用于与蛋白质和肽缀合的四个支链的树枝状大分子PEG

摘要

本发明涉及具有四个支链的单甲氧基-聚乙二醇的聚合树枝状大分子样结构，其可以表示为：

说明书

本申请是申请号为200680049165.1的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及具有四个支链的聚乙二醇(PEG)的树枝状大分子样聚 合结构，用于获得药学目的的缀合物。

背景技术

治疗性蛋白质与聚乙二醇的缀合对于一些药理学性质的益处是众 所周知的。例如，由于不同的原因，在血中的半衰期延长，其中：聚 合残基可以防止蛋白酶的攻击和通过免疫系统进行的药物的识别，至 于天然蛋白质，缀合物的流体力学体积显著地减少了肾滤过。尽管在 很多情况中，PEG化会影响蛋白质的体外生物活性，但是在血中寿命 的显著延长使得其治疗作用更为有效(Harris J.M.y Chess R.B. (2003)Effect of pegylation on pharmaceuticals.Nat.Rev.Drug  Discov.2：214-21)。

PEG化也从立体上阻止了疏水性相互作用诱导的降解途径，产生 了立体非特异性障碍，从而减小了与蛋白质热不稳定性有关的分子间 作用力。所有这些使得PEG化的蛋白质比未修饰的分子具有了更高的 物理稳定性，这是一种对于最终药物制剂的制备非常有用的性质 (Harris J.M.y Chess R.B.(2003)Effect of pegylation on  pharmaceuticals.Nat.Rev.Drug Discov.2：214-21)。

常用于蛋白质缀合的试剂是在其一个末端甲基化的聚乙二醇，称 作单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。甲基保护PEG链的一个末端的事实使得 其仅能通过另一个末端激活，成为单官能化试剂。这对于治疗性蛋白 质的缀合是非常重要的，因为一般与双官能化或多官能化试剂的缀合 会导致交联，从而影响蛋白质的生物活性。mPEG分子总是具有一小部 分的非甲基化聚合物，即二醇部分。由于更难以控制非常长的链的聚 合过程，因此在较高分子量的mPEG中二醇部分的比例更高(Roberts M. J.,Bentley M.D.,Harris J.M.(2002)Chemistry for peptide和 蛋白质PEGylation.Adv.Drug Deliv.Reviews 54：459-76)。

由PEG衍生的第一类分子中的一种是通过与氯化氰反应而合成 的。但是该试剂的缀合试验引起了广泛的PEG化。这是治疗性蛋白质 所不期望的，因为PEG化的程度较高会导致生物活性突然降低，原因 在于直接阻断活性位点，或是掩盖了易接触的蛋白质表面的这些位点 的拓扑变化。通常，期望的缀合物是在每个蛋白质分子上仅有一个PEG 残基；该分子已知是单-PEG化的。

从80年代开始，开始使用“更软”的活性基团。尽管也可以使用 其他基团，但这些基团主要是N-羟基琥珀酰亚胺酯。三种最常见的基 团是：琥珀酰亚胺琥珀酸酯、三氟乙基磺酸酯(tresylate)和琥珀 酰亚胺碳酸酯。这时的活化PEG被称作第一代活化PEG(Roberts M.J., Bentley M.D.,Harris J.M.(2002)Chemistry for peptide and  protein PEGylation.Adv.Drug Deliv.Reviews 54：459-76)。

90年代后半期出现了第二代的活化PEG。它有两个重要的进步： 能够更为选择性地PEG化的基团(例如：优选通过蛋白质的N末端缀 合的醛基)和支链结构(Roberts M.J.,Bentley M.D.,Harris J.M. (2002)Chemistry for peptide and protein PEGylation.Adv.Drug  Deliv.Reviews 54：459-76)。支链PEG的例子是用两个支链单官能 化的(US 5,932,462)，用四个支链四官能化的和用八个支链八官能化 的。缀合治疗性蛋白质的更有用的活化PEG是单官能化的，因为它们 避免了蛋白质和聚合物之间的交联。支链PEG也具有伞样的结构，从 而更好地保护蛋白质的表面。

两个支链的单官能化的PEG能够得到具有干扰素α-2a的缀合物， 该缀合物比天然蛋白质在临床中显示出更好的效果(Rajender Reddy  K.,Modi M.W.,Pedder S.(2002)Use of peginterferon alfa-2a (40KD)(Pegasys)for the treatment of hepatitis C.Adv.Drug  Deliv.Reviews 54：571-86)。

