一种提高脂肪干细胞转分化为涎腺腺泡样细胞的方法

摘要

采用消化法分别培养涎腺细胞和脂肪来源干细胞，将两种细胞用transwell培养小室和24孔培养板进行共培养，内室接种涎腺细胞，外室接种脂肪来源干细胞，培养基采用含体积分数为10％胎牛血清的DMEM培养基，并添加含质量分数为0.5％-5％的富血小板纤维蛋白浸提液的诱导脂肪干细胞转分化为涎腺腺泡样细胞；本发明方法能有效提高脂肪干细胞向涎腺腺泡样细胞转分化的效率，为组织工程技术、再生医学研究和应用提供种子细胞和转分化新方法。

说明书

技术领域

本发明属于组织工程和再生医学技术领域，特别涉及一种提高脂肪干细 胞转分化为涎腺腺泡样细胞的方法。

背景技术

干细胞分化是组织工程和再生医学领域中研究的热点之一，目前，关于 脂肪来源干细胞转分化为腺泡样细胞的研究报道极少，干细胞转分化主要存 在的问题是，短时间干细胞转分化效率很低，仅为13％-18％，限制了广泛开 展干细胞转分化为腺泡样细胞的研究和应用。因此，需要寻找一种干细胞高 效转分化的技术方法，促进干细胞转分化为腺泡样细胞在损伤涎腺再生和修 复方面的研究和应用。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种提高脂肪干 细胞转分化为涎腺腺泡样细胞的方法，可实现脂肪干细胞向涎腺腺泡样细胞 的高效率转分化。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种提高脂肪干细胞转分化为涎腺腺泡样细胞的方法，采用消化法分别 培养涎腺细胞和脂肪来源干细胞，并制备富血小板纤维蛋白(PRF)浸提液， 将所述涎腺细胞和脂肪来源干细胞用transwell培养小室进行共培养，上室接 种涎腺细胞，下室接种脂肪来源干细胞，诱导培养基为含体积浓度10％的胎 牛血清的DMEM培养基，并添加所制备的富血小板纤维蛋白(PRF)浸提液， 诱导脂肪干细胞转分化为涎腺腺泡样细胞。

其中，所述涎腺细胞的培养过程如下：

无菌条件下取C3H小鼠双侧颌下腺，用体积浓度0.1％的Ⅱ型胶原酶消 化获得涎腺细胞，体外培养，培养基主要成分：DMEM培养基，添加体积分 数为10％的胎牛血清，100u/ml的青霉素和链霉素，0.1μg/mL的表皮生长因 子，5.0μg/mL的转铁蛋白，5.0μg/mL的胰岛素，0.4μg/mL氢化可的松。

所述脂肪来源干细胞的培养过程如下：

无菌条件下取C3H小鼠双侧腹股沟脂肪，用体积浓度0.1％的Ⅰ型胶原 酶消化获得脂肪干细胞，体外培养，培养基主要成分：DMEM培养基，添加 体积分数为10％的胎牛血清，100u/ml的青霉素和链霉素。

所述富血小板纤维蛋白(PRF)浸提液的制备过程如下：

抽取兔耳中动脉血，3000rpm，离心10min，获取PRF凝胶，冷冻干燥， 按25mgPRF颗粒/1mL无血清培养基的比例制备浸提液，置于37℃温度条件 下，浸提3天后离心，取上清培养基，过滤除菌即得。

所述transwell培养小室底面膜孔径为0.4μm，置于24孔板或6孔板中， 建立共培养系统。

所述共培养过程中，涎腺细胞与脂肪干细胞的数目比为4:1，采用含体 积分数为10％的胎牛血清的DMEM培养基，并添加质量分数为0.5％-5％的 富血小板纤维蛋白(PRF)浸提液。

本发明中，涎腺细胞与脂肪干细胞来源于同一小鼠。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)涎腺细胞培养基采用含10％胎牛血清DMEM培养基并添加多种成 分：表皮生长因子，转铁蛋白，胰岛素和氢化可的松，能够保持涎腺细胞维 持良好功能状态，分泌相关细胞因子，促使干细胞向腺泡样细胞转分化。

(2)涎腺细胞和脂肪干细胞共培养系统采用含10％胎牛血清DMEM培 养基并添加一定浓度的PRF浸提液，该共培养系统组成简单，使用方便。

(3)PRF浸体液含有多种生长因子，能够保持涎腺细胞和脂肪干细胞 活性，促进干细胞向腺泡样细胞转分化，短期转分化效率高达36.2％，显著 优于文献报道。

本发明转分化方法同样适用于人类或其他动物干细胞的转分化。

附图说明

图1为本发明使用的共培养系统示意图。

图2为本发明共培养干细胞α-淀粉酶免疫荧光染色×200的电镜图片(A 涎腺细胞阳性对照，B为未诱导干细胞组，C为正常诱导组，D为0.5％PRF 浸提液组，E为1％PRF浸提液组，F为5％PRF浸提液组)。

