噻二唑类化合物在抑制藻类生长以及酶的活性中的应用以及用于抑制藻类生长的杀藻剂

摘要

本发明涉及农药领域，公开了式(1)所示的噻二唑类化合物在抑制藻类生长和抑制藻类果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶的活性中的应用，以及公开了一种用于抑制藻类生长的杀藻剂，该杀藻剂的活性成分为至少一种式(1)所示的噻二唑类化合物，以所述杀藻剂的总重量计，所述活性成分的含量为0.1-100重量％。本发明所述的噻二唑类化合物在抑制藻类的生长时具有抑制率高、毒性小的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及农药领域，具体地，涉及噻二唑类化合物在抑制藻类生长中 的应用、噻二唑类化合物在抑制藻类果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶的活 性中的应用以及用于抑制藻类生长的杀藻剂。

背景技术

近年来，各地不断大规模暴发藻类水华事件，藻害直接影响周边地区生 活用水和工业用水，严重破坏生态环境，给渔业生产和旅游业发展带来巨大 的经济损失，也给公众健康带来极大隐患。

使用化学杀藻剂具有经济、高效、方便以及起效快等优点，一直是藻害 综合治理体系中不可缺少的重要组成部分，尤其是在藻类水华大规模暴发期 间，更是短期快速治理和控制藻害等紧急情况最主要的防治手段。

现有的化学杀藻剂主要有以硫酸铜及其络合物为代表的重金属化合物 类杀藻剂；以高锰酸钾、高铁酸盐、过氧化物为代表的强氧化剂类杀藻剂； 以三唑啉酮类、三嗪类等为代表的除草剂类杀藻剂等。但是这些杀藻剂存在 选择性差、用量大、对水中的鱼类等动物毒性较大等问题，极大地限制了使 用化学方法防治藻害的效能的充分发挥。

因此，选择性差、毒性大、藻类抗性日益增强是现代化学杀藻剂创制研 究中亟待解决的一个非常重要的问题。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的杀藻剂选择性差、毒性大、藻类抗性日 益增强的缺陷，提供一种用于抑制藻类生长的杀藻剂以及噻二唑类化合物在 抑制藻类生长中的应用。本发明所述的噻二唑类化合物在抑制藻类的生长时 具有抑制率高、毒性小以及选择性高的优点。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供式(1)所示的噻二唑类化 合物在抑制藻类生长中的应用，

其中，

R₁、R₁'、R₂、R₂'、R₃、R₃'、R₄、R₄'、R₅和R₅'分别独立地选自氢、卤素、 烷基、烷氧基、羟基、三氟甲基和硝基。

第二方面，本发明提供式(1)所示的噻二唑类化合物在抑制藻类果糖 -1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶的活性中的应用，

其中，R₁、R₁'、R₂、R₂'、R₃、R₃'、R₄、R₄'、R₅和R₅'的限定如本发明前 述式(1)所示的噻二唑类化合物在抑制藻类生长中的应用中所述。

第三方面，本发明提供一种用于抑制藻类生长的杀藻剂，该杀藻剂的活 性成分为至少一种式(1)所示的噻二唑类化合物，以所述杀藻剂的总重量 计，所述活性成分的含量为0.1-100重量％，

其中，R₁、R₁'、R₂、R₂'、R₃、R₃'、R₄、R₄'、R₅和R₅'的限定如本发明前 述式(1)所示的噻二唑类化合物在抑制藻类生长中的应用中所述。

采用本发明所述的式(1)所示的噻二唑类化合物抑制藻类的生长时具 有抑制率高、毒性小以及选择性高的优点。

将本发明所述的式(1)所示的噻二唑类化合物作为杀藻剂的有效成份 运用于藻类水华的综合治理中时能够显示出高效且显著的杀藻效果。

本发明所述的式(1)所示的噻二唑类化合物作为杀藻剂的活性成分使 用时，将上述化合物与水体中允许的载体或稀释剂混合可调制成通常使用的 各种剂型，如水合剂、乳剂、水溶剂、可流动剂等，作为本发明所述的杀藻 剂使用，使用本发明的杀藻剂能够特定地杀死藻类植物而不会对水体中的其 它生物的正常生活产生影响。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

