褐飞虱Carbonic Anhydrase(CA)基因片段及其应用

摘要

本发明提供一种褐飞虱Carbonic Anhydrase(CA)基因片段及其应用，褐飞虱CA基因，序列如SEQ ID No.1所示；及其dsRNA，序列如SEQ ID No.2所示。该基因可应用于抑制褐飞虱生长发育，影响褐飞虱存活率。并可将其转入水稻中，研究转基因水稻对褐飞虱的生物学影响。为此本发明为无公害、可持续防治褐飞虱提供了新的有效途径。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体涉及褐飞虱CA基因片段及其dsRNA和dsRNA致死褐飞虱中的应用。

背景技术

褐飞虱()Brown planthopper(BPH)属半翅目(Hemiptera)，飞虱科(Delphacidae)。寡食性害虫，自然条件下只能在水稻(Oryza sativa L.)和普通野生稻上完成正常发育和生活周期(Sogawa 1982；巫国瑞等，1987)。是我国水稻作物上的重要害虫，褐飞虱属寡食性害虫，通过以下几种途径对水稻造成严重的危害：1.直接刺吸危害，成、若虫均以刺吸式口器刺吸水稻组织汁液，吸取植株养分，影响水稻的正常生长，使植物生长缓慢、产量下降。稻株受害严重时甚至倒伏瘫痪，俗称“冒穿”。2.褐飞虱产卵时产卵器刺伤稻株的茎杆组织，形成大量伤口，使水分散发，同时破坏了水稻植株的输导组织，加速水稻倒伏。产卵后孵化出的后代继续危害水稻植株，加重了水稻受害程度；3.褐飞虱还是传播水稻齿叶矮缩病和草状丛矮病的虫媒。通过取食产卵时造成的伤口传播，利于水稻纹枯病、小球菌核病的侵染；取食危害时排泄的“蜜露”含有丰富的各类糖类、氨基酸等组分，利于霉菌的滋生。(程遐年等，2003；Wei et al.2009)。20世纪90年代以来，褐飞虱在我国的发生和危害十分频繁和严重。1991年我国褐飞虱危害面积达到2320万hm²，损失稻谷高达166万吨(程遐年等，2003)；2005年爆发猖獗，仅长江中下游地区发生面积达777.8万hm²，损失稻谷约15亿kg(傅强，张志涛2006)。在我国，褐飞虱每年危害直接造成稻谷损失为10～15亿kg(李汝铎等，1996)。目前褐飞虱的防治仍以化学防治为主，化学农药的大量使用导致其对多种农药产生抗性及交互抗性，同时带来了如：生态系统的破坏、自然环境的污染、农药残留等问题。褐飞虱的防治迫切需要更加可靠、有效的新防治途径。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指外源或内源的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)特异性地引起基因表达沉默的现象。之前研究者已经通过体外注射、人工饲喂及转基因植物等方法进行褐飞虱的相关基因功 能的验证及致死基因的筛选(Wu et al.2012；Chen et al.2010；Zha et al.2011)。植物介导的RNAi技术已成为农作物抗虫基因工程的热点之一，通过寄主植物表达相应昆虫特异基因的dsRNA，昆虫取食植物后沉默其相应的基因从而达到控制害虫危害的目的。Baum等利用转基因玉米表达ATPase A基因的dsRNA对鞘翅目害虫玉米根萤叶甲进行RNAi研究，取得了良好的防治效果(Baum et al.2007)。Mao等利用可表达基因P450(CYP6AE14)dsRNA的转基因棉花对鳞翅目害虫棉铃虫的目的基因进行干扰，棉铃虫体内靶标基因转录水平显著降低，生长受到抑制(Mao et al.2007)。Zha等利用转基因水稻对褐飞虱中肠基因NLHT1(hexose transporter gene)、Nlcar(carboxypeptidase gene)及Nltry(trypsin-like serine protease gene)进行RNAi研究，褐飞虱取食转基因水稻2天后其靶标基因转录水平均显著降低，在取食4天后其靶标基因转录水平分别降低59.3％、43.3％、73.3％(Zha et al.2011)。上述研究表明，利用RNAi技术发展转基因水稻进行褐飞虱防治成为可能。尽管利用这些转基因水稻品系,可以在一定程度上降低相关基因的转录水平，但对褐飞虱的致死效果并不明显。因此，至今为止，国内外尚没有克隆到褐飞虱的相关靶标基因，可以通过转基因水稻沉默该基因而达到控制褐飞虱的目的。

本申请所涉及的参考文献具体如下，

1、程遐年,吴进才,马飞.(2003).褐飞虱研究与防治.北京:中国农业出版社,11-137.