图3为本发明共培养脂肪干细胞转分化率比较示意图(与正常诱导组比 较，*表示P＜0.01)。

图4为本发明共培养干细胞α-淀粉酶Western Blot检测示意图(1-6分 别代表正常诱导组、0.5％PRF浸提液组、1％PRF浸提液组、5％PRF浸提液 组、下颌下腺细胞组和未诱导组)。

图5为本发明共培养干细胞α-淀粉酶条带灰度值分析示意图(与正常诱 导组相比，*表示P＜0.05；***表示P＜0.001)。

图6为本发明共培养干细胞α-淀粉酶表达量分析示意图(与正常诱导组 相比，*表示P＜0.01)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。

本发明一种提高脂肪干细胞转分化为涎腺腺泡样细胞的方法，包括如下 步骤：

1.涎腺细胞的培养：无菌条件下取C3H小鼠双侧颌下腺，用0.1％的Ⅱ 型胶原酶消化获得涎腺细胞，体外培养。培养基主要成分：DMEM培养基， 10％胎牛血清，1％双抗，0.1μg/mL的表皮生长因子，5.0μg/mL的转铁蛋白， 5.0μg/mL的胰岛素，0.4μg/mL氢化可的松。

2.脂肪干细胞的培养：无菌条件下取C3H小鼠双侧腹股沟脂肪，用0.1％ 的Ⅰ型胶原酶消化获得脂肪干细胞，体外培养。培养基为DMEM培养基， 10％胎牛血清，100u/ml的青霉素和链霉素。

3.富血小板纤维蛋白(PRF)浸提液的制备：抽取兔耳中动脉血， 3000rpm，离心10min。获取PRF凝胶，冷冻干燥，按25mgPRF颗粒/1mL 无血清培养基的比例制备浸提液，置于37℃，浸提3天后离心，取上清培养 基，过滤除菌备用。

4.涎腺细胞和脂肪干细胞共培养

利用底面膜孔径为0.4μm的Transwell小室11置于24孔板或6孔板14 中，建立共培养系统，如图1所示，上层小室内接种涎腺细胞13，下层孔板 内接种脂肪干细胞12，涎腺细胞与脂肪干细胞的数目比为4:1。诱导培养基 为含10％胎牛血清DMEM培养基，添加0.5％-1.5％PRF浸提液。共培养进 行7天后，应用免疫荧光和免疫印迹方法检测转分化细胞α-淀粉酶阳性表达， 用RT-PCR检测α-淀粉酶mRNA阳性表达(图2-图6)。依据免疫荧光结果 计算7天脂肪干细胞向涎腺腺泡样细胞转分化的效率高达36.2％。

为验证本发明所述脂肪干细胞向涎腺腺泡样细胞转分化新方法的功效， 进行试验如下：

1.材料与方法

1.1 实验动物

4周龄SPF级C3H小鼠，雄性，由北京维通利华实验动物技术公司提供， 动物质量合格证:0247897。饲养于第四军医大学口腔医院实验动物中心SPF 级净化屏障内，实验动物使用许可证号:SYXK(陕)2009-002。

1.2 主要实验试剂及耗材

低糖DMEM培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(Biowest，法国)；胰 蛋白酶(国安生物科技有限公司，中国西安)；Ⅰ型和Ⅱ型胶原酶(Sigma， 美国)；胰岛素(Sigma，美国)；表皮生长因子(PEPROTECH，美国)； 氢化可的松(Sigma，美国)；转铁蛋白(Sigma，美国)；兔抗小鼠α-淀粉 酶抗体(santacruz biotechnology，美国)；β-actin一抗(康为世纪，中国北 京)；山羊抗鼠IgG/FITC标记二抗(中彬金桥，中国北京)；正常山羊血清 封闭液(博士德，中国武汉)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(巴傲德，中 国南京)；细胞裂解试剂盒(碧云天，中国上海)；BCA蛋白浓度测定试剂 盒(碧云天，中国上海)；聚丙烯酰胺凝胶试剂盒(碧云天，中国上海)； PVDF膜(millipore，美国)；逆转录试剂盒(Takara，日本)；培养瓶(corning， 美国)；培养皿(corning，美国)；6孔板，24孔板，96孔板(corning，美 国)；Transwell小室(孔径0.4μm)(BD falcon，美国)

