一种空气颗粒物携带微生物的区域源解析方法

摘要

本发明公开了一种空气颗粒物携带微生物的区域源解析方法。它包括以下步骤：1）空气颗粒物样本和区域典型表层尘土样本的采集、2）微生物DNA的提取与高通量测序、3）样本群落结构分析、4）主坐标分析与群落相似度分析、5）空气颗粒物携带微生物整体潜在区域来源解析、6）致病菌和致敏菌来源解析。本发明用于空气颗粒物表面所携带微生物的区域潜在来源的调查，可分析TSP、PM10与PM2.5等多种粒径悬浮颗粒物表面携带微生物的群落与区域周边表层样本微生物群落之间的关系，从微生物群落的角度解析雾霾的来源，为雾霾的防治提供理论指导。空气颗粒物中病原微生物和致敏菌的区域源解析，对人类的健康和卫生防疫工作具有重要的意义。

说明书

技术领域

 本发明涉及一种空气颗粒物携带微生物的区域源解析方法。

背景技术

 由于人类活动和多种气象条件作用，大气气溶胶细粒子污染日趋严重，雾霾天气越来越频繁。雾霾天气的频繁发生引起了众多研究者的广泛关注，目前研究主要集中在雾霾空气颗粒物的理化因子分析、城市中大气气溶胶细粒子的贡献来源以及大气污染模型的构建等方面，针对污染空气中微生物和环境微生物群落结构组成差异分析和空气微生物来源解析的研究并不多。已有研究表明，空气中颗粒物所携带的微生物，尤其是病原体和致敏菌，和人类易在雾霾高发天气感染呼吸道疾病和过敏性疾病有着密不可分的联系，因而探明雾霾中空气微生物特别是病原微生物和致敏菌的区域性来源，进而从微生物群落分析的角度判断雾霾的区域来源，对探寻合适的雾霾来源控制方法，提高空气质量，指导人类外出活动，保障人类身体健康具有重要的指导意义。

本发明可用于空气颗粒物表面所携带微生物的区域潜在来源的调查，可分析TSP、PM10与PM2.5等多种粒径悬浮颗粒物表面携带微生物的群落与区域周边表层样本微生物群落之间的关系，从微生物群落的角度解析雾霾的来源，为雾霾的防治提供理论指导。其中，空气颗粒物中病原微生物和致敏菌的区域源解析，对人类的健康具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可分析空气颗粒物携带微生物的区域来源解析进而判断雾霾的区域性潜在来源的方法。

一种空气颗粒物携带微生物的区域源解析方法的步骤如下：

1）空气颗粒物样本和区域典型表层尘土样本的采集，于同一采样日分别采集空气颗粒物样本和周边不同区域环境中的表层土壤样本、地面灰尘样本、植物叶片表层灰尘样本；

2）微生物DNA的提取与高通量测序，提取空气颗粒物样本和周边不同区域环境中的表层土壤样本、地面灰尘样本、植物叶片表层灰尘样本的微生物DNA，进行DNA质量的检验，测定及检验合格的样本进行相等DNA浓度混合，建立混合测序文库，利用高通量测序技术获得混合测序文库中DNA目的片段序列；

3）样本群落结构分析，将所得DNA目的片段序列与Silva数据库中的已知序列进行比对，鉴定所得样本中微生物的系统分类；

4）主坐标分析与群落相似度分析，利用Mothur程序和R软件包对所得高通量序列进行单个和多个样本间群落相似度的比较分析；

5）空气颗粒物携带微生物潜在区域来源解析，根据空气颗粒物样本和周边不同区域环境中的表层土壤样本、地面灰尘样本、植物叶片表层灰尘样本的群落相似度分析结果解析区域内潜在的空气微生物来源；

6）致病菌和致敏菌来源解析，将已知的人体呼吸道和人体皮肤接触易感染的病原菌和致敏菌在序列分析中单独列出，重复步骤4）和步骤5），找出病原菌和致敏菌在区域内的主要潜在来源。