2、傅强，张志涛.(2006).2005年稻飞風暴发情况、成灾原因及2006年控制对策.江苏省昆虫学会通讯，(3)：13-15.

3、李汝铎，丁锦华，胡国文，等.(1996).褐飞虱及其种群管理.上海：复旦大学出版社.

4、巫国瑞,胡萃,许绍朴.(1987).稻飞虱.北京:农业出版社,11-31.

5、Baum,J.A.,Bogaert,T.,Clinton,W.,Heck,G.R.,Feldmann,P.,Ilagan,O.,Johnson,S.,Plaetinck,G.,Munyikwa,T.,Pleau,M.,Vaughn,T.and Roberts,J.(2007).Control of coleopteran insect pests through RNA interference.Nature Biotechnology 25(11),1322-1326. 

6、Chen,J.,Zhang,D.,Yao,Q.,Zhang,J.,Dong,X.,Tian,H.and Zhang,W.(2010).Feeding-based RNA interference of a trehalose phosphate synthase gene in the  brown planthopper,Nilaparvatalugens.Insect Molecular Biology 19(6),777-786. 

7、Fu,Q.,Zhang,Z.,Hu,C.,Lai,F.and Sun,Z.(2001).A chemically defined diet enables continuous rearing of the brown planthopper,Nilaparvatalugens()(Homoptera:Delphacidae).Applied Entomology and Zoology 36(1),111-116. 

8、Livak,K.J.andSchmittgen,T.D.(2001).Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2^-ΔΔCTmethod.Methods 25(4),402-408. 

9、Mao,Y.B.,Cai,W.J.,Wang,J.W.,Hong,G.J.,Tao,X.Y.,Wang,L.J.,Huang,Y.P.and Chen,X.Y.(2007).Silencing a cotton bollworm P450monooxygenase gene by plant-mediated RNAi impairs larval tolerance of gossypol.Nature Biotechnology 25(11),1307-1313. 

10、Sogawa,K.(1982).The rice brown planthopper:feeding physiology and host plant interactions.Annual Review of Entomology 27(1),49-73. 

11、Wei,Z.,Hu,W.,Lin,Q.,Cheng,X.,Tong,M.,Zhu,L.,Che,R.and He,G.(2009).Understanding rice plant resistance to the Brown Planthopper(Nilaparvatalugens):a proteomic approach.Proteomics 9(10),2798-2808. 

12、Wu,W.J.,Wang,Y.,Huang,H.J.,Bao,Y.Y.and Zhang,C.X.(2012).Ecdysone receptor controls wing morphogenesis and melanization during rice planthopper metamorphosis.Journal of Insect Physiology 58(3),420-426. 

13、Yang Y Y,Mei F,Zhang W,et al.Creation of Bt Rice Expressing a Fusion Protein of Cry1Ac and Cry1I-Like Using a Green Tissue-Specific Promoter[J].Journal of economic entomology,2014,107(4):1674-1679. 

14、Zha,W.,Peng,X.,Chen,R.,Du,B.,Zhu,L.and He,G.(2011).Knockdown ofmidgut genes by dsRNA-transgenic plant-mediated RNA interference in the hemipteran insect Nilaparvatalugens.PLoS One 6(5),e20504. 

发明内容

本发明的目的在于针对目前技术的不足，提供一种褐飞虱CA基因片段及其 dsRNA和dsRNA在致死害虫中的应用。

本发明所述的褐飞虱CA基因，其特征在于含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

所述的褐飞虱CA基因的dsRNA，其特征在于含有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

所述的褐飞虱CA基因在控制褐飞虱存活率中的应用。

所述的褐飞虱CA基因在控制褐飞虱繁殖力中的应用。

所述的褐飞虱CA基因在水稻抗褐飞虱育种中的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：首先，克隆褐飞虱致死基因片段CA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，并对序列进行测序验证；以已测序验证的CA基因片段序列为模板合成dsRNA，其序列如SEQ ID NO：2所示。然后对褐飞虱CA基因沉默效果进行检测。进一步将该基因转入水稻中，研究转基因水稻对褐飞虱的生物学影响。

