用于检测17β-雌二醇的多壁碳纳米管的表面分子印迹聚离子液体及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了用于检测17β-雌二醇的多壁碳纳米管的表面分子印迹聚离子液体及其制备方法和应用，该聚离子液体是由羧基化多壁碳纳米管、功能单体、交联剂和模板分子在引发剂作用下聚合形成并除去模板分子的复合材料，所述功能单体为1-(1′-羟基丁烷)-3-乙烯基咪唑鎓六氟磷酸；所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯和3，3′-(1′，4′-丁烷)-双-1-乙烯基咪唑六氟磷酸；所述模板分子为17β-雌二醇。本发明合成的PIL/MWCNTs-MIP表面分子印迹复合材料对17β-雌二醇具有良好的电化学行为，对17β-雌二醇特异性吸附、灵敏度高和良好选择性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种表面分子印迹聚合物，尤其涉及一种用于检测17β-雌二醇的多壁碳纳米 管的表面分子印迹聚离子液体及其制备方法和应用。

背景技术

环境安全问题日趋受到各界的关注，实现环境安全快速检测是国家实施环境保护的基础， 然而随着国家经济的快速发展，环境安全问题日趋严重，因此发展快速、准确、灵敏的检测 环境中有害污染物的新技术非常必要。

雌二醇(estradiol，E₂)，是雌激素中一种典型的环境雌激素，同时也是雌激素中生物活性最 强的一种物质，由于其合成代谢的影响，已被广泛用于动物的育肥。其中17β-雌二醇 (17β-estradiol)是一种在低浓度下就可能导致中毒和致癌的天然雌激素，它可从外面进入身体， 干扰正常的生理过程，可引起体液免疫和细胞免疫的不平衡，导致生殖、免疫、心血管和神 经系统等许多病理变化。因此实现高效、快速、可靠、实时地检测水环境中痕量水平的雌二 醇，对国土安全和健康保护具有非常重要的实际意义。目前17β-雌二醇的检测方法主要有 HPLC、GC-MS、LC-MS等。虽然这些方法可以有效地检测低浓度的雌激素，但是它们的样 品前处理过程复杂，设备昂贵，灵敏度低、不适合大规模应用。放射免疫法(RIA)和酶联免疫 测定法(ELISA)可以提高检测的灵敏度，然而其基质不稳定性限制了它的广泛应用。电化学方 法具有简洁、直接、快速、有利于便携式和手持设备的生产等特点，该方法适用于环境样品 中17β-雌二醇的检测。

多壁碳纳米管(MWCNTs)，由于其独特的形貌和电化学性能而受到了广泛的关注。近年 来聚合物/碳纳米管(CNTs)纳米复合材料由于其与纯聚合物相比，在物理、热工、力学方面的 显著改善而引起广泛的研究兴趣。尽管许多研究已进行，以提高碳纳米管和聚合物之间的相 容性。然而，将碳纳米管均匀分散在聚合物基体中仍存在显著的挑战，特别是对于大规模的 工业应用。经过适当处理后的非共价功能化纳米管是一个有吸引力的技术，因为它不破坏延 伸π-π共轭结构，不会破坏CNTs机械性能和电化学特性。近来，发现离子液体(ILs)具有与 碳纳米管相互作用的强“π-阳离子”，这为制备分散在聚合物中的非共价修饰碳纳米管提供了 新的可能性。然而，目前很少有研究成功将ILs修饰的碳纳米管(CNTs)分散于聚合物基质。 在本研究中，我们将修饰多壁碳纳米管(MWCNTs)与广泛应用的室温离子液体结合制备表面 分子印迹聚合物。

离子液体因其作为特异性性质的液体而备受关注，因为离子液体只有离子，而表现出非 常高的离子导电性、不易挥发、以及不可燃性，还具有与优良的溶解能力、热稳定性和易于 回收等特点。它已被广泛地应用于自由基聚合，开环聚合、乙烯单体的离子配位聚合等各种 聚合体系中，离子液体也用于电化学和酶聚合过程中的缩聚和加聚聚合。对于离子液体的高 离子强度，可以增加聚集速率和减轻床收缩或膨胀的问题，进而提高印迹材料的选择性和吸 附性。关于将离子液体应用于印迹材料的研究尚处于初始阶段，因此需要做进一步的研究。 因此功能化碳纳米管与ILs结合有望提高导电性，兼容性和稳定性，并充分地将碳纳米管用 于传感器方面。

分子印迹聚合物(MIP)是人工合成的材料，具有特异性捕获目标分子的人工生成识别位 点。分子印迹聚合物(MIP)是模板分子存在下，由功能单体和交联剂共聚制备而成。模板去除 后，与模板分子尺寸和形状互补的识别位点，功能化地形成三维网状聚合物。分子印迹聚合 物(MIP)有许多优点，如高的特异性识别性，机械稳定性，灵活性，制备较容易和材料成本低。 因此，分子印迹聚合物已应用于许多领域，如控制药物递送系统，传感器和固相萃取等领域。 然而，传统的分子印迹聚合物具有模板分子去除难、印迹位点少和传质速度慢等缺点，限制 了其在很多方面的应用。