一方面，本发明提供了式(1)所示的噻二唑类化合物在抑制藻类生长 中的应用，

其中，

R₁、R₁'、R₂、R₂'、R₃、R₃'、R₄、R₄'、R₅和R₅'分别独立地选自氢、卤素、 烷基、烷氧基、羟基、三氟甲基和硝基。

在本发明中，所述R₁和R₁'可以相同或不同，各自独立地选自氢、卤素、 烷基、烷氧基、羟基、三氟甲基和硝基。所述R₂和R₂'可以相同或不同，各 自独立地选自氢、卤素、烷基、烷氧基、羟基、三氟甲基和硝基。所述R₃和R₃'可以相同或不同，各自独立地选自氢、卤素、烷基、烷氧基、羟基、 三氟甲基和硝基。所述R₄和R₄'可以相同或不同，各自独立地选自氢、卤素、 烷基、烷氧基、羟基、三氟甲基和硝基。所述R₅和R₅'可以相同或不同，各 自独立地选自氢、卤素、烷基、烷氧基、羟基、三氟甲基和硝基。

在本发明中，所述卤素包括氟、氯、溴和碘。

在本发明中，所述烷基包括碳原子数为1-18的直链烷基和碳原子数为 3-18的支链烷基。

在本发明中，所述烷氧基包括碳原子数为1-18的直链烷氧基和碳原子 数为3-18的支链烷氧基。

在本发明中，碳原子数为1-18的直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、 正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十二烷基、 正十四烷基和正十六烷基中的至少一种。特别地，本发明所述的C1-C18的 直链烷基中的碳原子上的氢可以由包括卤素在内的非碳原子基团取代。

在本发明中，碳原子数为3-18的支链烷基中的碳原子上的氢可以由包 括卤素在内的非碳原子基团取代。

在本发明中，碳原子数为1-18的直链烷氧基包括甲氧基、乙氧基、正 丙氧基、正丁氧基、正戊氧基、正己氧基、正庚氧基、正辛氧基、正壬氧基、 正癸氧基、正十二烷氧基、正十四烷氧基和正十六烷氧基中的至少一种。

特别优选情况下，在本发明所述的应用中，所述式(1)所示的噻二唑 类化合物选自表1中的化合物中的至少一种：

表1

化合物 R₁和R₁' R₂和R₂' R₃和R₃' R₄和R₄' R₅和R₅' I-1 H H H H H I-2 H H -CH₃H H I-3 H -CH₃H H H I-4 H H -OCH₃H H I-5 H H F H H I-6 H H Cl H H I-7 H Cl H H H I-8 H Cl Cl H H I-9 Cl H H -CF₃H

特别地说明，表1中的各个化合物具有式(1)所示的结构通式：

在本发明所述的应用中，相对于每1×10⁶个藻类，优选所述式(1)所 示的噻二唑类化合物的用量为1×10^-10-5微摩尔；更优选所述式(1)所示 的噻二唑类化合物的用量为5×10^-8-1微摩尔，特别优选为1×10^-5-5×10^-2 微摩尔。

根据本发明所述的应用，本发明所述的应用可以针对所有类型的藻类， 特别优选情况下，本发明的藻类包括赤藻和蓝藻。

更优选情况下，在本发明，所述蓝藻包括集胞藻PCC 6803、鱼腥藻、 节球藻、念珠藻和铜绿微囊藻912中的至少一种。

另一方面，本发明提供式(1)所示的噻二唑类化合物在抑制藻类果糖 -1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶的活性中的应用，

其中，R₁、R₁'、R₂、R₂'、R₃、R₃'、R₄、R₄'、R₅和R₅'的限定如本发明前 述式(1)所示的噻二唑类化合物在抑制藻类生长中的应用中所述。

在本发明中，需要特别说明的是，本发明上述描述的式(1)所示的噻 二唑类化合物在抑制藻类生长中的应用中所涉及的内容全部引用在本发明 所述的噻二唑类化合物在抑制藻类果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶的活 性中的应用中，为了避免重复，本发明在此不再一一赘述。

另一方面，本发明还提供了一种用于抑制藻类生长的杀藻剂，该杀藻剂 的活性成分为至少一种式(1)所示的噻二唑类化合物，以所述杀藻剂的总 重量计，所述活性成分的含量为0.1-100重量％，