克隆本发明中所述的褐飞虱基因CA的方法是本领域中所常采用的方法。本发明中所述的提取褐飞虱若虫总RNA、合成cDNA第一条链、合成dsRNA、实时荧光定量RT-PCR、褐飞虱dsRNA饲喂、载体构建、转基因等方法都是本领域成熟的技术，试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)、AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒、T7Kit(ambion)试剂盒等都可以从生产商家购买。

本发明的优点在于：

1、本发明是国内外首次公开褐飞虱CA基因核苷酸序列。目前关于其抑制表达并可显著影响褐飞虱生长发育的功能未见相关报道。

2、将dsRNA饲喂褐飞虱后，可高效的沉默了褐飞虱的CA基因。褐飞虱取食CA基因dsRNA后其靶标基因mRNA水平显著降低。不仅在高浓度(0.5μg/μl)时可沉默该基因并对褐飞虱产生更显著的致死效果，在较低浓度(0.1μg/μl)也可沉默该基因并对褐飞虱产生明显的致死效果。说明利用褐飞虱CA基因可以控制褐飞虱存活率。

3、转基因水稻CA对褐飞虱的若虫发育历期、世代周期、寿命及繁殖力等产生显著影响，最终达到防治的效果。表明褐飞虱CA基因可以控制褐飞虱繁殖 力，且该基因的利用对水稻抗虫育种，特别是对水稻的抗褐飞虱育种起着重要的促进作用。

为此本发明为无公害、可持续防治褐飞虱提供了新的有效途径，且CA基因dsRNA具有广阔的应用前景。可利用CA的沉默技术来防治水稻重要害虫褐飞虱及具有相似结构域的半翅目害虫，为绿色防治水稻害虫提供了一个新的思路和技术。

附图说明

图1CA基因目的片段PCR扩增，M：GeneRuler 1kb DNA Ladder；泳道1-2：CA基因片段的PCR产物；

图2对照基因GFP片段PCR扩增，M：GeneRuler 1kb DNA Ladder；泳道1-2：GFP基因片段的PCR产物；

图3CA基因目的片段dsRNA的制备，M：GeneRuler 1kb DNA Ladder；泳道1：CA基因片段的dsRNA；

图4dsRNA的制备，M：GeneRuler 1kb DNA Ladder；泳道1：GFP的dsRNA；

图5人工饲料饲喂褐飞虱流程图，1：添加人工饲料；2：密封试管一段；3：接入褐飞虱并密封试管另一端；4：生测；

图6饲喂CA基因的dsRNA后褐飞虱的存活率

ck：0.5μg/μldsGFP；A：0.5μg/μldsCA；B：0.1μg/μldsCA；C：0.02μg/μldsCA；*Means significantly different from control at P<0.05.**Means significantly different from control at P<0.01(t-test). 

图7饲喂CA基因的dsRNA对褐飞虱mRNA表达水平的影响

ck：0.5μg/μldsGFP；A：0.5μg/μldsCA；B：0.1μg/μldsCA；C：0.02μg/μldsCA；*Means significantly different from control at P<0.05.**Means significantly different from control at P<0.01(t-test). 

图8转基因水稻品系A-73的转化载体1300-Ubi35s-G10-Ubi-RNAi-CA的T-DNA区域结构示意图；

图9转基因水稻CA的dsRNA检测1-10：转基因水稻材料；-：受体材料秀水134为阴性对照。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例1.CA基因片段的克隆方法：

(1)取褐飞虱各龄若虫共50头，用Trziol法提取总RNA。

1)放入用液氮已预冷的无RNase的研钵中，加入液氮迅速研磨，研磨至粉末状迅速转移到预冷的2ml离心管中。

2)加入1ml Trizol，上下颠倒轻柔混合均匀，室温下放置5min。

3)加入Trizol 1/5体积(即200μl)的氯仿，剧烈震荡20s，冰上放置3min。4℃12,000×g离心15min。

4)将上层水相转移至另一1.5ml离心管，加入与水相等体积的异丙醇。将离心管上下颠倒轻柔混合均匀，室温静置15min。4℃12,000×g离心15min。

5)倒掉上清，加入1ml在冰上已预冷的75％乙醇至离心管中，洗涤提取的RNA，轻弹管壁使RNA沉淀悬浮。4℃7,500×g离心5min。

6)倒掉上清，将离心管放入通风橱中干燥10min。

7)加入50-100μl DEPC处理过的去离子水至离心管中，用枪头反复轻柔吹打至RNA完全溶解。

(2)利用试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)cDNA第一链的合成。

(3)根据对褐飞虱基因组数据库设计引物P1和P2，以RT-PCR方法进行扩增。上游引物(P1)5'-ATGGTCGGATTCCACAACATGTTTCTGCACCC-3'(SEQ ID NO：3)