为了克服这个问题，研究者们致力于表面分子印迹技术，制备基于载体的表面分子印迹 聚合物材料，由于该材料的印迹位点位于材料表面，可提高对模板分子的响应速度，降低非 特异性吸附，从而增加该材料对目标分子的吸附量，该材料用于电化学传感器的相关研究可 提高方法的灵敏度，缩短响应时间。

在表面分子印迹法中，可根据不同的需要选择不同的载体，目前，文献已报道氧化石墨烯、 石墨烯、CdSe量子点，二氧化硅等为载体的表面分子印迹材料。CNTs和离子液体具有较好 的电催化活性、导电性、兼容性等。以CNTs和新型离子液体为载体的表面印迹材料可能具 有较好的电催化活性，导电性等，因此，以CNTs和新型离子液体为载体制备表面印迹材料 应该是一个很好的应用前景。

发明内容

本发明公开了一种对17β-雌二醇具有良好的电化学行为，对17β-雌二醇特异性吸附、灵 敏度高、良好选择性的碳纳米管的表面分子印迹聚离子液体。

一种多壁碳纳米管的表面分子印迹聚离子液体，它是由羧基化多壁碳纳米管、功能单体、 交联剂和模板分子在引发剂作用下聚合形成并除去模板分子的复合材料，所述功能单体为 1-(1′-羟基丁烷)-3-乙烯基咪唑鎓六氟磷酸；所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯和3，3′-(1′，4′- 丁烷)-双-1-乙烯基咪唑六氟磷酸；所述模板分子为17β-雌二醇。

具体的，所述引发剂为偶氮二异丁腈。

优选地，所述1-(1′-羟基丁烷)-3-乙烯基咪唑鎓六氟磷酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、3，3′- (1′，4′-丁烷)-双-1-乙烯基咪唑六氟磷酸的摩尔比为0.3～0.6∶1∶1；更优选，摩尔比为0.4∶1∶1。

优选地，所述羧基化多壁碳纳米管与模板分子的重量摩尔比为0.08～0.1g∶0.1mmol。

优选地，所述功能单体与引发剂的摩尔重量比为0.1mmol∶3～6mg；更优选，摩尔重量 比为0.1mmol∶5mg。

本发明还提供了所述多壁碳纳米管的表面分子印迹聚离子液体的制备方法，包括以下步 骤：将模板分子加入溶剂中，再加入功能单体、交联剂、引发剂和羧基化多壁碳纳米管，混 合均匀进行聚合反应，反应完成后收集产物，脱除产物中的模板分子，最后干燥制得所述多 壁碳纳米管的表面分子印迹聚离子液体。

优选地，所述聚合反应的温度为60～80℃，时间为12～36小时；更优选，温度为60℃， 时间为24h。

本发明还提供了一种利用所述多壁碳纳米管的表面分子印迹聚离子液体制成的电化学传 感器。

本发明还提供了所述电化学传感器在检测17β-雌二醇中的应用。

本发明以导电性好、兼容性好、稳定性好的新型离子液体和电催化活性好的CNTs结合， 以17β-雌二醇为模板分子，1-(1′-羟基丁烷)-3-乙烯基咪唑鎓六氟磷酸为功能单体，乙二醇二 甲基丙烯酸酯EGDMA/3，3′-(1′，4′-丁烷)-双-1-乙烯基咪唑六氟磷酸(1∶1，M/M)为双交联剂，偶 氮二异丁腈为引发剂，通过非共价键作用成功地合成了PIL/MWCNTs-MIP表面分子印迹复合 材料，基于聚离子液体具有强的可与CNTs发生反应的π-阳离子，为用于进一步分散于聚合 物中的非共价修饰多壁碳纳米管的合成提供了新的可能性。

附图说明

图1为本发明PIL/MWCNTs-MIP印迹材料的制备及其传感器的构建。

图2A为[C₄(OH)mim][Cl](a)、[C₄(OH)mim][PF₆](b)、[C₄mim₂][Br](c)，[C₄mim₂][PF₆](d) 的红外光谱图；图2B CNTs-COOH(a)、PIL/MWCNTs-NIP(b)、PIL/MWCNTs-NIP(c)的红外 光谱图。

图3为MWCNTs-COOH(a)和PIL/MWCNTs-MIP(b)的TGA质量损失曲线。

图4为MWCNTs-COOH(A)、PIL-MIP(B)和PIL/MWCNTs-MIP(C)的SEM表征图。

图5为PIL/MWCNTs-MIP/GCE(a)与PIL/MWCNTs-NIP/GCE(b)在含30μM E₂的PBS(0. M pH 6.0)溶液中的循环伏安图(A)和差分脉冲伏安图(B)(吸附时间：5min)。

图6为PIL/MWCNTs-MIP/GCE(a)、Bare GCE(b)和PIL/MWCNTs-NIP/GCE(c)在含5mM  K₃[Fe(CN)₆]和0.1M KCl混合溶液中的循环伏安图(A)和5mM K₃[Fe(CN)₆]，5mM K₄[Fe(CN)₆] 和0.1M KCl混合溶液中的阻抗图谱(B)。

