霍氏肠杆菌CL2013及制备六价铬修复菌剂的方法

摘要

一株从铬渣堆场土壤中分离筛选出来的霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）CL.2013菌株于2015年1月27日保藏，保藏号为CGMCC No.10451。该菌株在LB培养基上培养，细胞形状为杆状，革兰氏染色阴性；培养3天，菌落颜色为乳白，菌落形态为圆形、光滑，通过生理生化反应和分子生物学鉴定确定该菌株为霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)。霍氏肠杆菌CL.2013菌株对六价铬具有强大的还原作用。本发明还公开了用霍氏肠杆菌CL.2013菌株和万寿菊加工废液与废渣制备六价铬修复菌剂的方法，其方法简单、成本低廉，没有二次污染，使用方便，具有广阔的市场前景。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物及应用领域，具体地涉及一种对六价铬具有还原作用的霍氏肠杆菌和该霍氏肠杆菌发酵液的制备以及利用该霍氏肠杆菌和万寿菊加工废液和废渣制备六价铬修复菌剂的方法。

背景技术

铬(Ⅵ)是地下水、土壤和底泥中第二大危害重金属，在美国EPA优先污染物名单排名第6位，是117种对人体危害极大的优先污染物之一，对人体有急性、亚急性、慢性毒性，有致癌变、致畸变、致突变作用 。由于铬酸根离子(CrO₄^2-)与硫酸根离子(SO₄^2-)的结构相似性，铬酸根离子很容易通过硫酸盐离子通道进入生物膜，并进一步与细胞质内的某些物质发生氧化还原反应，随之产生的活性氧对细胞的伤害极大。由于极高的水溶性，六价铬的毒性远远高于三价铬，约为三价铬毒性的100倍。进入人体细胞的六价铬还可造成DNA断裂，细胞染色体发生畸变等。铬渣中的铬(Ⅵ)不稳定，易溶于酸或水后进入环境，造成污染。根据2012年6月环保部发布的《2011年中国环境状况公报》，截至2011年底，全国累计处置铬渣超过400万吨，但这并不意味着历史遗留铬渣已治理完毕，并且渣堆下土壤污染物在地表径流和生物地球化学作用下还会发生迁移，造成更大面积的土壤/场地污染。随着这些有害物质的大量排放，矿产及周边土壤环境受到不同程度的复合污染，威胁农业生产、粮食安全和人体健康。

铬在环境中主要以Cr (Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的形态存在，其中Cr (Ⅲ)溶解度小，移动性弱，毒性小，而Cr(Ⅵ)易溶于水，氧化性强，毒性大，约是Cr(Ⅲ)的100倍。因此，把Cr(Ⅵ)转变成Cr(Ⅲ)，不仅是一种有效的解毒方式，而且也是终从环境中去除铬的关键步骤。

目前针对六价铬污染的传统治理方法有固定化/稳定化、化学还原、化学淋洗、电动修复和植物修复等，但大多对场地要求较高，限制较多，而生物处理技术与传统处理技术相比，具有快速、安全、费用低等优点，因此被称为是一种新兴的环境友好代替技术。从六价铬污染介质中分离微生物，并有针对性地将其应用于污染土壤及水体的修复治理过程中，是一种较为理想的修复方法。