下游引物(P2)5'-CTCACAAACACCTTCCTGTGTCC-3'(SEQ ID NO：4)反应体系如下：

反应条件为 

(4)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收目标DNA片段。

(5)将回收的目标片段与pMD18-T连接转化至TG1细胞中，挑取阳性克隆进行测序。

(6)对已测序的序列在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastx&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_L OC＝blasthome进行同源性比对分析，预测该序列为褐飞虱Carbonic Anhydrase(CA)基因的片段。CA基因片段序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2.dsRNA合成及回收 

(1)根据已测序验证的CA基因片段序列，设计引物P3(SEQ ID NO：5)和P4(SEQ ID NO：6)，在上下游引物5'端加入T7启动子序列TAATACGACTCACTATAGGG。实施例1中测序正确的pMD18-CA质粒为模板。设计带有T7启动子的引物P5(SEQ ID NO：7)和P6(SEQ ID NO：8)，以Pmd18-GFP质粒为模板，扩增获得dsGFP的合成模板。

上游引物(P3)：

5’-TAATACGACTCACTATAGGG ATGGTCGGATTCCACAACATGTTTC-3’

下游引物(P4)：

5’-TAATACGACTCACTATAGGG CTCACAAACACCTTCCTGTGTCC-3’

上游引物(P5)：

5’-TAATACGACTCACTATAGGG ATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3’

下游引物(P6)：

5’-TAATACGACTCACTATAGGG TTTGTATAGTTCATCCATGC-3’

扩增反应条件：94℃，1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃10min。

(2)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离(见图1、图2)，利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒目的DNA回收。

(3)利用试剂盒T7Kit(ambion)进行CA基因片段及GFP基因片段dsRNA的合成。按照试剂盒说明，其操作如下：

反应结束后，加入1μl TURBO Dnase，轻柔混匀。37℃15min。

(4)纯化回收dsRNA产物(Licl沉淀法)：

1)加入30μl Nuclease-free water及30μlLicl Precipitation Solution，轻柔混匀。-20℃放置30min以上。4℃14,000×g离心15min。

2)倒掉上层液体，加入1ml 70％乙醇悬浮洗涤，14,000×g离心15min。

3)倒掉乙醇并在通风橱中晾干，加入30-50μl ddH₂o溶解。Nano Drop 2000检测dsRNA的浓度及纯度。制备结果见图3、图4。CA基因dsRNA序列如SEQ ID NO：2所示。

4)-20℃保存。

实施例3.dsRNA饲喂实验(见图5)

(1)选用两端开口，长9.5cm直径2.5cm的玻璃试管为饲喂褐飞虱容器。一端先用一层parafilm密封，加入60μl人工饲料，再用一层parafilm密封，使加入的人工饲料均匀分布于两层膜中间。

(2)接入30头生长发育一致的褐飞虱3龄若虫，同步骤(1)密封试管另一端。

(3)将已经添加好饲料的试管用黑布(或不透光材料)避光处理，使褐飞虱趋向已添加人工饲料并用parafilm密封的两端取食，每24h更换一次新的dsRNA饲料。实验在人工气候室中进行，设置条件：温度25±1℃，湿度70±5％,光照周期为16个小时光照，8小时黑暗。人工饲料参照傅强等方法配制褐飞虱人工饲料(Fu et al.2001)

(4)本试验设了3个浓度：0.5μg/μl(A)、0.1μg/μl(B)、0.02μg/μl(C)，0.5μg/μldsGFP作为对照(ck)。每个试管接入30头，每个处理90头，重复3次。每天更换新的人工饲料，并观察记录褐飞虱的生长发育、存活状况。持续饲喂8天，每24h统计死亡率，结果如图6所示。