至于mPEG合成的现有技术，仅仅能获得30kDa的链，原因在于 具有两个支链的试剂能够获得最大为60kDa的分子量。人们期望具有 更高分子量的单官能化的PEG的结构，其可以用于探索更宽范围的缀 合物，以在某些蛋白质中得到最佳的值。但是，在上述的报告中都没 有使用、表征或提及单官能化和具有两个以上的PEG链的PEG化试剂。 在获得具有两个以上的PEG链的试剂的情况中，可以获得更高分子量 的缀合物，除了上述的优点以外，它允许使用更短的mPEG线性支链使 类似分子量的PEG化试剂成为两个支链的结构。这些较小的支链含有 的二醇部分量更小，这使得合成过程更容易。

发明内容

本发明解决了上述问题，提供了具有四个mPEG支链的单官能化树 枝状大分子样结构。该结构能够获得具有高达120kDa的聚合残基的 缀合物。这个事实可以用于探索具有广泛不同的分子量的缀合物，包 括具有高分子量的缀合物。此外，使用这个方法，可以获得分子量与 其他支链化的单官能化试剂类似的PEG分子，但是它具有较低分子量 的线性链。

在本发明一个优选的实施方案中，获得了一种聚合结构，其中PEG 链的分子量为5,000到30,000Da，总分子量为20,000到120,000Da。

使用小的线性链几乎消除了在较大的线性PEG分子中的二醇污 染。出人意料地，与类似分子量但是用仅有两个支链的结构制备的缀 合物相比，具有本发明所述结构的缀合物具有高得多的物理-化学稳定 性(耐高温和蛋白酶降解)。同时出人意料的是，它们在血中具有更高 的平均寿命。另一个出人意料的结果是具有本发明树枝状大分子样结 构的缀合物更为同质，与具有类似分子量但仅有两个支链的缀合物所 获得的结果相比，具有更少的位置异构体。

树枝状大分子样四个支链的单官能化的PEG是在两个主要步骤中 获得的。第一个步骤是通过两个线性PEG分子与核结合来合成两支链- 衍生物，其中该核可以是例如赖氨酸。其他作者已经使用类似方法获 得了良好的结果(US 5,932,462)。第二个步骤是与前一步骤类似，将 两分子的两支链-衍生物与核结合，获得四支链-衍生物。为了在第一 步骤中将两个线性PEG支链与核结合，它们需要具有活性基团。该基 团可以选自现有技术水平已知的基团。例如，其中包括琥珀酰亚胺琥 珀酸酯、琥珀酰亚胺碳酸酯、对硝基苯基碳酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯、 琥珀酰亚胺丁酸酯。在本发明中优选的线性活化PEG是琥珀酰亚胺碳 酸酯。这主要是由于下列主要的不同原因：该试剂和具有游离氨基的 核之间具有良好的反应性，制备官能化PEG的方法简便。合成方法 (Miron T.,Wilchek M.(1993)A Simplified Method for the  Preparation of琥珀酰亚胺碳酸酯Polyethylene Glycol for  Coupling to Proteins.Bioconjugate Chem.4：568-69)是本领域 技术人员公知的：

当准备好线性的活化PEG时，通过与选作核的分子进行反应可以 容易地完成第一个步骤。在本发明一个优选的实施方案中，由于其生 物适合性，核是L-赖氨酸，它具有两个游离的氨基和一个羧基，它们 可以在随后用于被激活。

通过色谱法可以从反应混合物中容易地纯化两支链-衍生物。用核 分子激活该两支链-衍生物以用于后续的反应并合成四支链-衍生物。 可以以不同方法激活该产品，但是根据效力和简便性优选的一种方法 是形成N-羟基琥珀酰亚胺酯。

该方法已经成功地用于激活具有包含PEG链的结构的羧基，使其 成为N-羟基琥珀酰亚胺酯(US 4,732,863，US 5,932,462)。

制备四支链-衍生物的第二个阶段包括两支链-衍生物与核分子的 反应，其与本发明的第一个阶段类似；本发明的一个优选实施方案是 使用L-赖氨酸作为核。

通过色谱法可以容易地从反应混合物中纯化感兴趣的衍生物。

使用不同的反应性基团与蛋白质缀合可以激活树枝状大分子样 PEG分子。用于激活其他PEG结构的任意官能团同样可用于本专利所 述的树枝状大分子样PEG。这些基团的一些例子是：N-羟基琥珀酰亚 胺酯、琥珀酰亚胺碳酸酯、不同类型的醛、马来酰亚胺等等。可以使 其结构与蛋白质结合的其它类型的基团是螯合基次氮基三乙酸酯 (NTA)，其可以通过过渡金属与肽骨架中存在的组氨酸残基缀合。反应 性基团的选择将取决于欲与PEG分子结合的蛋白质残基。