万寿菊富含天然叶黄素，是目前提取天然叶黄素的主要原料。天然叶黄素作为一种重要的天然色素，越来越受到国内往外食品、医药等企业的青睐，但是随之带来的环境污染问题也成为万寿菊产业发展的制约因素，其生产过程中主要排放物是万寿菊鲜花经过微生物发酵后的酸性废液和提取完叶黄素的废弃花渣。其中含有大量的乳酸、氨基酸、腐植酸等有机成分，还含有大量的木质素、纤维素、微量元素等成分，如果将其随意排放不但污染环境，而且浪费了宝贵的资源。随着万寿菊的栽培及生产规模扩大，对万寿菊压榨污水资源合理处理已渐渐引起社会的关注。中国专利201410283919.6公开了一种利用万寿菊鲜花废水制备有机液体肥的方法。该方法主要是通过氢氧化钾将酸性废液调节至中性，将中和后的中和液储存在发酵池中，温度在4℃至37℃条件下，发酵时间不少于1 个月，制得有机液体肥。中国专利201410225056.7公开了一种万寿菊提取叶黄素的压榨污水的综合处理方法。然而，万寿菊压榨污水酸度高，有机质含量大，在处理过程中存在能耗高、难达标等问题。因此，万寿菊加工废水及废渣的资源化利用技术开发非常紧迫。

发明内容

本发明的目的是针对性现有技术存在的不足，提供一种利用万寿菊加工废水及废渣生产六价铬微生物修复菌剂的方法。

本发明的技术方案如下：

一株霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）CL.2013菌株，于2015 年1月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.10451，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

所述的霍氏肠杆菌CL.2013是从铬渣堆场土壤中分离筛选出来的。该菌株在LB培养基上培养，细胞形状为杆状，革兰氏染色阴性；培养3天，菌落颜色为乳白，菌落形态为圆形、光滑（见图1）。经生理生化鉴定，其特征见表1；

利用细菌16S rDNA 通用引物，用PCR的方法扩增霍氏肠杆菌CL.2013菌株菌株16S rDNA 部分片段，PCR 产物测序获得该片段序列，测序所得CL.2013菌株的 16S rDNA(长度 1405bp)结果如下：

CCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATTCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACGCACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATGCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCTAACCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAGTCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGCCTGCCAGTTTCGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCCGACTTGACAGACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCGACAAGGTTATTAACCTTATCGCCTTCCTCCCCGCTGAAAGTACTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCATACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTAGGTGAGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAATCCCATCTGGGCACATCCGATGGCAAGAGGCCCGAAGGTCCCCCTCTTTGGTCTTGCGACGTTATGCGGTATTAGCTACCGTTTCCAGTAGTTATCCCCCTCCATCAGGCAGTTTCCCAGACATTACTCACCCGTCCGCCACTCGTCAGCAAAGCAGCAAGCTGCTTGCCTGTTACCGTTCGTGCTGCATGGT

将上述所得测序结架应用BLAST工具进行基因同源性和相似性分析，经Blast同源性检索，可知CL.2013菌株的16S rDNA序列与霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）的同源性最高，达到了99%-100%(见表2)。

根据BLAST分析结果，CL.2013菌株所属生物细菌分类学信息如下：

domain Bacteria (0/20/659718)

phylum “Pmteobacteria” (0/20/183305)

class “Gammapwteobacteria” (0/20/83510)

order “Enterobacteriales” (0/20/18387)

family “Enterobacteriaceae”(0/20/18387)

genus “Enterobacter hormaechei”(0/20/1678)

因此，将该新菌株鉴定为霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei），并命名为霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）CL.2013。

微生物在除铬(VI)的过程中，会受到很多环境因子的限制。这是微生物本身的生长代谢过程所决定的。因此，在研究微生物还原铬(VI)的过程时，应当着重考察各种环境因子对其除铬(VI)效果的影响，为将来微生物在除铬(VI)方面的实际应用和除铬(VI)的工艺设计奠定一定的基础。研究表明，霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）CL.2013不同pH值、温度、Cr(Ⅵ)初始浓度对微生物还原Cr(Ⅵ)的能力都有一定的影响。试验表明，菌株CL.2013的最适pH为8、最适温度30 ℃。在Cr(Ⅵ)初始浓度高达800 mg·L^-1时，CL.2013菌株对Cr(Ⅵ)还具有一定的还原作用，与现有国内外已发现的Cr(Ⅵ)还原菌相比，其还原能力强大的多。该研究对生物法去除Cr(Ⅵ)的实际应用起到一定的促进作用。这为今后治理Cr(Ⅵ)高污染土壤提供了一种高效的菌种。