(5)持续饲喂褐飞虱dsRNA后4天、8天，每个处理随机取6头提取RNA，重复三次。提取的RNA经DNase I消化后测定浓度和纯度，取1μg进行反转录，稀释5倍(终体积100μl)。Real-Time qPCR所用的仪器为ABI Prism 7300Real-time PCR system(Applied Biosystems，Foster City，CA,USA)。Real-Time qPCR选用褐飞虱β-actin基因(GenBank accession no.EU179846)作为内参，设计用于qRT-PCR的引物见表1。两步法PCR反应程序进行反应，95℃，3min；95℃，15s，60℃，1min，40个循环；增加溶解曲线。qRT-PCR所获得的数据利用DPS统计软件进行数据处理分析。基因相对表达量采用Livak和Schmittgen(2001)的方法进行计算。褐飞虱取食CA基因dsRNA后其靶标基因mRNA水平显著降低，如图7所示。说明利用褐飞虱CA基因可以有效控制褐飞虱存活率。

表1用于qRT-PCR的引物

所用试剂为ComSYBRqPCR Mix(with ROX)(Sigma biotech)，配制反应液需 要在冰上进行。反应体系如下：

实施例4.转基因CA表达dsRNA水稻抗虫功能研究

转化载体构建及转基因水稻的获得

设计如表2所示的引物，以褐飞虱的cDNA为模板进行目的片段扩增。将获得的测序正确的目的片段进行相应酶切位点的酶切，先后将目的片段连入含有intron的pUCm-T载体中，获得含正反向CA片段的中间载体。对获得的中间载体进行相应酶切位点的酶切将目的片段连入最终载体中1300-35sUbi-G10，获得可表达目的基因dsRNA的载体1300-35sUbi-G10-RNAi-CA，结构示意图如图8所示。1300-35sUbi-G10载体由pCAMBIA1300载体改造优化而成：玉米泛素启动子(Ubi)启动的抗草甘膦基因(G10)替换35s启动子启动的抗潮霉素基因(hpt II)。转化受体为秀水134成熟种子诱导产生的胚愈伤组织，农杆菌介导的遗传转化法参照(Yang et al.,2014)。

表2获得目的片段所用引物及相应的限制性内切酶

T₀代转基因水稻的dsRNA检测

利用Trizol法提取待测样品总RNA，05％TBE为电泳缓冲液进行凝胶电泳 分离，60-70V电压2-3h。操作步骤同Souhern blot，利用之前获得的CA基因片段按照DIG High Prime DNA Labelling and Detection starter kit II试剂盒说明进行目的探针的制备。转基因植株可看到清晰的杂交信号，而对照植株没有特异大小的杂交信号，如图9所示。

转基因水稻对褐飞虱生长发育的影响

该试验在人工气候室中进行，设置条件：温度25±1℃，湿度70±5％,光照周期为16个小时光照，8小时黑暗。选取长势一致、健壮的阳性转基因植株及转化母本秀水134(对照)种于杯子内，每杯种植一棵，植株底部用海绵条固定在圆形底板上，杯子中加满水稻营养液。选取12小时内孵化的初孵一龄若虫接至待测植株上，用海绵条密封上部薄圆片，防止褐飞虱若虫逃逸。每株接5头试虫，每个处理15株，重复三次。每天8:00、20:00观察记录褐飞虱若虫的生长发育、蜕皮及存活状况，直至羽化。将同天羽化的雌虫、雄虫配对，每对雌雄成虫转移至新的对应基因的单株水稻苗上，重复30对。产卵前雄虫出现死亡时,则追加雄虫,以保证雌虫能交配。每天8:00、20:00时观察记录褐飞虱成虫的生长发育、存活状况。观察记录卵孵化状况，记录初孵若虫的数量，并移除已记录的若虫，直至没有若虫出现。

表3取食转基因水稻对褐飞虱的生物学影响

Values are given as means(±standard deviation).*Means significantly different from control at P<0.05.**Means significantly different from control at P<0.01(t-test). 

结果表明，转基因水稻CA对褐飞虱的若虫发育历期、世代周期、短翅型雌虫寿命及繁殖力等产生显著影响，如表3所示。说明该基因的利用对水稻抗虫育种，特别是对水稻的抗褐飞虱育种起着重要的促进作用，可应用于水稻抗褐飞虱育种中。