一种与鸡优良生产性状相关的鸡FABP1基因分子遗传标记及其应用

摘要

本发明公开了一种与鸡优良生产性状相关的鸡FABP1基因分子遗传标记，是鸡FABP1基因单核苷酸多态性序列上的多态性位点，该位点是在FABP1基因序列第二外显子的第83位为C或T的碱基多态性位点，表现为CC、CT或TT三种基因型，其中TT型为肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记标。本发明还公开了所述标记在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中的应用。实验证实：特异型酶切位点的多态性与生产性能之间具备相关性，基因型为TT的个体多数测量指标均高于基因型为CC和CT的个体，提示基因型为TT的个体可以作为种鸡来培育具有优良屠宰性状的品种鸡。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，涉及一种肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记及其在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中的应用。

背景技术

目前对于分子遗传标记较为完整的描述，是指易于识别、遵循孟德尔遗传模式的、具有个体特异性或分布规律具有种质特征的某一类表性特征或遗传物质，其范围包括：基因或遗传物质产物的变异特征、作为基因或遗传物质载体的染色体的形态学变异、基因或遗传物质本身的变异等。DNA分子遗传标记技术是一种新兴的分子标记技术，目前已经在分子生物学特别是在分子遗传学上得到了广泛的应用。由于真核生物的遗传信息都储存在染色体和细胞器基因组的DNA序列中，因此从理论上讲，DNA水平上的分子标记是所有遗传标记中最为稳定最为可靠的。现代分子生物学技术的发展使得直接利用DNA序列中核苷酸的变异作为遗传标记成为了可能。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指在染色体基因组水平上单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，而其中最少一种等位基因在群体中的频率不小于1％。它包括碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式。由于SNP具有高密度性、富有代表性、遗传稳定性及易实现分析的自动化等优点，因此作为一类遗传标记，SNP在遗传学分析中得到了广泛的应用。

脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding protein，FABP)广泛存在于脊椎动物和费脊椎动物的细胞质中，属于脂质结合蛋白超家族成员。FABP蛋白是一族小分子细胞内蛋白，对长链脂肪酸有很高的亲和力，能把脂肪酸从细胞膜转移到细胞内，在长链脂肪酸的代谢中起重要作用。迄今为止已经发现了9种类型的FABP蛋白，每种类型的FABP蛋白在不同的组织和细胞中表达。

FABP1是肝型脂肪酸结合蛋白，属于FABP超家族中的一员，存在于肝细胞和小肠粘膜细胞胞质吗，对软脂酸盐、油酸和硬脂酸盐等具有高度亲和力，参与脂肪酸的摄取和转运。在肝脏，长链脂肪酸一般通过位于肝细胞膜上的FABP脂肪酸转运蛋白摄取入胞，随后在FABP1的辅助下被转运到线粒体、过氧化物酶体、内质网等进行β-氧化，从而调控细胞内的脂肪酸代谢，最终使体内脂肪酸代谢保持相对平衡。作为分子标记，FABP1表现出高遗传的多态性。脂肪性状是评价鸡肉品质的重要指标，此类性状的发育会直接影响其商品性能。因此，对于调控脂肪性状发育基因的SNPs的表征对于通过肉鸡的分子育种和辅助选择提高其生产性能具有十分重要的作用。在申请人相关实验涉及鸡的群体中，FABP1单核苷酸未突变的个体其产肉率以及肉质均优于纯合突变个体以及杂合突变个体，从数据上直观地体现了FABP1基因SNPs对鸡生产性状的影响。这一发现若应用到优质家禽的育种等研究工作中，有望为培育出高产优质肉性状的优良品种提供帮助。经检索，目前FABP1基因SNPs作为遗传标记，特别是作为肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记应用于筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种与鸡优良生产性状相关的鸡FABP1基因分子遗传标记及其在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中的应用。