例如，如果优选与游离的氨基结合，那么树枝状大分子样聚合物 可以激活成N-羟基琥珀酰亚胺酯。这样，根据与阶段1中激活两支链 -结构所述相同的方法，本发明的一个实施方案是获得N-羟基琥珀酰 亚胺酯。

蛋白质与激活的PEG的缀合发生在适当的缓冲溶液中。除了其他 因素，缓冲溶液的性质取决于聚合物的官能团和缀合的目的。例如， 如果需要通过游离氨基与官能化的PEG缀合而成N-羟基琥珀酰亚胺 酯，那么用预定的pH将可以在一定程度上预测缀合位点。pH值约为9 对于通过赖氨酸的ε-氨基进行缀合是有利的。

另一个例子是，当与醛基官能团缀合时，稍酸性的pH将允许PEG 化优选发生在蛋白质的N-末端上。然后可以通过不同的色谱技术进行 感兴趣的缀合物的纯化。

在本发明的一个实施方案中，所述的缀合物是，其中的亲核基团 包含在选自蛋白质、肽和多肽的生物分子中。

必须分析缀合物的某些化学、物理和生物学性质，尽可能地完成 对纯化的缀合物的特征描述。例如，通常可以通过紫外线光谱法(在 280nm处的吸光度)来确定缀合物的浓度，这是因为PEG残基几乎不 会影响蛋白质的消光系数。必须通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶 电泳法(SDS-PAGE)确定纯化产品的纯度，这是因为色谱法例如凝胶过 滤很难分辨感兴趣的缀合物和污染物所对应的信号。通过常用方法可 以研究其他的物理-化学性质。

该操作的结果是，本发明的一个优选的成果是描述了缀合物的制 备，其中蛋白质选自：干扰素α-2b、链激酶、粒细胞集落刺激因子、 红细胞生成素或表皮生长因子。

附图说明

附图1.保护免受蛋白酶的降解。X-轴表示时间，单位为小时； Y-轴是未降解的蛋白质的量，单位是对时间为0时的量的百分比。

附图2.耐热性。X-轴表示时间，单位为天；Y-轴是未降解的蛋 白质的量，单位是对时间为0时的量的百分比。

具体实施方式/实施例

实施例1.激活为N-羟基琥珀酰亚胺酯的PEG的合成

结构的获得和激活

获得单甲氧基聚乙二醇的琥珀酰亚胺碳酸酯(SC-PEG)

将分子量为12,000Da(mPEG_12K)的15g单甲氧基聚乙二醇溶解 于500mL甲苯中，并共沸干燥3小时。然后将体积减小至250mL， 反应混合物冷却至室温。向该溶液中加入下列试剂：60mL的干燥二 氯甲烷，溶解于15mL干燥丙酮中的2g二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)， 和溶解于甲苯：DCM为3：1混合物10mL中的1g二甲氨基吡啶。反 应在搅拌下过夜(16小时)。用1L的冷乙醚沉淀反应混合物，过滤收 集沉淀。将产物溶解于丙酮中，并用乙醚沉淀，如此重结晶3次。高 真空下干燥最终产物，并贮存于-20℃的氮气下。该方法的最终收率在 90％以上。通过与甘氨酰(glycil)-甘氨酸反应来确定激活的PEG的 份数，通过与TNBS反应来定量游离的氨基。

获得二PEG化的赖氨酸(Lys-2PEG)

将12g的SC-PEG_12K与溶解于100mM硼酸盐缓冲液的pH 8.5的 浓度为0.2mg/mL的46mg L-(+)-赖氨酸反应。反应在室温下搅拌过 夜(16小时)。然后用重蒸馏水将反应混合物稀释5倍，并用盐酸调 节pH。用1体积的DCM将PEG萃取3次。用无水硫酸钠干燥合并的3 次萃取部分并过滤。在旋转式蒸发器中浓缩PEG的DCM溶液直至20mL。 用120mL的冷乙醚沉淀该浓缩物，过滤收集并高真空下干燥。用DEAE 琼脂糖通过离子交换色谱从反应混合物的剩余组分中分离Lys-2PEG。