图7A为PIL/MWCNTs-MIP/GCE(a)、PIL/MWCNTs-NIP/GCE(b)、Bare GCE(c)和传统 MIP/GCE(d)在0.5mM K₃[Fe(CN)₆]溶液中的电量(Q)与时间图(Q-t)；图7B为 PIL/MWCNTs-MIP/GCE(a)、PIL/MWCNTs-NIP/GCE(b)、Bare GCE(c)和传统MIP/GCE(d)在 0.5mM K₃[Fe(CN)₆]溶液中的电量(Q)与时间根方的曲线(Q-t^1/2)(测试条件：脉冲宽度0.25s， 取样间隔0.25ms，静置时间2s)。

图8为PIL/MWCNTs-MIP的浓度(A)、吸附时间(B)、pH(C)对PIL/MWCNTs-MIP/GCE 的DPV电流响应影响；PIL/MWCNTs-MIP/GCE在不同pH(a至e分别为4.5、5.0、6.0、7.0、 8.0)中的DPV图(D)(测定条件为0.1M PBS 30μM E₂)。

图9为传感器PIL/MWCNTs-MIP/GCE和PIL/MWCNTs-NIP/GCE对E₂及三种类似物吸 附5min后的DPV电流响应；

其中，E₁为雌一醇；E₂为雌二醇；E₃为雌三醇；4-NP为壬基酚。

图10A为传感器PIL-MWCNTs-MIP对E₂的DPV响应，E₂的浓度(a～k，μM)：0.005、 0.01、0.05、0.5、1、5、10、20、30、50；图10B传感器PIL-MWCNTs-MIP(a)和PIL-MWCNTs-NIP (b)测定E₂的标准曲线。

图11为PIL-MWCNTs-MIP传感器、传统MAA传感器、传统4-NP传感器以及传统AM 传感器对5μM E₂的DPV检测。

具体实施方式

本发明采用的原料如表1所示：

表1

备注：磷酸缓冲溶液(pH 6.00.1M)由Na₂HPO₄和NaH₂PO₄配制。

(1)4-乙烯基吡啶的纯化

取20mL的4-NP加入到50mL的圆底烧瓶中，然后将其置于70℃下进行减压蒸馏，取 其馏分，以除去溶于其中的阻滞剂。

(2)甲基丙烯酸的纯化

取一50mL的圆底烧瓶，向其中加入20mL MAA，此后于30℃下进行减压蒸馏，获取馏分， 从而除去其中的阻滞剂。

1、PIL/MWCNTs-MIP传感器的制备

(1)1-(1′-羟基丁烷)-3-乙烯基咪唑氯[C₄(OH)mim][Cl]离子液体的制备：

[C₄(OH)mim][Cl]的合成过程为：大力搅拌下，11.94g(0.11mol)4-氯-1-丁醇滴入9.411g (0.1mol)1-乙烯基咪唑(0.1M)(99％Aldrich)，溶于30mL的甲醇，该混合物于60℃下搅拌过 夜15h后得到淡黄色粘稠液体，然后用无水乙醚洗涤3次，轻轻倒出并于室温下干燥至恒重 得到1-(1′-羟基丁烷)-3-乙烯基咪唑氯[C₄(OH)mim][Cl]。

(2)1-(1′-羟基丁烷)-3-乙烯基咪唑鎓六氟磷酸([C₄(OH)mim][PF₆])的合成：

以BF₄-，PF₆-和Tf₂N-为阴离子功能化基团的离子液体可以通过上述[C₄(OH)mim][Cl] 与相应的无机盐，即NaBF₄，NH4PF₆，Li[Tf₂N]之间的阴离子置换反应得到。

称取10.13g已经制得的[C₄(OH)mim][Cl]与8.965g NH₄PF₆在50mL二次去离子水溶液 中混合均匀后，室温下搅拌12h。为了使置换反应发生地较彻底，NH₄PF₆要稍过量。得到的 奶白色固体用乙醚洗涤(3×30mL)以除去未反应的原料。产品经过滤后，用蒸馏水反复洗涤， 除去溶液中残留的Cl^-。我们通过硝酸银溶液来对基于PF₆^-阴离子的离子液体中的Cl^-是否残 留进行验证，直到无白色沉淀(AgCl)产生。真空60℃干燥过夜后，所得产物即[C₄(OH) mim][PF₆]。称重后，产量为10.00g，产率为82％。

(3)3，3′-(1′，4′-丁烷)-双-1-乙烯基咪唑溴([C₄mim₂][Br])的合成：

[C₄mim₂][Br]的合成过程为：大力搅拌下，10.80g(0.05mol)1，4-二溴丁烷滴入9.411g(0.1 mol)1-乙烯基咪唑(0.1M)(99％，Aldrich)，溶于30mL的甲醇，该混合物于60℃下搅拌过夜 15h后得到淡黄色粘稠液体，然将粘稠液倒入500mL无水乙醚中洗涤，将下层粘稠液轻轻倒 出并在室温下燥至恒重。