本发明用万寿菊加工废液与废渣制备六价铬修复菌剂的方法，包括如下步骤：

（1） 制备菌种活化培养基  在LB培养基中添加葡萄糖1g/L，灭菌15-30min，待用；

（2）制备活化种子 将保藏在斜面试管中的本发明的霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）CL.2013菌株接入（1）制备好的培养基中，在28 -35℃、120-180r/min振荡培养12-16h，得到活化种子；

（3）制备液体种子培养液 用氢氧化钠水溶液调节万寿菊提取叶黄素的加工废水的pH 到6.5-7.5，于115 -121℃灭菌15-30min；

（4）制备液体种子 取（3）制备的培养液中接种（2）制备的活化种子，接种量为8%-10%，于30-37℃、120-200r/min振荡培养24-48 h，得到液体种子；

（5） 制备发酵菌液 在（3）制备的培养液发酵罐中接种体积比为2％-15％（4）制备的液体种子，于25-35℃，通无菌空气培养12-48 h，当活菌数达到5×10⁸CFU/ ml时，得液体发酵菌液；

（6） 制备万寿菊花渣生物炭 将提取完叶黄素的万寿菊花渣晾干后粉碎至20-100目，放入管式反应炉内，在加热前，往炉内通20-30min气速为250cm³/min的氮气，使反应炉内为无氧环境，在升温速率5℃ /min 的条件下加热至300-600℃，保持3-6h，随后冷却至室温，得到黑色生物碳；

（7）制备六价铬修复固态菌剂  以制备好的生物碳为载体，按照发酵菌液∶生物碳为1︰1.2-5的质量比，将（5）制备发酵菌液添加到（7）制备的生物碳中，充分混合均匀，通风干燥至菌剂含水量在30％以下，包装，存放在阴凉干燥处，得到六价铬修复固态菌剂。

本发明的六价铬修复固态菌剂的使用方法：按六价铬污染的程度不同，取一定量的六价铬修复固态菌剂与被污染土壤混合、搅拌均匀，保持土壤含水量在50%-60%之间10天以上即可。

用本发明的六价铬修复固态菌剂修复六价铬污染土壤的试验

1、试验方法

取未污染土壤，风干，磨碎、过10目筛。过筛后的土壤中加入重铬酸钾溶液，制成土壤六价铬污染水平分别为250mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg的污染土壤。将各个污染水平的土壤分别称取3 个100g 的土壤，用本发明制备的六价铬修复固态菌剂在各污染水平处理中分别取质量份为10％、20％、30％的百分比，将修复剂与土壤混合，搅拌，土壤含水量控制在50%-60%之间，置于30℃的培养箱中培养，保持10d 后，测定土壤中六价铬的浓度。

2、试验结果

试验结果见表3。

试验表明，六价铬污染水平为250mg/kg 时，修复剂的添加量为污染土壤的10％时，六价铬含量即可降至98.78％，再增加修复剂的添加量效果也没有显著差异；铬污染水平为500mg/kg 时，修复剂的最佳添加量为污染土壤的30％，六价铬含量降低幅度最大可达74.20％；极显著高于其他两个处理；在铬污染水平为1000mg/kg 时，修复剂最佳添加量为污染土壤的30％，六价铬含量降低幅度可达58.78％，极显著高于其他两个处理。

本发明的有益效果

本发明的霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）CL.2013菌株的发酵液具有较强的还原六价铬的效果，在有氧、中温及碱性条件下，该菌株对Cr(Ⅵ)有较强的还原作用，相对于其它需要较高营养条件且环境适应能力差的铬还原菌，该菌株将更节约成本且环境适应能力强。在Cr(Ⅵ)初始浓度高达800 mg·L^-1时，CL.2013菌株对Cr(Ⅵ)还具有一定的还原作用，与现有国内外已发现的Cr(Ⅵ)还原菌相比，其还原能力强大的多。该研究对生物法去除Cr(Ⅵ)的实际应用起到一定的促进作用。