本发明所述的与鸡优良生产性状相关的鸡FABP1基因分子遗传标记是鸡FABP1基因单核苷酸多态性序列上的多态性位点，其特征在于：所述鸡FABP1基因单核苷酸多态性序列的多态性位点是在FABP1基因序列第二外显子的第83位为C或T的碱基多态性位点，表现为CC、CT或TT三种基因型，其中TT型为肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记。

本发明所述与鸡优良生产性状相关的鸡FABP1基因分子遗传标记在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中的应用。

上述应用的具体方法是：以待检测鸡FABPl基因组DNA为模板，以引物对FABP1E2F/E2R进行PCR扩增，扩增完成后进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用特定的限制性核酸内切酶对扩增出的目的片段进行酶切；之后对酶切产物再一次进行琼脂糖凝胶电泳，来检测酶切产物的片段大小，分析确定鸡FABP1基因的碱基多态性位点，当FABP1基因序列第二外显子的第83位为C或T，且基因型为TT型时，即可判定待检测鸡品种为具有优良屠宰性状的品种鸡；

其中：

所述引物对FABP1 E2F/E2R的核苷酸序列为：

FABP1 E2F：CTTGAGAGGCTCTTCCACAATAG；

FABP1 E2R：GTTGGACTGGATAGCCTTTAAGTTC；

所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性4-5min；94℃变性30-35s，55-61℃退火30-35s，72℃延伸1min,28-35个循环，最后72℃延伸10min，并置于4℃保存；

所述特定的限制性核酸内切酶为：ASP MDI、Bsp AI、MboI、CacI及HacI，其酶切作用位点为扩增出目的基因中的以下序列：5’…^↓GATC…3’或3’…CTAG_↑…5’。

上述方法优选的实施方式是：对于FABP1 E2F/E2R引物对来说，PCR扩增程序为：95℃预变性4min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min,35个循环，最后72℃延伸10min，并置于4℃保存。所述特定的限制性核酸内切酶为：MboI。

本发明利用限制性核酸内酶切的方法快速筛查鸡FABP1基因第二外显子位点上的产生的单核苷酸多态性进行检测，通过对鸡品种的SNP进行基因分型和基因频率分析，同时对酶切多态位点与鸡生长性状之间进行关联分析，寻找与鸡生长性状相关的SNPs作为分子标记，并以该功能SNPs作为肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记，在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中广泛应用，加快了良种鸡的选育速度和提高种群品质。

本发明通过以SNP位点为酶切位点，选择合适的特异性核酸内切酶，然后根据SNP突变后酶切出的DNA片段大小不同来确定鸡FABP1基因单核苷酸多态性特征。

根据鸡FABP1基因单核苷酸多态性特征，本发明确定鸡FABP1基因单核苷酸多态性序列的多态性位点是在FABP1基因序列第二外显子的第83位为C或T的碱基多态性位点，表现为CC、CT或TT三种基因型，其中TT型为肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记标的。实验发现：CC、CT或TT三种基因型的鸡在产肉率以及肉质优化等方面都有很大差别，TT型鸡屠宰性状(产肉率以及肉质)明显优于CC、CT两种类型，所以该基因型的雏鸡可以作为具备优良屠宰性状的种鸡来培育，这也肯定了基因型为TT的鸡可以作为种鸡来培育具有优良屠宰性状的品种鸡的可实施性。本发明应用方法简单、快速、低成本、便于推广应用，可广泛应用于鸡的辅助选择和分子育种中，将为培育出高产优质肉性状的优良品种提供支持。