(4)3，3′-(1′，4′-丁烷)-双-1-乙烯基咪唑六氟磷酸([C₄mim₂][PF₆])的合成：

以BF₄-，PF₆-和Tf₂N-为阴离子功能化基团的离子液体可以通过上述[C₄mim₂][Cl]与相 应的无机盐，即NaBF₄，NH₄PF₆，Li[Tf₂N]之间的阴离子置换反应得到。20.21g已制得的[C₄ mim₂][Br]与8.965g NH₄PF₆在50mL二次去离子水溶液中混合均匀后，室温下搅拌12h。为 了使置换反应发生地较彻底，NH₄PF₆要稍过量。得到的奶白色固体用乙醚洗涤(3×30mL)以 除去未反应的原料。产品经过滤后，用蒸馏水反复洗涤，除去溶液中残留Br^-。我们采用硝酸 银溶液，对基于PF₆^-阴离子的离子液体中的Br^-是否残留进行验证，直到无AgBr黄色沉淀产 生。真空60℃干燥过夜后，所得产物即[C₄mim₂][PF₆]。

(5)羧基化多壁碳纳米管(MWCNTs)的制备：多壁碳纳米管的羧基化的合成方法为称取 100mg CNTs置于500mL圆底烧瓶中，加入400mL混酸(HNO₃∶H₂SO₄＝1∶3，V/V)使其分 散，然后置于水浴超声仪中超声10h，将所得的均匀分散液静置过夜分层，弃去上清液，随 后用二次去离子水洗涤，离心，直到所得溶液的pH呈中性，然后干燥得到羧基化的CNTs 备用。

(6)PIL/MWCNTs-MIP的制备：PIL/MWCNTs-MIP的合成方法为：依次加入0.1mmol 17β-雌二醇(E₂)和30ml混合溶剂(V_乙腈∶V_甲苯＝1∶1)至50ml圆底烧瓶中，再加入0.08g  CNTs-COOH和0.4mmol 1-(1′-羟基丁烷)-3-乙烯基咪唑鎓六氟磷酸[C₄(OH)mim][PF₆]离子液 体单体，磁力搅拌2小时进行预聚合反应。然后加入2.0mmol EGDMA/3，3′-(1′，4′-丁烷)-双 -1-乙烯基咪唑六氟磷酸[C₄mim₂][PF₆](1∶1，M/M)双交联剂和20mg AIBN。充氮气15min后 封好烧瓶口，在60℃的水浴中反应24h。产物用溶剂(V_甲醇∶V_乙酸＝9∶1)索氏提取法除去模板 分子，将其置于40℃真空干燥箱中干燥48h，获得PIL/MWCNTs-MIP。

采用相同方法，不加模板分子制备空白聚合物(非印迹聚PIL/MWCNTs-NIP)。传统印迹法 步骤相似，改变功能单体和交联剂，并在静置不搅拌下合成得到相应的传感印迹材料作对比。

2、电化学检测

传感器的制备：裸玻碳电极用0.05μm的Al₂O₃粉末在麂皮上抛光成镜面后，依次用丙 酮、HNO₃(1∶1，V/V)、NaOH(1.0mol/L)和二次去离子水中超声5min，室温下晾干待用。3mg  PIL/MWCNTs-MIP(或PIL/MWCNTs-NIP)加入到加入至1mL 0.5％的壳聚糖溶液，超声混合 均匀，接着取该混合溶液5.0μL涂滴在处理好的裸玻碳电极表面，过夜晾干。

二次水洗净修饰电极，将PIL/MWCNTs-MIP(或PIL/MWCNTs-NIP)修饰电极置于含有 17β-雌二醇的10mL 0.1M PBS(pH＝6.0)中，搅拌吸附5min后，置于空白PBS(pH＝6.0，0.1M) 中进行电化学检测。

3、PIL/MWCNTs-MIP的制备及其电化学传感器构筑

PIL/MWCNTs-MIP传感器的制备及其电化学检测过程请见图1。首先羧基化碳纳米管与 模板分子17β-雌二醇(E₂)、功能单体1-(1′-羟基丁烷)-3-乙烯基咪唑鎓六氟磷酸[C₄(OH) mim][PF₆]预聚合，MWCNTs-COOH对E₂具有选择性识别生成酰胺键，功能单体1-(1′-羟基 丁烷)-3-乙烯基咪唑鎓六氟磷酸[C₄(OH)mim][PF₆]与模板分子E₂通过氢键作用。然后分别以 双交联剂EGDMA/3，3′-(1′，4′-丁烷)-双-1-乙烯基咪唑六氟磷酸[C₄mim₂][PF₆]为交联剂和AIBN 为引发剂，自由基聚合法制备PIL/MWCNTs-MIP。在印迹机理方面MWCNTs-COOH的烯键 使得印迹聚合物在其表面发生。将PIL/MWCNTs-MIP溶于壳聚糖，并滴至玻碳电极表面，制 备PIL/MWCNTs-MIP修饰电极；然后PIL/MWCNTs-MIP修饰电极在含有E₂的PBS中吸附 5min，最后在空白PBS中进行DPV电化学检测。PIL/MWCNTs-MIP经洗脱模板分子后产生 与E₂大小匹配的空穴，其可对E₂有特异性的吸附和响应，同时其表面含有羧基基团可特异 性结合E₂，该材料具有对E₂分子的双识别能力，因此PIL/MWCNTs-MIP修饰膜传感器可实 现E₂的高灵敏、特异性检测。

