表达的基因，利用miRDeep软件分析测得的数据中每个转录本的RPM值，比较两组感染细胞的数据，筛选出在感染3h，6h，12h，24h，36h，48h中只要满足一个时间点上差异表达的倍数大于等于2的微小RNA，利用miRDB分析相应的靶基因，通过STRING数据库构建微小RNA-靶基因相互作用网络，结合基因功能注释，挑选处于网络关键节点的微小RNA。

2.3.实验结果

2.3.1总RNA的提取质量见图2，从图2中可以看出，实验组和对照组中总RNA提取的质量均较好，没有明显的RNA降解。

2.3.2利用生物信息学分析具有差异表达的微小RNA及其差异表达数据，具体见表1。

表1

实施例三、利用MTS实验检测候选微小RNA对细胞脱落的预防和/或治疗效果

3.1实验材料：除下列试剂外，其余同实施例一。

微小RNA的抑制物（广州锐博合成）

候选微小RNA的抑制物是人工合成的所有碱基被甲基化修饰的单链RNA，此实验使用的微小RNA的抑制物分别是：hsa-miR1246的抑制物序列为SEQ ID NO.7；hsa-miR196b-5p的抑制物序列为SEQ ID NO.8；hsa-miR320a的抑制物序列为SEQ ID NO.9；hsa-miR151a-5p的抑制物序列为SEQ ID NO.10；hsa-miR34a-5p的抑制物序列为SEQ ID NO.11；hsa-miR744a的抑制物序列为SEQ ID NO.12；对照抑制物序列为SEQ ID NO.66。

转染试剂：脂质体lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)；

细胞增殖与毒性检测试剂盒(MTS)（Promega）

3.2实验方法

3.2.1分组检测：

a.预防组

接种细胞：将HUVEC用ECM重悬成单细胞溶液，种到96孔板，每孔10⁵个/ml细胞，每孔体积100μl；37℃，5%CO₂孵箱培养细胞24h后转染候选微小RNA的抑制物，另设一组转染对照抑制物，培养基中抑制物的终浓度为100nM。转染4h后更换培养基；转染24h后分别加入等量的Ad-GP和Ad-△E1；48h后进行MTS实验检测细胞存活率。

b.治疗组

接种细胞：将HUVEC用ECM重悬成单细胞溶液，种到96孔板，每孔10⁵个/ml，每孔体积100μl；37℃，5%CO₂孵箱培养细胞24h后加入等量的Ad-GP和Ad-△E1；加毒感染3h后转染候选微小RNA的抑制物，另设一组转染对照抑制物，终浓度100nM；转染48h后进行MTS实验检测细胞存活率。

3.2.2细胞增殖与毒性检测试剂盒（MTS）实验检测

弃去96孔板中的ECM培养基；每孔加入100μl磷酸盐缓冲溶液（PBS，1升水中溶解8gNaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，pH值7.4）轻轻洗一遍细胞；弃去PBS，每孔加入100μl细胞培养基和20μl MTS混合液；37℃避光孵育1-2h，用酶标仪检测在490nm处的吸光值，同时检测在630nm处的吸光值（背景值）。

3.3实验结果

实验结果见附图3和附图4，附图3中的结果是利用表1中所列的微小RNA的抑制物重复四次实验后，挑出的效果比较明显的6个。从图3中可以看出，在预防组中，相比不能抑制微小RNA功能的序列号为SEQ ID NO.66的对照微小RNA抑制物，序列号为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的微小RNA的抑制物均能不同程度地预防细胞脱落，提高细胞的存活率。相应地，从图4中可以看出，在治疗组中，相比不能抑制微小RNA功能的对照微小RNA抑制物，序列号为SEQ ID NO.1、SEQID NO.3和SEQ ID NO.6的抑制物均能不同程度地抑制细胞脱落，提高细胞的存活率。由此说明，本发明所提供的上述微小RNA的抑制物都能够抑制埃博拉病毒感染细胞的脱落程度，显著提高细胞的存活率。