附图说明

图1为本发明所述肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记的实际应用流程示意图。

图2为本发明扩增的鸡的FABP1编码基因结构示意图与第二外显子序列。

其中，第二外显子的83位核苷酸用下划线及黑体放大字母示意。在野生基因中，第83位核苷酸为T，突变基因中为C。

图3为本发明所述不同基因型FABP1基因酶切位点及酶切后所得片段大小的示意图。

图4为本发明中部分样品PCR产物经特异性酶切筛查到的鸡FABP1基因序列琼脂糖凝胶电泳结果图。其中，TT为未突变型，CT为杂合突变型，CC为纯合突变型。

具体实施方式

本发明首先根据鸡FABP1基因的保守序列设计引物，以不同品种鸡基因组DNA为模板，进行PCR扩增，测序。然后，进行特异性酶切，并将酶切结果的琼脂糖凝胶电泳图和序列比对筛查出不同品种鸡FABP1基因SNP位点。然后，根据在群体中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和生长性状的关联分析，筛选出与鸡生长性状密切相关的分子标记。最后，利用获得的分子遗传标记在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中应用，将筛选到的拥有与鸡优异屠宰性状相关分子标记的鸡作为种鸡进行培养，以期繁殖更多的优质鸡。下面对本发明做详细说明，所述内容是对本发明的解释而不是限定。

实施例1：不同品种鸡FABP1基因部分DNA序列的克隆

1、鸡血的采集及处理：随机抽取无病健康鸡，包括670只鲁禽3号鸡以及60只琅琊鸡，由翅下静脉采血，EDTA做抗凝处理。

2、基因组DNA的提取：利用Tiangen血液DNA提取试剂盒提取DNA。使用200μL新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，加入20μL蛋白酶K溶液，混匀；然后加入200μL缓冲液GB，混匀后70℃放置10分钟；加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀，此时会出现絮状沉淀；将所得溶液和絮状沉淀全部转移到放入收集管中的吸附柱CB3中，12000rpm离心30秒并弃废液；加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30秒并弃废液；加入700μL漂洗液PW(使用前加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒并弃废液，并重复该步骤两次；彻底除尽吸附材料中的漂洗液之后，使用水或洗脱液TE将所得DNA产物尽可能的洗脱下来。

3、扩增引物设计：根据NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)鸡的GenBank登录号为：reflNP_989523.1的FABP1基因的外显子序列，以该基因序列保守区序列为参考设计PCR引物对，其引物对序列如下：

上游引物(FABP1 E2F)：CTTGAGAGGCTCTTCCACAATAG；

下游引物(FABP1 E2R)：GTTGGACTGGATAGCCTTTAAGTTC；

该引物扩增了FABP1基因第二外显子447bp序列。

4、PCR扩增鸡FABP1基因外显子：以鸡的DNA为模版，用上述设计的引物对进行PCR扩增，PCR总反应体系为30μL，见表1；PCR总反应程序，见表2。

表1 PCR反应体系

表2 在适用范围内最佳的PCR反应程序

实施例2：使用MboI酶对实施例1中PCR产物进行特异性酶切

1.使用MboI酶对目的基因进行特异性酶切。这类特异性酶的作用位点是：

5’…^↓GATC…3’

3’…CTAG_↑…5’

2.酶切反应体系见表3。

表3 MboI酶切反应体系

按照上述体系将反应体系各溶液混匀后，放置于37℃恒温水浴中反应3-5h，使酶切反应充分进行，之后进行后续试验。

3.对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。然后根据不同的酶切结果将所有的样品进行分类总结，归纳出不同的类型。

酶切结果有三种，分别是SNP位点完全突变、杂合突变以及完全没有突变的。SNP位点完全突变的情况下，MboI在目的片段中有三处切点，得到四条不同大小的条带(5bp、63bp、146bp和233bp)；SNP位点未完全突变的情况下，MboI在目的片段中有三个酶切位点，得到五条大小不同的条带(5bp、63bp、146bp、233bp和296bp)；SNP位点未突变的情况下，MboI在目的片段中有两个酶切位点，酶切产物大小为(5bp、146bp和296bp)。因5bp和64bp片段非常小，在普通琼脂糖电泳时只检测146bp、233bp和296bp三条片段(如图3所示)。