4、PIL/MWCNTs-MIP的红外光谱表征

图2A为[C₄(OH)mim][Cl]、[C₄(OH)mim][PF₆]、[C₄mim₂][Br]和[C₄mim₂][PF₆]的红外光 谱图，图2B为CNTs-COOH、PIL/MWCNTs-NIP及PIL/MWCNTs-MIP的红外光谱图(FTIR)。 由图2A中曲线a、c分别为[C₄(OH)mim][Cl]和[C₄mim₂][Br]的红外，可以得出3436cm^-1吸 收峰为-OH峰，3164cm^-1、1575cm^-1、1177cm^-1左右分别为咪唑环阳离子上的振动吸收峰^[103]， 1650cm^-1左右的特征峰为C＝N吸收峰，1500cm^-1左右的特征峰为C＝C吸收峰，1107 cm^-1N＝C-H的面内弯曲振动，由曲线b、d可以得出，[C₄(OH)mim][Cl]、[C₄mim₂][Br]分别 与NH₄PF₆发生反应后，出现了新的强吸收峰841cm^-1和843cm^-1，归属于PF₆^-的吸收峰^[104]。 结果表明发生阳离子交换反应后成功得到[C₄(OH)mim][PF₆]和[C₄mim₂][PF₆]单体。

图2B可以看出，CNTs-COOH较CNTs出现很强的-COOH的吸收峰。由曲线b和c可以 看到PIL/MWCNTs-MIP/NIP出现了强的3429cm^-1、1727cm^-1、1632cm^-1和843cm^-1的吸收 峰，这些吸收峰分别归属于-OH、C＝N、C＝C、PF₆^-的吸收峰。结果表明PIL/MWCNTs-MIP/NIP 的成功制备。

5、PIL/MWCNTs-MIP的热重分析

图3为MWCNTs、MWCNTs-COOH和PIL/MWCNTs-MIP的热重分析(TGA)曲线。如图 3(a)所示，MWCNTs-COOH在25～800℃比较稳定，只有一点重量损失，损失率达到17％， 这可归因于羧基的分解。然而PIL/MWCNTs-MIP的TGA曲线在25～800℃有大的重量损失(曲 线b)，主要归因于含氧官能团和碳骨架的分解，损失率达到了95％。PIL/MWCNTs-MIP相对 MWCNTs-COOH的热稳定性变差，这是由于PIL/MWCNTs-MIP的热稳定性差的原因，因此 也进一步说明PIL/MWCNTs-MIP已经包覆在MWCNTs-COOH表面。

6、PIL/MWCNTs-MIP的SEM表征

SEM用来表征MWCNTs-COOH(A)、PIL-MIP(B)和PIL/MWCNTs-MIP(C)。如图4(A) 所示，MWCNTs-COOH的平均直径约为20nm。由图4(B)所示，传统PIL-MIP呈现出球 形状，没有管状，粒径平均约为350nm，粒径增大说明MWCNTs表面聚合了一层PIL的聚 合膜层，膜厚度大约为330nm。如图4(C)，PIL/MWCNTs-MIP具有管状结构，管径大小均 匀，管径平均约为150-170nm，比较图4(A)管径明显增加，增加的厚度约为130-150nm， 由此表明PIL/MWCNTs-MIP成功制备。

7、修饰电极对17β-雌二醇的电化学行为

首先，将PIL/MWCNTs-MIP修饰电极浸入含有30μM 17β-雌二醇的PBS(pH 6.00.1M) 溶液中吸附5min，使修饰电极与E₂分子充分结合后，用二次去离子水冲洗电极，然后浸入空 白PBS(pH 6.00.1M)中考察其循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)响应，如图5A所示 修饰电极对E₂的氧化还原峰，从峰型可看出是一个不可逆的过程，氧化峰电流响应比还原峰 要大，因此选择E₂的氧化峰进行了电化学检测。由图5A中印迹与非印迹修饰电极的电流响 应可知，PIL/MWCNTs-MIP比PIL/MWCNTs-NIP修饰电极的CV电流响应要大，主要归因于 PIL/MWCNTs-MIP材料表面形成了与模板分子E₂尺寸、形状、结构功能相匹配的印迹空穴， 从而能特异性吸附溶液中目标分子E₂。从图5B可以看出，PIL/MWCNTs-MIP和 PIL/MWCNTs-NIP修饰电极均在0.612V处出现了E₂的氧化峰，而PIL/MWCNTs-MIP修饰 电极对30μM E₂的DPV峰电流是PIL/MWCNTs-NIP修饰电极的2.21倍，这说明 PIL/MWCNTs-MIP对E₂具有良好的吸附能力，这可归因于PIL/MWCNTs-MIP印迹识别位点 对E₂的识别。