实施例四、微小RNA相应靶基因的确定

4.1.生物信息学方法预测靶基因

利用微小RNA靶基因预测软件miRDB预测实施例二中所找到的微小RNA的靶基因。在实施例二的高通量测序结果中寻找预测的靶基因，且重点寻找了实施例三中验证的对埃博拉病毒感染表型抑制比较明显的6个微小RNA的靶基因。具体挑选原则是：相比对照的重组腺病毒感染后靶基因的表达量，分别在加毒感染3h，6h，12h，24h时，计算log2（Ad-GP组靶基因表达量/Ad-△E1对照组靶基因表达量）的结果值（下述以log2表示），挑取上述4个时间点中任一时间点所取结果值的绝对值大于等于1的靶基因，即相比Ad-△E1对照组，Ad-GP感染组的表达量至少下降一半的靶基因挑选出来。其中，除了hsa-miR744没有显著性差异表达的靶基因外（即log2的绝对值小于1），其余5个小RNA的靶基因及表达量变化见表2。

表2

4.2实时定量PCR法验证微小RNA的抑制物能够上调靶基因的表达

4.2.1实验材料：除下列试剂外，其余同实施例一。

M-MLV逆转录试剂盒（Invitrogen，货号c28025）；荧光染料：LightCycler480MasterGreenⅠ（Roche，罗氏）；实时定量PCR仪（Roche，罗氏）；内参及靶基因引物序列见表3（广州瑞博公司合成），表3中从上到下的引物的序列为SEQ ID NO.98至SEQ ID NO.139。表3

GAPDH FP-SEQ ID NO.98GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACAGAPDH RP-SEQ ID NO.99GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGTHLTF FP-SEQ ID NO.100AAGCAGGATCTTCTAAGGTTHLTF RP-SEQ ID NO.101AGTGTTGTTCTTGGTCTCTCDAG1FP-SEQ ID NO.102GTCACTTGCTTCCTTACTTAGDAG1RP-SEQ ID NO.103TGAGCCATAACCACAGAGLAMA4FP-SEQ ID NO.104ACCAATCAGTGCTCAGTATLAMA4RP-SEQ ID NO.105TCAACCTCCACATCTCTATCUBE2H FP-SEQ ID NO.106TGGTCATCATCTGCTTGTGUBE2H RP-SEQ ID NO.107TTCCTATTCGGTCACTCTCTMCTP1FP-SEQ ID NO.108GGTAGAACTGAACAACGATAGMCTP1RP-SEQ ID NO.109CAGCAATGGTATAGCAACTTKIAA1429FP-SEQ ID NO.110CGACGAACAGTAGACAGTATTKIAA1429RP-SEQ ID NO.111CAGCAATTCCATCTTCATCACTSDCBP FP-SEQ ID NO.112CTAATTCTCCAGCCTCATTGSDCBP RP-SEQ ID NO.113ATGGTAATCGTCCGTTCACPD FP-SEQ ID NO.114ACCATTAGTGTTGCTGAGACPD RP-SEQ ID NO.115GTGTGAAGTTGACCTGAATAGFRMD6FP-SEQ ID NO.116GATTCTCTTCCACAGACTATATGFRMD6RP-SEQ ID NO.117CCTTCCTCATCCAGTTCATGSKIL FP-SEQ ID NO.118TTCATCTCCGCTTCTTGTGSKIL RP-SEQ ID NO.119TGTTCTTCAGTGAGTTCCTTTFPI FP-SEQ ID NO.120GCCTGCTGCTTAATCTTGTFPI RP-SEQ ID NO.121CATCATCCGCCTTGAATGCFLAR FP-SEQ ID NO.122AGGCAAGATAAGCAAGGAGAAGCFLAR RP-SEQ ID NO.123AGGTCTATTCTGTGGATGTTCTDPP3FP-SEQ ID NO.124GAACCTCAGTGCCTACAACACDPP3RP-SEQ ID NO.125GGAAGTCACCTCAGAGTCCAGRCAN1FP-SEQ ID NO.126TTGCTCAGACCTTACACATAGRCAN1RP-SEQ ID NO.127GCTTGGAGATGGCATATAAGATRIM24FP-SEQ ID NO.128CAGAACATACCACGACAAGTRIM24RP-SEQ ID NO.129CTGGAAGGAGTAGAGGATGTRPAIN FP-SEQ ID NO.130GAGCCTGAGACTTGTGTATCRPAIN RP-SEQ ID NO.131CGTATTCTGGGAAGTGTTGIP6K1FP-SEQ ID NO.132GGCGTGGTATCTGTCTGTIP6K1RP-SEQ ID NO.133CTGTTGTGTCATCCTGTTCESM1FP-SEQ ID NO.134TATCTGAAGGACGGTTCTGGESM1RP-SEQ ID NO.135TTATCTCTGAGGTGGCATACSLC9A6FP-SEQ ID NO.136GGTTGGTGTTGATTCAGACSLC9A6RP-SEQ ID NO.137GCAGAGGCTTCAGATAGTZCCHC6FP-SEQ ID NO.138ATTAGCAAGAGTCCTCAGAZCCHC6RP-SEQ ID NO.139ATGGCGGAATAAGCAGATA