其中，

R₁、R₁'、R₂、R₂'、R₃、R₃'、R₄、R₄'、R₅和R₅'分别独立地选自氢、卤素、 烷基、烷氧基、羟基、三氟甲基和硝基。

在本发明中，需要特别说明的是，本发明上述描述的式(1)所示的噻 二唑类化合物在抑制藻类生长中的应用中所涉及的内容全部引用在本发明 所述的用于抑制藻类生长的杀藻剂中，为了避免重复，本发明在此不再一一 赘述。

优选情况下，在本发明所述的用于抑制藻类生长的杀藻剂中，所述活性 成分的含量为1-90重量％。

根据本发明所述的用于抑制藻类生长的杀藻剂，优选所述杀藻剂的剂型 为水合剂、粉剂、乳剂、悬浮剂和粒剂。

在本发明中，对应用所述噻二唑类化合物的环境条件没有特别的限定， 可以在本领域内常规的各种条件下使用。

在本发明中，对所述式(1)所示的噻二唑类化合物的制备方法没有特 别的限定，本领域技术人员可以根据本领域内已知的各种方法制备本发明所 述的式(1)所示的噻二唑类化合物。特别地，本发明中所述的式(1)所示 的噻二唑类化合物可以采用文献(文献1：四川师范大学学报，2005,28(4)， 456-457；文献2：湖南化工，1999，29(3)：29-30，33)提供的方法制备 得到。

本发明示例性地列出可以采用如下方法制备式(1)所示的噻二唑类化 合物：

将3,5-二巯基-1,2,4-噻二唑与氯乙酸钠在碱性条件下反应，然后进行酸 化得到式(2)所示的中间体，然后将式(2)所示的中间体与苯环上具有不 同取代基的式(3)所示的化合物和/或式(4)所示的化合物在脱水剂二环己 基碳二亚胺(DCC)以及氩气(Ar)保护下反应，经后处理即可得到相应的 式(1)所示的目标产物。

在上述方法中，所述后处理的方法为本领域技术人员所公知，例如可以 采用将反应完成后获得的反应液倒入水中除去副产物，并且析出目标产物， 然后进行抽滤，并用乙醇重结晶，得到纯化的目标产物。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，在没有特别 说明的情况下，所使用的各种材料均来自商购。

由于蓝藻体内普遍存在的果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶 (cy-FBP/SBPase)在蓝藻Calvin循环碳代谢调控过程中处于重要地位，是 一个潜在的杀藻剂靶标，本领域技术人员公知，若蓝藻果糖-1,6-/景天庚酮糖 -1,7-二磷酸酶受到抑制或发生突变，将导致蓝藻无法生长甚至死亡。而且， 蓝藻果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶水解果糖-1,6-二磷酸为果糖-6-磷酸 和无机磷酸。因此，在本发明的以下实施例和对比例中通过测试无机磷酸的 增加量来测定蓝藻果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶的活性，从而用于探讨 本发明的应用中的化合物对藻类以及对藻类果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷 酸酶的活性的抑制率。

实施例1

(1)分别取本发明的表1中的化合物，用DMSO溶解噻二唑类化合物 配置成0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30mM等不同浓度的噻二唑类 化合物溶液。

(2)测定果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶酶活性的反应缓冲液体系 含50mM的Tris-HCl(pH 8.3)、10mM的二硫苏糖醇(DTT)、15mM的MgCl₂、 0.04μg的果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶。向96孔板的每个孔中加入 100μL的上述反应缓冲液，然后再加入0.5μL上述浓度分别为0、0.01、0.03、 0.1、0.3、1、3、10、30mM的噻二唑类化合物溶液。每个浓度的化合物平 行做3组，同时设置不含化合物的空白对照(加入DMSO，不含反应缓冲液) 和化合物背景对照(用DMSO溶解配制的化合物体系，不含反应缓冲液)。 并向所述溶液中加入2μL的2.5mM的底物果糖-1,6-二磷酸启动酶对底物进 行催化反应。30℃反应5min。

(3)向96孔板的每个孔中加12.5μL高氯酸终止反应。

用多功能酶标仪(Bioteck Synergy2,USA))检测反应后体系在波长为 620nm时的光吸收值。光吸收值表征酶在给定的条件下催化底物生成的产物 无机磷的量。光吸收值与酶催化反应速度呈正比例关系。光吸收值大，则酶 催化反应速度就大。通过公式1计算各化合物的抑制率。