为了进一步研究材料的电化学性质，将PIL/MWCNTs-MIP/GCE、PIL/MWCNTs-NIP/GCE、 裸玻碳电极作为工作电极，分别浸入5mM的K₃[Fe(CN)₆]和0.1M KCl的混合溶液中，测定 了它们的循环伏安图谱，从-0.2V到0.8V内扫描的循环伏安图谱，如图6A所示， PIL/MWCNTs-MIP/GCE的氧化还原电流响应最大(曲线a)，PIL/MWCNTs-NIP/GCE响应电流 明显降低(曲线b)，这可归因于PIL/MWCNTs-MIP具有更多的印迹空穴，促进了电极表面的 电子传递，PIL/MWCNTs-NIP/GCE的导电性差于裸电极，说明非印迹材料表面没有印迹空穴， 阻碍了电极表面的电子传递。对应的阻抗图谱如图6B所示，将PIL/MWCNTs-MIP/GCE、 PIL/MWCNTs-NIP/GCE、裸玻碳电极，分别浸入5mM K₃[Fe(CN)₆]、5mM K₄[Fe(CN)₆]和0.5 M KCl的混合溶液中，测定它们的交流阻抗图谱，众所周知电化学交流阻抗法可以有效地反 应表面修饰电极的特性，在电化学阻抗谱中，半圆的直径等于电子转移电阻。例如，图6B(b) 清楚地阐述了裸GCE电极的电子转移阻力大约为200Ω，而PIL/MWCNTs-MIP/GCE的电子 转移电阻大约为75Ω(曲线a)，印迹洗脱材料的阻力明显降低，说明PIL/MWCNTs-MIP修饰 裸GCE电极后，由于印迹空穴和MWCNTs的良好导电性有利于[Fe(CN)₆]^3-/4-的电子转移。然 而，当PIL/MWCNTs-NIP修饰到裸GCE电极之后，电阻明显增加(曲线c)，这说明非印迹材 料的表面没有印迹空穴，阻碍了[Fe(CN)₆]^3-/4-的电子转移。

进一步考察电极材料的有效表面积：分别将PIL/MWCNTs-MIP/GCE(a)、 PIL/MWCNTs-NIP/GCE(b)、Bare GCE(c)和传统MIP/GCE(d)置于0.5mM K₃[FeCN₆]溶液中， 通过计时库伦分析法进行检测分析，结果如图7，工作电极PIL/MWCNTs-MIP/GCE(a)、 PIL/MWCNTs-NIP/GCE(b)、Bare GCE(c)和传统MIP/GCE(d)的有效表面积根据Anson^[63]公 式：

$Q\left(t\right)=\frac{2{\mathrm{nFACD}}^{1/2}{t}^{1/2}}{{\pi }^{1/2}}+Q_{d1}+Q_{ads}$

A表示修饰电极的有效表面积；C表示基质的浓度；D代表K₃[Fe(CN)₆]的分散系数 (7.6×10^-6m²s^-1)；Q_dl是双层电荷相对背景基质可以忽略不计；Q_ads表示法拉第常数。图7-A可 以得出Q与t^1/2的斜率分别为7.055×10^-5、3.181×10^-5、1.240×10^-5、9.615×10^-6，通过代入公式 1得到对应修饰电极的有效表面积依次为0.470、0.212、0.0827、0.0641cm²。从结果可以说 明工作电极GCE经过PIL/MWCNTs-MIP和PIL/MWCNTs-NIP修饰后，有效表面积显著增大， 从而提高了PIL/MWCNTs-MIP对E₂的吸附能力，降低了对E₂的最低检测限。

8、测定条件优化

通过DPV考察了PIL/MWCNTs-MIP的浓度、吸附时间以及吸附液和测定液pH对 PIL/MWCNTs-MIP修饰电极电流响应的影响。图8A是PIL/MWCNTs-MIP的浓度对E₂电流 大小的影响，发现在3mg/ml时DPV电流响应最大，当浓度低于3mg/ml，因为滴于电极表 面的PIL/MWCNTs-MIP少，所以相应的印迹位点也减少，相应电流也变小；而当滴涂材料浓 度大于3mg/ml时，PIL/MWCNTs-MIP的修饰膜太厚阻碍电子转移到电极表面，对应的电流 也变小；