4.2.2实验方法：

a）种细胞：将HUVEC用ECM重悬成单细胞溶液，种到6孔板中，每孔10⁵个/ml细胞，每孔体积2ml；

b）在37℃，5%的CO₂孵箱中培养24小时后，转染微小RNA抑制物和对照抑制物，终浓度100nM；

c）转染4小时后更换培养基；转染24小时后加入Ad-GP重组腺病毒；

d）分别在感染3h，6h，12h，24h用trizol裂解细胞收取细胞样品提取RNA；

e）逆转录：按照M-MLV逆转录试剂盒（Invitrogen）说明书，将1.0ug总RNA逆转录生成cDNA。

f）用Real-time PCR仪进行靶基因mRNA水平的检测，用看家基因GAPDH作为内参，每个基因设三个复孔，内参也为三个复孔，配制RT-PCR反应体系如下：2×SYBR GreenⅠmaster，10μl；ddH₂O，7μl；正向引物（10uM），1μl；反向引物（10uM），1μl；cDNA模板，1μl。反应程序为：①95℃，预变性5min；②95℃，变性10s，③55℃，复性10s，④72℃，延伸20s，循环②至④35次。

g）数据处理：在熔点曲线为单峰的情况下，数据处理即可开始。根据每次扩增DNA量约增加两倍来计算。在反应的前期，DNA量的扩增是呈对数扩增的，越早达到定量PCR仪的阈值Ct，说明模板量越大，通过内参较正后，即可比较目的基因的丰度。目的基因相对内参丰度=2^{-(Ct目的-Ct内参)}

h）利用GraphPad Prism作图软件做出柱状图并作t检验。

4.2.3实施定量PCR的检测结果

对实施例3中筛选出的6个微小RNA的抑制物对靶基因的上调情况进行了检测，每个微小RNA除了检测表2中自身对应的靶基因外，同时检测其余5个微小RNA所对应的靶基因，以检测单一靶基因是否被多个微小RNA抑制剂所上调，并对靶基因能够被微小RNA上调表达的程度进行显著性检验，*表示P<0.05时有显著性差异；**表示P<0.01时有显著性差异，具体每个基因上调表达的情况见附图5a、5b和5c。然后，将四个时间点中任一时间点能够被上述至少一种微小RNA抑制剂显著上调的靶基因挑选出来，总结在表4中。

表4

序号基因名称序号基因名称1HLTF11TFPI2DAG112CFLAR3LAMA413DPP34UBE2H14RCAN15MCTP115TRIM246KIAA124916RPAIN7SDCBP17IP6K18CPD18ESM19FRMD619SLC9A610SKIL20ZCCHC6