所述步骤1）为：选择同一采样日采集空气颗粒物样本和周边不同区域环境中的表层土壤样本、地面灰尘样本、植物叶片表层灰尘样本，空气颗粒物样本由三台同型号的空气采样仪同时同地采集，所用空气采样仪为青岛崂山应用技术研究所生产的2050型中流量空气采样仪，该型号空气采样仪配备三种不同颗粒物粒径的切割器，可同时分别采集TSP、PM10、PM2.5空气颗粒物样本，采样之前将切割器和采样滤膜进行高温灭菌，设置采样口距离地面的高度为12米，采样流量为100 L/min，滤膜为圆形普通玻璃纤维滤膜，有效直径为80 mm，采样时间设为连续的24h；周边不同区域环境中的表层土壤样本、地面灰尘样本、植物叶片表层灰尘样本按照采样点分布图采集，以空气采样仪所在位置为中心，从内向外半径500m，2km，5km和10km的同心圆上尽量均匀地设置典型区域采样点，各同心圆上设置的采样点个数分别为4、8、16和32个，用灭菌处理的小刷子、无菌刮刀和自封袋采集表层土壤样本、地面灰尘样本和植物叶片表层灰尘样本。

所述步骤4）为：用Mothur程序分析混合测序文库在Ion Torrent、454、Illumina测序平台测序完成的下机数据，利用Silva数据库将空气颗粒物样本微生物DNA序列与区域表层尘土样本微生物DNA序列进行比对注释，并放于同一个文件夹中进行聚类分析，用主坐标分析法PCoA通过一系列的特征值和特征向量排序后，选择主要特征值，找到距离矩阵中最主要的坐标，绘制出主坐标分析图，观察个体或群体间的差异，根据各样本 OTU 组成和丰度的差异，利用R软件包计算样品间的相似度，绘制样本相似度树图。

所述步骤5）为：根据主坐标分析图和样本相似度树图的显示，若周边环境样本与空气颗粒物样本微生物群落的相似度高，即周边环境样本为当地空气颗粒物的潜在主要来源，若周边环境样本与空气颗粒物样本微生物群落差异性高，则认为周边环境样本不是空气颗粒物的主要来源，排查每一个周边环境表层样本，探明区域内潜在的空气颗粒携带微生物的来源，进而判断雾霾的区域性潜在来源。

所述步骤6）为：首先，查询与人体呼吸道疾病与过敏反应有关的常见病原菌和致敏菌，建立空气病原菌和致敏菌的名单；然后，下载Silva数据库，根据病原菌和致敏菌名单简化Silva数据库，建立Silva简化数据库；再利用Silva简化数据库，在步骤2）获得的混合测序文库中挑出病原菌和致敏菌的DNA序列，建立新的混合测序文库；最后，针对新的混合测序文库，重复步骤4）和步骤5），探明区域内潜在的空气颗粒物携带病原菌和致敏菌的潜在来源。

本发明的有益效果：1）本发明可用于空气颗粒物表面所携带微生物的区域潜在来源的调查，可分析TSP、PM10与PM2.5等多种粒径悬浮颗粒物表面携带微生物的群落与区域周边表层样本微生物群落之间的关系；2）本发明通过比较不同颗粒物中微生物种群与周围环境样本中微生物种群的相似度和差异性来判断雾霾颗粒物中微生物的产生源和输送源，可以为微生物污染源控制提供依据；3）本发明从微生物群落的角度解析雾霾的来源，为雾霾的防治提供理论指导。其中，空气颗粒物中病原微生物和致敏菌的区域源解析，对人类的健康具有重要的意义。

附图说明

图1是空气颗粒物携带微生物的区域源解析方法流程图；

图2是空气颗粒物样本和区域典型表层尘土样本采集点分布图；

图3是实施例中空气颗粒物样本和周边表层尘土样本微生物主坐标分析图；

图4是实施例中空气颗粒物样本和周边表层尘土样本微生物群落相似度分析树图。

具体实施方式

   为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

 如图1所示，一种空气颗粒物携带微生物的区域源解析方法的步骤如下：

1）空气颗粒物样本和区域典型表层尘土样本的采集，于同一采样日分别采集空气颗粒物样本和周边不同区域环境中的表层土壤样本、地面灰尘样本、植物叶片表层灰尘样本；

2）微生物DNA的提取与高通量测序，提取空气颗粒物样本和周边不同区域环境中的表层土壤样本、地面灰尘样本、植物叶片表层灰尘样本的微生物DNA，进行DNA质量的检验，测定及检验合格的样本进行相等DNA浓度混合，建立混合测序文库，利用高通量测序技术获得混合测序文库中DNA目的片段序列；