因此我们选择滴到电极表面的PIL/MWCNTs-MIP浓度为3mg/ml。富集时间对电流大小 的影响，当工作电极吸附目标分子达到饱和状态时，峰电流趋于平稳状态的时间就是最佳吸 附时间。图8B是富集时间对电流大小的影响，修饰电极在0.5到5min，E₂的氧化峰电流线 性增加，随着富集时间的增大，雌二醇在PIL/MWCNTs-MIP/GCE上的积累量也增加，在5min 时电流达到最大，表明PIL/MWCNTs-MIP/GCE具有较短的响应时间，归因于 PIL/MWCNTs-MIP/GCE表面印迹材料表面优良电子传递性能与分子印迹识别位点的作用，考 虑到灵敏度和工作效率，选择最佳富集时间为5min。本文对不同pH中的DPV图，溶液pH 从4.5到6.0时，响应电流随着pH增大而增大，pH为6.0时电流响应最大，大于6.0时，响 应电流逐渐减小，所以我们选择pH为6.0。图8D是PIL/MWCNTs-MIP/GCE在不同pH(a 至e分别为4.5、5.0、6.0、7.0、8.0)中的DPV图，随着pH从4.5到6.0，最大峰电位向右 移动，说明在电化学过程中发生了质子转移，因此，E₂在PIL/MWCNTs-MIP/GCE上的氧化 是一个电子-质子过程，此外，I_pa在6.0达到最大，因此最佳pH选择为6.0。

9、传感器的选择性

材料的选择性是构筑传感器的一个重要因素，因此考察了PIL/MWCNTs-MIP/GCE、 PIL/MWCNTs-NIP/GCE对30μM E₂及其它三种类似物的DPV电流响应，其中三种类似物分 别为雌三醇(E₃)、对壬基酚(4-NP)、雌一醇(E₁)。如图9所示PIL/MWCNTs-MIP/GCE对30μM  E₂的电流响应是对雌三醇(E₃)、对壬基酚(4-NP)、雌一醇(E₁)的2.08、2.76、3.12倍，这可归 因于印迹材料印迹识别位点的原因。而传感器PIL/MWCNTs-NIP/GCE对30μM E₂的电流响 应与对雌三醇(E₃)、对壬基酚(4-NP)、雌一醇(E₁)的响应电流大小差异不大，这是由于 PIL/MWCNTs-NIP材料表面没有印迹空穴。我们用雌二醇(E₂)、雌三醇(E₃)、对壬基酚(4-NP)、 雌一醇(E₁)分别在PIL/MWCNTs-MIP/GCE和PIL/MWCNTs-NIP/GCE上的峰电流大小比值来 表示其选择性能，本文将PIL/MWCNTs-MIP/GCE上的电流定义为I_s，将 PIL/MWCNTs-MIP/GCE上的电流定义为I_o，E₂、E₃、4-NP、E₁的峰电流大小比值(I_s/I_o)分别为 2.14、1.01、1.06、1.00。从数据结果可得出，PIL/MWCNTs-MIP/GCE对模板分子E₂具有更 大的吸附容量，而对E₃、4-NP、E₁的吸附量都比较小，从而说明PIL/MWCNTs-MIP/GCE对 模板分子具有良好的亲和性和选择性，E₃、4-NP、E₁的吸附量较小是由于它们的化学结构与 E₂的不一致，形成的印迹空穴大小和功能结构不匹配，因此对模板分子E₂产生特异性吸附。

10、线性范围、检测限、重现性和稳定性

在所有优化条件下，本实验通过DPV法研究了PIL/MWCNTs-MIP/GCE对E₂的线性范 围和检测限。将PIL/MWCNTs-MIP/GCE浸入含有不同浓度的E₂的PBS(pH 6.0)溶液中吸附5 min，然后进行DPV检测，结果如图10(A)所示，随着E₂浓度的增大，其在0.6V处的氧化 峰电流也逐渐增大，由图可知氧化峰电流大小与E₂浓度在0.005～50.0μM范围内呈现良好的 线性关系；如图10(B)为E₂的标准曲线图，PIL/MWCNTs-MIP/GCE对应的线性方程为：I_p(μA)＝0.02103C(μM)+0.02585，线性相关系数为0.9966，其最低检测限为0.0015μM(S/N＝3)， 与之前报道过的相关文献进行对比，如表2所示。PIL/MWCNTs-MIP/GCE传感器对E₂的检 测具有较宽的线性范围和较低的检测限。

同时我们考察了PIL/MWCNTs-NIP/GCE以及传统PIL-MIP/GCE电极对不同浓度的E₂进 行DPV测定，其线性方程为：I_p(μA)＝0.00464C(μM)+0.04405，线性相关系数为0.7667。K_sv，MIP和K_sv，NIP分别是PIL/MWCNTs-MIP/GCE、PIL/MWCNTs-NIP/GCE的线性斜率，其值分别为 0.02103、0.00464，该K_sv，MIP与K_sv，NIP的比值定义为模印因子(IF)，用来评估材料的特异性识 别^[48，67]，该IF(K_sv，MIP/K_sv，NIP)计算结果为4.53，说明PIL/MWCNTs-MIP表面有很多E₂的识别 位点，然而PIL/MWCNTs-NIP材料表面没有E₂的印迹识别位点，PIL/MWCNTs-MIP/GCE高 效的电流响应表明其对E₂的特异性亲和性。

重现性和稳定性是传感器性能良好的重要因素，因此，在相同条件下制备5根电极，每 根电极平行3次测定30μM E₂的DPV电流响应，通过每根电极检测的平均值来衡量该传感 器的重现性，结果得到相对标准偏差为3.62％。PIL/MWCNTs-MIP修饰好的GCE在PBS(pH 6.0 0.1M)缓冲溶液中于4℃下冰箱中保存，1周后该传感器DPV响应电流值保留了初始电流 的97.1％，4周后，电流响应值降低了15％。上述结果说明PIL/MWCNTs-MIP传感器表现出 优良的重现性和稳定性。

表2本方法与其它电化学法测定NP的电化学法对比。

文献出处：

(1)Tao H，Wei W Z，Zeng，X D，et al.Electrocatalytic oxidation and determination of estradiol  using an electrode modified with carbon nanotubes and an ionic liquid[J].Microchimica Acta， 2009，166(1)：53-59.