4.3蛋白水平上验证微小RNA的靶基因

4.3.1实验材料：除下列试剂外，其余材料同实施例一和实施例三。

一抗：抗HLTF兔多克隆抗体（abcam公司，编号为ab155031,稀释比例1/500）；

抗DAG1兔多克隆抗体（abcam公司,编号为ab105504，稀释比例1/1000）；

抗Laminin alpha4兔多克隆抗体（abcam公司，编号为ab69634，稀释比例1/200）；

抗Ube2H小鼠单克隆抗体（abcam公司，编号为ab58261，稀释比例1/1000）；

抗MCTP1兔多克隆抗体（abcam公司，编号为ab83673，稀释比例1/500）；

抗KIAA1429兔多克隆抗体（abcam公司，编号为ab11011，稀释比例1/1500）；

抗CPD兔多克隆抗体（abcam公司，编号为ab153874，稀释比例1/500)；

FRMD6兔多克隆抗体（abcam公司，编号为ab121133，稀释比例1/500)；

抗TRIM24兔多克隆抗体（abcam公司，编号为ab70560，稀释比例1/1000)；

抗RPAIN小鼠多克隆抗体（abcam公司，编号为ab88660，稀释比例1/500)；

抗IP6K1兔多克隆抗体（abcam公司，编号为ab96210，稀释比例1/500）；

抗ESM1兔多克隆抗体（abcam公司，编号为ab103590，稀释比例1/200）；

抗SLC9A6小鼠单克隆抗体（abcam公司，编号为ab77110，稀释比例/200)；

抗ZCCHC6小鼠多克隆抗体（abcam公司，编号为ab76901，稀释比例1/200）；

抗SDCBP兔单克隆抗体（pitomics公司，编号为RabMAb5913-1，稀释比例1/2000)；

抗TFPI兔单克隆抗体（epitomics公司，编号为RabMAb5853-1，稀释比例1/1000)；

抗DPP3兔单克隆抗体（epitomics公司，编号为RabMAb6523-1，稀释比例1/2000)；

抗RCAN1兔单克隆抗体（epitomics公司，编号为RabMAb6846-1，稀释比例1/1000)；

抗SKIL兔多克隆抗体（CST公司，编号为cst4973，稀释比例1/200）；

抗CFLAR兔单克隆抗体（epitomics公司，编号为cst8510，稀释比例1/500）。

4.3.2实验方法

a）种细胞：将HUVEC用ECM重悬成单细胞溶液，种到12孔板中，每孔10⁵个/ml细胞，每孔体积1ml;

b）37℃，5%的CO₂孵箱中培养24小时后，转染微小RNA抑制物和对照抑制物，抑制物的终浓度为100nM；

c）转染4小时后更换培养基；转染24小时后加入Ad-GP和Ad-△E1；

d）感染后24h用细胞裂解液裂解细胞收取细胞蛋白样品；

e）利用BCA蛋白质定量试剂盒（天根，PA115）将样品蛋白浓度调成一致；

f)）加入等体积的2×SDS加样缓冲液，95℃变性10分钟，放回冰上；

g）将蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）凝胶电泳；

h）显影检测蛋白表达情况，用密理博（millipore）ECL显色液，发光时间约为10分钟。

4.3.3实验结果

从附图6及附图7a、7b上可以看出，微小RNA抑制物可以抑制相关微小RNA的表达，使得其对应的靶基因编码的蛋白表达被上调。其中，序列号为SEQ ID NO.34的DAG1蛋白、序列号为SEQ ID NO.38的KIAA1429蛋白、序列号为SEQ ID NO.40的CPD蛋白、序列号为SEQ ID NO.43的TFPI、序列号为SEQ ID NO.44的CFLAR蛋白、序列号为SEQ ID NO.46的RCAN1蛋白、序列号为SEQ ID NO.47的TRIM24蛋白以及序列号为SEQ ID NO.52的ZCCHC6蛋白被明显上调。由此可进一步确定，这些基因是受其相应的微小RNA调控的，并且也参与GP导致细胞变圆、脱落过程的。因此，以这些蛋白为对象在体外进行预防和/或治疗埃博拉病毒感染药物的筛选应用中，只要能够上调上述蛋白表达的药物均可以有效地减弱埃博拉病毒感染后细胞变圆脱落的表型，提高细胞的存活率。

4.4体内实验验证微小RNA所调控的靶基因

4.4.1实验材料：除下列试剂外，其余材料同实施例一。

双荧光素酶报告系统（dual luciferae reporter assay system，promega）；人胚肾293T细胞；良伊格尔培养基培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM，Gibco，加入10%（v/v）胎牛血清，青霉素(100U/ml)和链霉素（100mg/ml）；转染试剂：脂质体lipofectamine2000（invitrogen）；双荧光素酶报告质粒psiCHEC-2（上海生工）