3）样本群落结构分析，将所得DNA目的片段序列与Silva数据库中的已知序列进行比对，鉴定所得样本中微生物的系统分类；

4）主坐标分析与群落相似度分析，利用Mothur程序和R软件包对所得高通量序列进行单个和多个样本间群落相似度的比较分析；

5）空气颗粒物携带微生物潜在区域来源解析，根据空气颗粒物样本和周边不同区域环境中的表层土壤样本、地面灰尘样本、植物叶片表层灰尘样本的群落相似度分析结果解析区域内潜在的空气微生物来源；

6）致病菌和致敏菌来源解析，将已知的人体呼吸道和人体皮肤接触易感染的病原菌和致敏菌在序列分析中单独列出，重复步骤4）和步骤5），找出病原菌和致敏菌在区域内的主要潜在来源。

 所述步骤1）为：选择同一采样日采集空气颗粒物样本和周边不同区域环境中的表层土壤样本、地面灰尘样本、植物叶片表层灰尘样本，空气颗粒物样本由三台同型号的空气采样仪同时同地采集，所用空气采样仪为青岛崂山应用技术研究所生产的2050型中流量空气采样仪，该型号空气采样仪配备三种不同颗粒物粒径的切割器，可同时分别采集TSP、PM10、PM2.5空气颗粒物样本，采样之前将切割器和采样滤膜进行高温灭菌，设置采样口距离地面的高度为12米，采样流量为100 L/min，滤膜为圆形普通玻璃纤维滤膜，有效直径为80 mm，采样时间设为连续的24h；周边不同区域环境中的表层土壤样本、地面灰尘样本、植物叶片表层灰尘样本按照采样点分布图采集，以空气采样仪所在位置为中心，如附图2：从内向外半径500m，2km，5km和10km的同心圆上尽量均匀地设置典型区域采样点，各同心圆上设置的采样点个数分别为4、8、16和32个，用灭菌处理的小刷子、无菌刮刀和自封袋采集表层土壤样本、地面灰尘样本和植物叶片表层灰尘样本。

所述步骤4）为：用Mothur程序分析混合测序文库在Ion Torrent、454、Illumina测序平台测序完成的下机数据，利用Silva数据库将空气颗粒物样本微生物DNA序列与区域表层尘土样本微生物DNA序列进行比对注释，并放于同一个文件夹中进行聚类分析，用主坐标分析法PCoA（principal co-ordinate analysis）通过一系列的特征值和特征向量排序后，选择主要特征值，找到距离矩阵中最主要的坐标，绘制出主坐标分析图，观察个体或群体间的差异（如附图3：图中每个点表示一个样本，点之间的距离越近，样本间组成越相似。图3注释：水边植物表层灰尘：E1、E2；土壤表层尘土：E3、E4；马路边灰尘E5、E6；空气颗粒物样本：A17、A18、A19、A2、A3、A4、A5、B1、B12Z、B2、B4、C2、C3、C4。）；根据各样本 OTU 组成和丰度的差异，利用R软件包计算样品间的相似度，绘制样本相似度树图（如附图4：图中每个分支表示一个样本，分支距离越近，样本间组成越相似。图4中A、B、C类样本为空气颗粒物样本，E类样本为周边表层尘土样本，注释与图3相同。）。

所述步骤5）为：根据主坐标分析图和样本相似度树图的显示，若周边环境样本与空气颗粒物样本微生物群落的相似度高，即周边环境样本为当地空气颗粒物的潜在主要来源，若周边环境样本与空气颗粒物样本微生物群落差异性高，则认为周边环境样本不是空气颗粒物的主要来源，排查每一个周边环境表层样本，探明区域内潜在的空气颗粒携带微生物的来源，进而判断雾霾的区域性潜在来源。

所述步骤6）为：首先，查询与人体呼吸道疾病与过敏反应有关的常见病原菌和致敏菌，建立空气病原菌和致敏菌的名单；然后，下载Silva数据库，根据病原菌和致敏菌名单简化Silva数据库，建立Silva简化数据库；再利用Silva简化数据库，在步骤2）获得的混合测序文库中挑出病原菌和致敏菌的DNA序列，建立新的混合测序文库；最后，针对新的混合测序文库，重复步骤4）和步骤5），探明区域内潜在的空气颗粒物携带病原菌和致敏菌的潜在来源。

  以上所述仅为本发明的较佳实施方案，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。