(2)Hu S S，Wu K B，Yi H C，et al.Voltammetric behavior and determination of estrogens at  Nafion-modified glassy carbon electrode in the presence of cetyltrimethylammonium bromide[J]. Analytica Chimica Acta，2002，464(2)：209-216.

(3)Lin X Q，Li Y X.A sensitive determination of estrogens with a Pt nano-clusters/multi-walled  carbon nanotubes modified glassy carbon electrode[J].Biosensors and Bioelectronics，2005，20(11)： 2341-2346.

(4)Liu X Q，Wong D K Y.Electrocatalytic detection of estradiol at a carbon nanotube|Ni(Cyclam) composite electrode fabricated based on a two-factorial design[J].Analytica chimica acta，2007， 594(2)：184-191.

(5)He Q，Yuan S，Chen C，et al.Electrochemical properties of estradiol at glassy carbon electrode  modified with nano-Al₂O₃ film[J].Materials Science and Engineering：C，2003，23(5)：621-625.

(6)Salc₁ B，Biryol I.Voltammetric investigation of β-estradiol[J].Journal of pharmaceutical and  biomedical analysis，2002，28(3)：753-759.

(7)Song J C，YangJi，Hu X M.Electrochemical determination of estradiol using a poly(L-serine) film-modified electrode[J].Journal of Applied Electrochemistry，2008，38(6)：833-836.

(8)Janegitz B C，Santos F A D，Ronaldo C，et al.Electrochemical determination of estradiol using  a thin film containing reduced graphene oxide and dihexadecyl phosphate[J].Materials Science and  Engineering：C，2014，37：14-19.

11、本方法与传统印迹方法的比较

本实验采用新型聚离子液体为功能单体制备得到基于新型PIL-MWCNTs的表面分子印 迹聚合物电化学传感器，为了证明本实验中离子液体的优越性，我们在相同条件下，以E₂为 模板分子，分别以MAA、4-NP和AM为功能单体、EGDMA为交联剂，AIBN为引发剂， 通过传统印迹法分别合成了相应的印迹材料，同时将它们用索氏提取法洗脱其中的模板分子。 然后分别称取6mg加入2mL0.5％壳聚糖溶液超声，使其分散均匀，分别取5μL滴涂于玻 碳电极表面，在同一条件下，对5μM E₂的PBS(0.1M pH 6.0)溶液进行检测，结果如图11 所示，该传感器的DPV电流响应分别是MAA、4-NP和AM的1.5倍、1.9倍和2.4倍。这说 明该PIL/MWCNTs-MIP传感器对模板分子E₂具有更好的吸附性和导电性，可归因于 MWCNTs的良好导电性和大的比表面积，以及新型离子液体良好的导电性和生物相容性。

12、干扰实验

为了验证本方法应用于环境水样中17β-雌二醇的检测，考察环境水样中可能存在的一些 干扰离子、酚类化合物对测定E₂的影响。允许最大限量是该量所引起E₂的DPV峰电流大小 变化在±5％范围之内。如表3所示，K⁺、Ca²⁺、Na⁺、Al³⁺、SO₄^2-、Cl^-等离子在500倍之内对 检测不产生干扰，对Mg²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺、Mn²⁺分别在300倍和100倍之内不产生干扰，对硝 基苯在40倍以内不产生干扰，硝基酚在20倍之内不产生干扰。结果证明，该传感器选择性 较好，适用于环境水样中E₂的检测。

表3 PIL-MWCNTs-MIP传感器DPV测定E₂的允许干扰量；

检测条件，E₂浓度：1×10^-5M；支持电解质：0.1M PBS(pH 6.0)；富集时间：5min。

13、实际水样中E₂的检测

环境水样取自嘉兴学院校区的河水，水样经过离心处理后，取上清液，并通过0.45μm的 滤膜过滤，所得澄清液备用。自来水源自实验室，不做任何处理。然后将PIL-MWCNTs-MIP 传感器应用于环境水样的检测，平行测定5次，结果发现水样中无E₂的电化学响应。因而采 用标准加入法所获的回收率，来证实本方法的可行性。

表4河水和自来水中E₂的含量(每个样品平行测定5次)；

测定条件：0.1M，pH 6.0的PBS缓冲溶液；再吸附时间：5min。

由表4可知，所得的回收率在97.3％～105.7％，结果表明PIL-MWCNTs-MIP传感器适合 于实际水样中E₂的测定，并获得令人满意的结果。