1.3 主要实验设备

超净工作台(BIOBASE，中国山东)；低速离心机(湘仪，中国湖南)； 恒温摇床(福玛实验设备有限公司，中国)；二氧化碳恒温培养箱(Thermo， 美国)；倒置显微镜(Olympus，日本)；倒置荧光显微镜(Leica，德国)； 实时定量PCR仪(Thermo，美国)

1.4 涎腺细胞的培养：无菌条件下取C3H小鼠双侧颌下腺，去除附带的 筋膜，脂肪等，PBS洗2遍，剪碎，0.1％的Ⅱ型胶原酶消化30min，离心洗 涤后，接种于培养皿。每3天换液一次。培养基主要成分：DMEM培养基， 10％胎牛血清，1％双抗，0.1μg/mL的表皮生长因子，5.0μg/mL的转铁蛋白， 5.0μg/mL的胰岛素，0.4μg/mL氢化可的松。

1.5 脂肪干细胞的培养

无菌条件下取C3H小鼠双侧腹股沟脂肪带，去除附带的筋膜，PBS洗2 遍，剪碎，0.1％的Ⅰ型胶原酶消化50min，离心洗涤后，接种于培养瓶。

1.6 富血小板纤维蛋白(PRF)浸提液的制备

抽取兔耳中动脉血，立即移入离心管，3000rpm，离心10min。离心完成 后，分为三层：上层为血浆，底层为红细胞，中层即为PRF凝胶。将PRF 凝胶取出，至于冻干机冷冻干燥，完成后在无菌条件下用研钵将其研磨成小 颗粒，-20℃密封保存。取保存的PRF颗粒，按25mgPRF颗粒/1mL无血清 培养基的比例制备浸提液，置于37℃，浸提3天后离心，取上清培养基，过 滤除菌。

1.7 涎腺细胞和脂肪干细胞共培养

(1)共培养系统的建立：取汇合至生长面积80％的涎腺原代细胞及第 三代脂肪干细胞，0.25％的胰蛋白酶消化，离心后，重悬细胞，并分别计数。 共培养系统如图1：利用底面孔径为0.4μm的Transwell小室置于24孔板和 6孔板中，建立共培养系统，上层小室内接种涎腺细胞，下层孔板内接种脂 肪干细胞。共培养进行7天，24孔板中上层涎腺细胞数为2×10⁴个，下层脂 肪干细胞数为5×10³个；6孔板中，上层涎腺细胞数为1×10⁵个，下层脂肪干 细胞为2.5×10⁴个；涎腺细胞与脂肪干细胞的数目比为4:1。

(2)实验分组：共分为三个组别：未诱导组，正常诱导组和PRF干预 组。PRF干预组选用三个浓度(浓度PRF浸提液与正常培养基的体积比)， 即0.5％PRF浸提液组，1％的PRF浸提液组和5％PRF浸提液组。每组重复3 孔，加液时浸提液加在下室内，每2天换液一次。

1.8 α-淀粉酶免疫荧光染色

待诱导至第7天，取出Transwell小室，将24孔板内脂肪干细胞用PBS 轻轻漂洗2遍，4％多聚甲醛固定20min后，PBS清洗3遍，0.2％Triton透膜 5min，PBS清洗3遍后，加入二抗同源血清封闭液(山羊血清封闭液)作用 30min后，吸出封闭液，加入兔抗小鼠α淀粉酶一抗，4℃过夜。第二天，PBS 清洗3遍后，加入FITC标记的山羊抗兔荧光二抗，37℃孵育45min(避光) 后，PBS清洗3遍(避光)，加入DAPI染核10min(避光)，PBS清洗3 遍后(避光)，抗淬灭剂封片，拍照。

计算干细胞转分化率：以α-淀粉酶免疫荧光染色为基础，每组计数5个 视野下，总细胞数及α-淀粉酶阳性细胞数，计算转分化率，为α-淀粉酶阳性 细胞数/总细胞数。

1.9 α-淀粉酶Western Blot检测

待诱导至第7天，取出Transwell小室，将6孔板内脂肪干细胞用PBS 轻轻漂洗2遍，加入蛋白裂解液，刮取细胞，收集于EP管，在-80℃和常温 下，反复冻融3次。吹打，直至无细胞碎片(如仍有细胞碎片，可超声裂解)。 将EP管置于离心机，4℃，12000rpm，离心15min后，取上清液，移至新的 EP管，即为提取完成的蛋白。采用BCA试剂和蛋白标准品利用标准曲线法 测定蛋白浓度，计算加样体积后，配胶，加样，跑电泳，转膜，抗体结合， 发光扫描条带，并用image j软件和SPSS19.0对各条带灰度值进行比较分析， 以P＜0.05为有统计学差异。实验设置下颌下腺细胞阳性对照组。