用3体积的100mM硼酸盐缓冲液，pH 7.5使包含1L色谱基质的 柱达到平衡，然后用5体积的重蒸馏水洗涤。将10g的反应混合物以 5mg/mL溶解于重蒸馏水中。用2体积的重蒸馏水洗涤该柱，清除未 反应的PEG，用1mM的氯化钠溶液洗脱Lys-2PEG。用盐酸将该部分的 pH调节至3并用1体积的DCM萃取3次。用无水硫酸钠干燥合并的3 次萃取部分并过滤。在旋转式蒸发器中浓缩PEG的DCM溶液直至10mL。 用60mL的冷乙醚沉淀该浓缩物，过滤收集并高真空下干燥。通过 SDS-PAGE确定纯度，用5％的氯化钡溶液和100mM碘给凝胶染色。通 过MALDI-TOF确定的分子量是23.0-24.5kDa。该方法的总收率在40％ 以上。

激活二PEG化的赖氨酸成为N-羟基琥珀酰亚胺酯(PEG_2,12K-NHS)

将6g的Lys-2PEG溶解于20mL的干燥DCM中，并加入60mg 的N-羟基琥珀酰亚胺和250mg的N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)。将 反应在室温和搅拌下保持24小时。过滤混合物，并通过旋转蒸发浓缩 至5mL。用20mL的冷乙醚沉淀产物，将其溶解于丙酮并用乙醚沉淀， 如此重结晶3次。高真空下干燥最终产物，并贮存于-20℃的氮气下。 该方法的总收率在95％以上。通过与甘氨酰-甘氨酸反应来确定激活的 PEG的份数，通过与TNBS反应来定量游离氨基的个数。

获得树枝状大分子样四支链-PEG

将5g的PEG_2,12K-NHS与溶解于100mM硼酸盐缓冲液的pH 8.5的 浓度0.1mg/mL的7mg L-(+)-赖氨酸反应。反应在室温下搅拌16小 时进行。然后用重蒸馏水将反应混合物5倍稀释，并用盐酸调节pH 至3。用1体积的DCM将PEG萃取3次。用无水硫酸钠干燥合并的3 次萃取部分并过滤。在旋转式蒸发器中浓缩PEG的DCM溶液直至5mL。 用30mL的冷乙醚沉淀该浓缩物，过滤收集并高真空下干燥。在 G3000PW柱中通过大小排阻层析法纯化树枝状大分子样四支链-PEG。 用盐酸将包含所需结构的部分的pH调节至3，用1体积的DCM萃取3 次。用无水硫酸钠干燥合并的3次萃取部分并过滤。在旋转式蒸发器 中浓缩PEG的DCM溶液直至5mL。用30mL的冷乙醚沉淀该浓缩物， 过滤收集并高真空下干燥。通过SDS-PAGE确定纯度，用5％的氯化钡 溶液和100mM碘给凝胶染色，纯度在98％以上。通过MALDI-TOF确定 的分子量是45.5-50kDa。该方法的总收率在30％以上。

树枝状大分子样四支链-PEG官能化为N-羟基琥珀酰亚胺酯 (PEG_4,12K-NHS)

将1.5g的树枝状大分子样四支链-PEG溶解于5mL的干燥DCM中， 并加入9mg的N-羟基琥珀酰亚胺和37mg的N,N’-二环己基碳二亚 胺。将反应在室温和搅拌下保持24小时。过滤产物，并用20mL的冷 乙醚沉淀。将其溶解于丙酮并用乙醚沉淀，如此将沉淀重结晶3次。 高真空下干燥最终产物，并贮存于-20℃的氮气下。该方法的总收率在 95％以上。通过与甘氨酰-甘氨酸反应来确定激活的PEG的份数，通过 与TNBS反应来定量游离的氨基个数。

实施例2.用PEG_4,12K-NHS获得IFN-α2b缀合物

缀合反应

将活化成N-羟基琥珀酰亚胺酯(PEG_4,12K-NHS)的4g树枝状大分子 样四支链-PEG加入到溶液中，该溶液是包含浓度为6mg/mL的1g IFN-α2b的120mM硼酸盐缓冲液，且pH 8.5的溶液。温和搅拌下将 反应在4℃下保持1小时，然后用pH 4的10mM乙酸钠缓冲溶液稀释 50倍来停止反应。通过SDS-PAGE的光密度测定来确定反应的收率， 用考马斯亮蓝R-250染色。含有树枝状大分子样四支链-PEG的单PEG 化IFN-α2b的份数在40％以上。