本发明利用万寿菊加工废液培养霍氏肠杆菌CL.2013菌株的发酵液，并利用万寿菊加工废渣制备成万寿菊花渣生物炭，再将霍氏肠杆菌CL.2013菌株的发酵液和生物炭制备成六价铬修复固态菌剂，制备原料均为工业废弃物，加工过程没有二次污染，属于环境友好型工艺。本发明的六价铬修复固态菌剂制备工艺简单，原料采用了万寿菊加工的废液和废渣，因此成本非常低廉。本发明的固态菌剂中含有大量碳素及其它一些营养元素，可为微生物和土壤作物生长提供丰富的碳源，利于微生物CL.2013菌株生长，且有肥田作用。经过试验表明，本发明的六价铬修复固态菌剂具有修复时间短(10天)、修改效果好(轻度污染修复在98%以上、重度污染修复在58%以上)，作为生物修复剂这已经达到非常好的效果。因此，本发明在修复六价铬土壤污染中具有广阔的市场前景。

附图说明

图1为本发明霍氏肠杆菌CL.2013菌落形态。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一株霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）CL.2013菌株，于2015 年1月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.10451，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

所述的霍氏肠杆菌CL.2013是从铬渣堆场土壤中分离筛选出来的。该菌株在LB培养基上培养，细胞形状为杆状，革兰氏染色阴性；培养3天，菌落颜色为乳白，菌落形态为圆形、光滑。经生理生化鉴定、16S rDNA系统发育分析，将该新菌株鉴定并命名为霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）CL.2013。

实施例2

利用本发明的霍氏肠杆菌CL.2013和万寿菊废水、废渣制备六价铬修复固态菌剂，其方法包括：

（1）制备菌种活化培养基  在LB培养基中添加葡萄糖1g/L，灭菌15-30min，待用；

（2）制备活化种子 将保藏在斜面试管中的本发明的霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）CL.2013菌株接入（1）制备好的培养基中，在28 -35℃、120-180r/min振荡培养12-16h，得到活化种子；

（3）制备液体种子培养液 将万寿菊提取叶黄素的加工废水用氢氧化钠水溶液调节废水的pH 到6.5-7.5，于115 -121℃灭菌15-30min；

（4）制备液体种子 取（3）制备的培养液中接种（2）制备的活化种子，接种量为8%-10%，于30-37℃、120-200r/min振荡培养24-48 h，得到液体种子；

（5） 制备发酵菌液 在（3）制备的培养液发酵罐中接种体积比为2％-15％（4）制备的液体种子，于25-35℃，通无菌空气培养12-48 h，当活菌数达到5×10⁸CFU/ ml时，得液体发酵菌液；

（6） 制备万寿菊花渣生物炭 将提取完叶黄素的万寿菊花渣晾干后粉碎至20-100目，放入管式反应炉内，在加热前，往炉内通20-30min气速为250cm³/min的氮气，使反应炉内为无氧环境，在升温速率5℃ /min 的条件下加热至300-600℃，保持3-6h，随后冷却至室温，得到黑色生物碳；

（7）制备六价铬修复固态菌剂  以制备好的生物碳为载体，按照发酵菌液∶生物碳为1︰1.2-5的质量比，将（5）制备发酵菌液添加到（7）制备的生物碳中，充分混合均匀，通风干燥至菌剂含水量在30％以下，包装，存放在阴凉干燥处，得到六价铬修复固态菌剂。

本发明的六价铬修复固态菌剂的使用方法：按六价铬污染的程度不同，取一定量的六价铬修复固态菌剂与被污染土壤混合、搅拌均匀，保持土壤含水量在50%-60%，10天以上即可。