4.4.2实验方法

a）种细胞：用DMEM将293T细胞配制成单细胞溶液，种到24孔板中，每孔10⁵/mL个细胞，每孔体积500μl；

b）37℃，5%CO₂孵箱培养24小时后转染微小RNA的类似物，对照组转入对照类似物，转染6小时后更换培养基。此处，微小RNA的类似物及对照类似物均为双链RNA序列，其中微小RNA hsa-miR1246、hsa-miR320a、hsa-miR196b-5p和hsa-miR34a-5p的类似物的正义链（sense strand）序列分别为SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69以及SEQ ID NO.70，对照类似物的正义链序列为SEQ ID NO.71，所有类似物的反义链序列均与其对应的正义链序列碱基互补配对。

c）转染24h后转染对应的双荧光素酶报告质粒，该质粒同时包含靶基因3’-UTR，海肾荧光报告基因和萤火虫荧光报告基因，其中萤火虫荧光报告基因作为转染效率的内部参考。对照组转入3’-UTR突变质粒，实验组转入3’-UTR野生型质粒，48h后检测海肾荧光素酶活性。微小RNA对应的靶基因的野生型3’-UTR序列与对应的突变型3’-UTR序列信息见表5。

表5

序列号微小RNA调控的靶基因的3'UTR类型SEQ ID NO.72hsa-miR1246-ZCCHC6-野生型SEQ ID NO.73hsa-miR1246-ZCCHC6-突变型SEQ ID NO.74hsa-miR1246-CFLAR-野生型SEQ ID NO.75hsa-miR1246-CFLAR-突变型SEQ ID NO.76hsa-miR320-TFPI-野生型SEQ ID NO.77hsa-miR320-TFPI-突变型SEQ ID NO.78hsa-miR320-CPD-野生型SEQ ID NO.79hsa-miR320-CPD-突变型SEQ ID NO.80hsa-miR320a-KIAA1429-野生型SEQ ID NO.81hsa-miR320a-KIAA1429-突变型SEQ ID NO.82hsa-miR320a-DAG1-野生型SEQ ID NO.83hsa-miR320a-DAG1-突变型SEQ ID NO.84hsa-miR196b-TFPI-野生型SEQ ID NO.85hsa-miR196b-TFPI-突变型SEQ ID NO.86hsa-miR34-RCAN1-野生型SEQ ID NO.87hsa-miR34-RCAN1-突变型

4.4.3实验结果

由于微小RNA主要通过作用于靶基因的3’UTR发挥抑制靶基因的功能，可以将目的基因3’UTR区域构建至载体中报告基因海肾荧光素酶的后面，通过比较干扰微小RNA后，报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映微小RNA对目的基因的抑制作用；结合定点突变等方法可以进一步确定微小RNA与靶基因3’UTR的作用位点。

附图8a和图8b中显示了正义链序列为SEQ ID NO.67的双链hsa-miR-1246的类似物能够很显著地抑制靶基因序列为SEQ ID NO.24的CFLAR和序列为SEQ ID NO.32的ZCCHC6的表达，而当这两个基因的3’-UTR发生突变时，hsa-miR-1246的类似物就不再能抑制这两个基因的表达。同理，正义链序列为SEQ ID NO.68的双链hsa-miR-320a的类似物能够明显抑制序列分别为SEQ ID NO.23的TFPI、SEQ ID NO.14的DAG1、SEQ ID NO.20的CPD以及EQ IDNO.18的KIAA-1429四个基因的表达，而当这四个基因的3’-UTR发生突变时，hsa-miR-320a的类似物对这四个基因的抑制作用就表现的不明显。正义链序列为SEQ ID NO.69的双链hsa-miR196b-5p的类似物能够明显抑制序列为SEQ ID NO.23的TFPI的基因表达，而当TFPI基因的3’-UTR发生突变时，hsa-miR-196b-5p的类似物对这个基因的抑制作用就表现的不明显。正义链序列为SEQ ID NO.70的双链hsa-miR-34a的类似物能明显抑制序列为SEQ IDNO.26的RCAN1基因的表达，而当RCAN1基因3’-UTR发生突变时，hsa-miR-34a的类似物就不能明显表现出对RCAN1基因的抑制作用。

实施例五、确定靶基因与细胞脱落表型之间的关系

5.1用双链寡核苷酸RNA降低靶基因的表达验证靶基因促进细胞脱落方面的作用

5.1.1实验方法

a）将HUVEC用ECM重悬成单细胞溶液，种到96孔板中，每孔10⁵个/ml细胞，每孔体积100μl；

b）37℃，5%CO₂孵箱培养24h后转染靶基因DAG1、TFPI以及CFLAR的双链寡核苷酸干扰RNA，对照组转入对照双链寡核苷酸干扰RNA，终浓度100nM，转染4h后更换培养基；