公式1：抑制率％＝(A₀-A_i)/A₀×100％，其中，A₀为没有加抑制剂时果 糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶的吸光值，A_i为加入抑制剂时果糖-1,6-/景 天庚酮糖-1,7-二磷酸酶的吸光值。

以噻二唑类化合物的浓度为横坐标，公式1计算得到的抑制率为纵坐标 作图，在Origin里用公式logistic拟合，求得表1中的噻二唑类化合物对酶 抑制的IC₅₀值，结果列于表2中。

实施例2

集胞藻PCC 6803是蓝藻中最重要的一种模式藻类。本实施例中选择集 胞藻PCC 6803作为活体实验对象用于检验本发明所述的噻二唑类化合物抑 制藻类生长的作用。

分别取相同量的集胞藻PCC 6803培养于含不同浓度化合物的BG-11 (+N)液体培养基中，在人工气候培养箱中培养。控制培养箱温度为28℃ ±1℃，湿度60％，光强为6000 lx，12h(光照)：12h(黑暗)，振动模式，另每 日人工摇3次。

具体操作如下：

预培养一批集胞藻PCC 6803，待生长7天到对数期后，测其OD₆₈₀，接 种待用；

用新鲜的BG-11(+N)培养基稀释上述对数期藻液，获得接种藻液，并 控制藻细胞浓度约1×10⁶个/mL；

向96孔板中的每个孔中加入200μL稀释好的接种藻液，然后再分别加 入配制好的1μL的10mM的表2所示的噻二唑类化合物。每种化合物平行 做5组，同时设置不含化合物的空白对照(藻液体系中加入DMSO)和噻二 唑类化合物背景对照(用DMSO溶解配制的化合物体系)；

在人工气候培养箱中培养7天后用酶标仪测OD₆₈₀，根据公式2计算噻 二唑类化合物的抑制率，结果列于表2中，而且，连续使用5天之后发现， 本发明的方法不会对水体中的其它生物的正常生活产生影响，也即本发明的 方法选择性强。

公式2：抑制率％＝[空白对照组OD₆₈₀-(实验组OD₆₈₀-噻二唑类化合物 背景对照组OD₆₈₀)]/空白对照组OD₆₈₀×100％。

表2

对比例1

本对比例采用与实施例1相似的方法进行，所不同的是，本对比例中用 现有技术中的杀藻剂硫酸铜代替实施例1中的噻二唑类化合物根据公式3测 试抑制率，在其余条件均相同的前提下，以硫酸铜的浓度为横坐标，公式1 计算得到的抑制率为纵坐标作图，在Origin里用公式logistic拟合，求得硫 酸铜对酶抑制的IC₅₀值，结果发现当为硫酸铜大于1000μM，对果糖-1,6-/ 景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶仍然没有50％，换句话说，硫酸铜对蓝藻果糖-1,6-/ 景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶的抑制大于1000μM。

公式3：抑制率％＝(A₀-A_i)/A₀×100％，其中，A₀为没有加硫酸铜时果 糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶的吸光值，A_i为加入硫酸铜时果糖-1,6-/景 天庚酮糖-1,7-二磷酸酶的吸光值。

通过对比对比例1和实施例1的结果表明，相同浓度条件下，本发明的 噻二唑类化合物对果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶的活性的抑制率明显 高于硫酸铜的抑制率。

对比例2

本对比例采用与实施例2相似的方法进行，所不同的是，本对比例中用 现有技术中的杀藻剂硫酸铜代替实施例2中的噻二唑类化合物作为抑制剂抑 制集胞藻PCC 6803的生长，在其余条件均相同的前提下，采用公式4计算 抑制率，结果使用硫酸铜时对藻的抑制率为92％，但是，使用硫酸铜作为杀 藻剂使用时，由于硫酸铜的选择性很差，将水体中的大量的其它生物也杀死 了。

公式4：抑制率％＝[空白对照组OD₆₈₀-(实验组OD₆₈₀-硫酸铜化合物背 景对照组OD₆₈₀)]/空白对照组OD₆₈₀×100％。

通过对比对比例2和实施例2的结果表明，相同浓度下，本发明的噻二 唑类化合物对蓝藻的抑制率比硫酸铜对蓝藻的抑制率高，而且本发明的方法 选择性好，对水体中的其它生物的正常生活不产生影响。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方 案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必 要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其 不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。