1.10 α-淀粉酶RT-PCR检测

检测干细胞α-淀粉酶mRNA的表达水平。取诱导至7天的6孔板脂肪干 细胞，PBS洗2遍，每孔加入1mLTrizol裂解细胞后，提取RNA，并进行 RNA浓度测定，后反转录mRNA为cDNA，各自加入相应引物，按指定程 序检测各基因的表达水平，并用SPSS19.0对各组α-淀粉酶表达量进行统计 分析，以P＜0.05为有统计学差异。实验设置下颌下腺细胞阳性对照组。

2.结果与分析

2.1 诱导脂肪干细胞α-淀粉酶的表达

免疫荧光染色结果显示，涎腺细胞中α-淀粉酶表达强阳性，未诱导干细 胞组未见绿色荧光细胞出现，表明α-淀粉酶表达阴性。正常诱导组，0.5％PRF 浸提液组，1％PRF浸提液组和5％PRF浸提液组细胞核DAPI染色呈现蓝色 荧光，部分胞浆内可见绿色荧光出现，部分细胞α-淀粉酶表达阳性，表明脂 肪干细胞转分化为涎腺腺泡样细胞，如图2所示。

2.2 共培养脂肪干细胞转分化的效率

以α-淀粉酶免疫荧光为基础，计数各组随机5个视野下α-淀粉酶阳性表 达细胞数及总细胞数，计算转分化率，如下表1。利用SPSS19.0分析各组别 之间脂肪干细胞转分化率可见，不同浓度PRF浸提液组与正常诱导组相比， P值均小于0.001，差异具有统计学意义。1％PRF浸提液组与0.5％PRF浸提 液组和5％PRF浸提液组两组相比，P均小于0.001，差异具有统计学意义。 但0.5％PRF浸提液组和5％PRF浸提液组两组相比，P＞0.1，差异不具有统 计学意义，具体见图3。

表1 各组脂肪干细胞转分化率比较

分组 脂肪干细胞转分化率(X±S％) 未诱导组 0±0 正常诱导组 22.87±1.66 0.5％PRF浸提液组 30.39±1.51 1％PRF浸提液组 36.20±1.33 5％PRF浸提液组 28.78±0.83

2.3 诱导脂肪干细胞α-淀粉酶蛋白的表达

α-淀粉酶Western Blot实验结果显示，在分子量大约58KD处，正常诱 导组，0.5％PRF浸提液组，1％PRF浸提液组，5％PRF浸提液组和下颌下腺 细胞组均有深色条带形成，但条带灰度不同，以下颌下腺细胞和1％PRF浸 提液组灰度值较高，0.5％PRF浸提液组和5％PRF浸提液组次之，正常诱导 组最低，未诱导组未见条带出现，Western Blot结果如图4，各组灰度值分析 如图5。

2.4 诱导脂肪干细胞α-淀粉酶mRNA的表达

RT-PCR实验结果显示，未诱导组未检测到α-淀粉酶的表达，正常诱导 组，0.5％PRF浸提液组，1％PRF浸提液组，5％PRF浸提液组和下颌下腺细 胞组均检测到α-淀粉酶的表达，但表达量不同，以下颌下腺细胞和1％PRF 浸提液组表达量较高，0.5％PRF浸提液组和5％PRF浸提液组次之，正常诱 导组最低。各组间α-淀粉酶表达分析见图6。

本发明的脂肪干细胞向涎腺腺泡样细胞转分化新方法的优势：

(1)涎腺细胞培养基采用含10％胎牛血清DMEM培养基并添加多种成 分：表皮生长因子，转铁蛋白，胰岛素和氢化可的松，能够保持涎腺细胞维 持良好功能状态，分泌相关细胞因子，促使干细胞向腺泡样细胞转分化。

(2)涎腺细胞和脂肪干细胞共培养系统采用含10％胎牛血清DMEM培 养基并添加一定浓度的PRF浸体液，该共培养系统组成简单，使用方便。

(3)PRF浸体液含有多种生长因子，例如，PDGF、FGF、TGF、VEGF、 EGF等，能够保持涎腺细胞和脂肪干细胞活性，促进干细胞增殖与分化。

(4)该共培养系统能够有效提高脂肪来源干细胞转分化为涎腺腺泡样细 胞，7天干细胞转分化效率高达36.2％，显著由于文献报道结果。该成果将 为体内脂肪来源干细胞和富血小板纤维蛋白修复放射损伤涎腺再生与修复提 供技术支撑，同时，也将解决涎腺组织工程再生中种子细胞的来源问题。