在下面序列中用方框标出的核苷酸位点是多态位点，该位点存在C/T两种基因型，当基因型为T时，内切酶只能将PCR产物切成三条片段，但电泳可以检测到其中两条(146bp和296bp)；当基因型为C时，内切酶可以将PCR产物切成更多较短的片段。

TTCAAGATACTGTGACTA

实施例3：本发明制备的分子遗传标记在不同鸡群体多态性中的诊断应用

1、群体多态性中的诊断：利用上述SNP多态性检测方法对670份鲁禽3号鸡以及60份琅琊鸡FABP1基因进行特异性酶切检测。

2、SNP位点的频率统计分析：

基因型频率是指一个群体中某特定基因型个体的数目占个体总数目的比率。Paa＝Aaa/N，其中Paa代表某一位点的AA基因型频率，Aaa表示群体中具有AA基因型的个体数，N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：PA＝(2NM+NA_al+NA_a2+......+NA_an)/2N。式中，PA表示等位基因A频率，NM表示群体中具有AA基因型的个体数量，A_al-an为等位基因A的n个不同的复等位基因。统计结果见表6和表7。

表6 鲁禽3号鸡FABP1基因多态位点的基因型和等位基因频率

表7 琅琊鸡FABP1基因多态位点的基因型和等位基因频率

3、基因效应的关联分析

采用PASW(18.0)统计软件，对鲁禽3号鸡及石歧杂鸡不同基因型个体与体尺数据进行了显著性检验。

(1)测定的主要性状包括：宰前活重、屠体重、屠宰率、半净膛重、全净膛重、半净膛率、全净膛率、胸肌重、胸肌率、腿肌重、腿肌率、腹脂重、腹脂率、皮脂厚、肌脂宽等。

(2)测定的群体：随机抽取健康无病鲁禽3号鸡670只及琅琊鸡60只分别进行分析。

统计结果见表8和表9。

表8 鲁禽3号鸡FABP1 E2多态性与屠宰性状的关联分析

表9 琅琊鸡FABP1 E2多态性与屠宰性状的关联分析

FABP1SNP位点C/C(3)Mean±SDC/T(12)Mean±SDT/T(45)Mean±SD宰前活重1332.67±300.551389.03±76.321335.87±39.12屠体重1194.57±274.121260.40±66.141196.66±34.84屠体率89.39±0.1090.90±0.6889.67±0.52半净膛重1100.23±254.941140.49±61.121100.22±31.95半净膛率82.29±0.6282.26±0.8082.49±3.72全净膛重1002.33±233.231039.56±57.43996.60±30.35全净膛率74.95±1.0374.89±3.0274.61±3.59

胸肌重144.75±26.74139.84±6.36158.83±114.48胸肌率15.14±0.8813.56±0.2616.53±2.32腿肌重177.53±47.88190.42±11.43182.25±6.14腿肌率17.42±0.6618.29±17.6318.28±0.23腹脂重17.96±9.9225.36±5.1717.91±1.70腹脂率1.51±0.532.13±0.421.86±0.19皮脂厚3.24±0.664.02±0.374.68±0.25肌脂宽5.43±0.556.02±0.455.67±0.28翅重103.59±36.7273.00±10.7987.10±5.50翅膀率11.47±0.3510.90±0.2211.17±0.20腿重279.51±103.60264.75±76.22236.30±15.51腿比率30.53±0.8946.54±19.2629.91±0.30

注：基因型上标中的字母显示不同基因型之间的差异，具有相同字母表示两种基因型之间差异不显著(P>0.05)，字母不同表示两种基因型之间差异显著(P<0.05)，没有标记的表明该基因型与其他基因型之间没有显著差异。

分析显示，在鲁禽3号鸡中基因型为TT的个体其宰前活重、屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重及腿肌重等测量指标均与CC型与CT型个体差异显著，且TT型测量数值最大。同样的，在琅琊鸡中，相对于CC个体来说，TT型个体生产性状的测量数据更为理想，即TT型鸡更适于作为种鸡进行优异品种鸡的筛选与育种。