靶基因DAG1中RNA干扰的靶序列为SEQ ID NO.88，其双链寡核苷酸干扰RNA的正义链的序列为SEQ ID NO.89，反义链从3’端到5’端的序列为SEQ ID NO.90（广州锐博合成，产品编号为：siG000001605B）。

靶基因TFPI中RNA干扰的靶序列为SEQ ID NO.91，其双链寡核苷酸干扰RNA的正义链的序列为SEQ ID NO.92，反义链从3’端到5’端的序列为SEQ ID NO.93（广州锐博合成，产品编号为：siG000007035C）。

靶基因CFLAR中RNA干扰的靶序列为SEQ ID NO.94，其双链寡核苷酸干扰RNA的正义链的序列为SEQ ID NO.95，反义链从3’端到5’端的序列为SEQ ID NO.96（广州锐博合成，产品编号为：siG000008837A）。

对照双链寡核苷酸干扰RNA的靶序列为SEQ ID NO.158：TTCTCCGAACGTGTCACGT。正义链序列的末尾两位碱基为dTdT，其余碱基序列SEQ ID NO.159为UUCUCCGAACGUGUCACGU，反义链3’至5’的前两位碱基为dTdT，其余碱基的序列SEQ IDNO.160为AAGAGGCUUGCACAGUGCA（广州锐博合成）。

其中，上述双链寡核苷酸干扰RNA的正义链和反义链的3’末端的最后两位核苷酸为dTdT序列，以减少细胞内降解。

c）转染24h后加入等量的Ad-GP和Ad-△E1，48h后进行MTS实验检测细胞存活率。

5.1.2实验结果

由于小干扰RNA设计的有效性不能完全预知，部分微小RNA的小干扰RNA容易由于设计的原因，对靶基因的降低效果不明显，在附图9中没有示出，附图9中仅显示了能明显降低靶基因表达的小干扰RNA及对应的靶基因经过MTS试验后检测到的细胞的存活率。从附图9中可以看出，TFPI、DAG1、CFLAR对应的双链寡核苷酸干扰RNA均能显著降低相应靶基因的表达量，而当上述三个蛋白表达被降低后，相应的细胞的存活率就明显下降了，说明上述6个微小RNA的靶基因中，至少这三个基因的表达显著降低后，相应的Ad-GP组感染后的细胞脱落程度加剧，细胞的存活率下降。

5.2用过量表达靶基因的方法验证靶基因在抑制细胞脱落方面的作用

5.2.1实验材料：除下列材料外，其余同其他实施例

人胚肾293T细胞；良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM，Gibco，加入10%（v/v）胎牛血清，青霉素（100U/ml)和链霉素(100mg/ml）；靶基因过表达质粒分别为：Peak13-TFPI-flag，Peak13-DAG1-flag，Peak13-CFLAR-flag；GP以及GP缺失导致细胞脱落的关键毒性区域的质粒即GP-△mucin表达质粒同实施例一；转染试剂脂质体lipofectamine2000；血球计数板。

5.2.2实验方法

a）用DMEM将293T细胞配成单细胞溶液，种到12孔板，每孔10⁵/mL个细胞，每孔体积1ml；

b）培养24h后共同转染序列为SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.24的靶基因表达质粒和GP表达质粒或序列为SEQ ID NO.97的GP-△mucin（即GP缺失mucin区域，文献研究报道此区域是GP导致细胞脱落的关键毒性区域）的表达质粒，对照组共同转染peak13-GFP表达质粒和GP表达质粒或序列为SEQ ID NO.97的GP-△mucin表达质粒，4小时后更换培养基；

c）转染48h后对漂浮细胞进行计数分析。

5.2.3实验结果

附图10中显示了靶基因TFPI、DAG1和CFLAR被过量表达后，过表达组的细胞的脱落程度被明显缓解，说明这三个靶基因表达上调后可以明显抑制埃博拉病毒包膜糖蛋白GP导致的细胞变圆脱落的表型，从而提高细胞的存活率。此外，附图11中还显示了不同靶基因相互组合过表达后对细胞的脱落程度的缓解情况，表明这三个靶基因之间的不同组合也能够抑制埃博拉病毒包膜糖蛋白GP导致的细胞变圆脱落的表型，从而提高细胞的存活率。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。