纯化含有树枝状大分子样四支链-PEG的单PEG化IFN-α2b

用3体积的pH 4的10mM乙酸盐缓冲液，以40mL/分钟的流速 使包含500mL的触须型树脂填料Fractogel EMD 650(M)COO-的XK 50/60柱(Pharmacia公司)达到平衡。以相同流速将包含反应混合物的 溶液应用于该柱。用pH4的40mM乙酸盐缓冲液、和25mM的氯化钠 进行2小时的洗涤，以清除未反应的PEG和具有一个以上的PEG残基 的缀合物。用pH4的50mM乙酸钠缓冲液、和150mM的氯化钠洗脱单 PEG化的缀合物。纯度在96％以上，主要的污染物是未变性的干扰素和 二PEG化的缀合物。浓缩感兴趣的部分直至200mL，并应用于XK 50/60 柱(Pharmacia)上，该柱包含用pH7的50mM磷酸盐缓冲溶液，及用 100mM氯化钠平衡的1L的Sephadex G-25。通过0.2μm孔径的乙 酸纤维素膜过滤含有树枝状大分子样四支链-PEG的单PEG化的干扰 素，并在4℃下贮存。

实施例3.PEG_4,12K-IFN-α2b的物理-化学性质

确定缀合物的浓度

通过在280nm的UV-吸光度确定作为蛋白质残基的函数的缀合物 浓度。认为一个吸光度单位等于1mg/mL的浓度。

确定缀合物的分子量

通过MALDI-TOF确定缀合物的分子量。期望的树枝状大分子样四 支链-PEG的平均分子量是48,000Da，IFN-α2b的平均分子量是19,200 Da，因此该缀合物的理论分子量是67,200Da。PEG_4,12K-IFN-α2b的计 算分子量是64,000-70,000Da。

实施例4.PEG_4,12K-IFN-α2b缀合物的生物学性质

在ELISA-型分析中缀合物的免疫鉴定

将不同浓度的缀合物样品和阴性对照物应用于ELISA微量滴定 板上，该滴定板上补充有对抗IFN-α2b的单克隆抗体。接着，加入另 一种单克隆抗体，其中该抗体识别IFN-α2b的另一个表位，与辣根过 氧化物酶结合。我们认为，当缀合物样品的吸光度高于阴性样品的吸 光度的平均值加上这些值的标准差的3倍时，该样品就是免疫识别的。 在所有情况中，这些样品都被识别。

体外抗病毒活性

通过抑制脑心肌炎病毒对Hep-2细胞(ATCC No.CCL23)产生的细 胞病变效应来确定体外抗病毒活性。在96-孔微量滴定板的细胞单层 中混合缀合物的最小必需培养基的系列稀释液(1：2)，其中该培养基 含有2％胎牛血清和40μg/mL的庆大霉素。将该板在3％二氧化碳大气、 95％相对湿度和37℃下培养24小时。加入病毒(10⁷TCID)，培养该板， 直至细胞病变效应变得明显(90％细胞溶解)。通过用结晶紫将细胞染色 来测定细胞破坏的程度。用国际单位(IU)表示每种样品的活性，用世 界卫生组织的IFN-α2b国际标准69/19计算，表1是所得到的结果。

表1.天然IFN-α2b和与树枝状大分子样四支链-PEG缀合的 IFN-α2b的体外抗病毒活性

体外抗增殖活性

通过缀合的IFN-α2b抑制Daudi细胞(Burkitt Lymphoma)生长的 能力来测定体外抗增殖活性。结果表明，PEG_4,12K-IFN-α2b的体外活性 等于未变性的IFN-α2b的5％。

实施例5.PEG_4,12K-IFN-α2b的物理-化学稳定性

对于蛋白酶降解的抵抗性

将包含400μg/mL天然IFN-α2b与类似分子量的两或四支链-PEG 的缀合物的40微升4％碳酸氢钠溶液，pH 8与10μL的160μg/mL 胰岛素溶液混合。将样品在37℃下培养一段时间。用10μL的三氟乙 酸使反应停止。通过SDS-PAGE分析中谱带的消失来评价蛋白质(缀合 或未缀合)的残留量，用考马斯亮蓝染色。结果(附图1)表明，四个支 链的PEG结构对IFN-α2b缀合物降解的保护优于类似分子量的两 个支链-结构(●)产生的保护。

热稳定性

为了确定具有树枝状大分子样四支链-PEG的IFN-α2b缀合物的稳 定性，将天然和缀合后的蛋白质样品在60℃的磷酸盐缓冲溶液中进行 培养。使用类似分子量的两支链-PEG的IFN-α2b缀合物样品作为对照。 在某些时间分离样品，通过SDS-PAGE分析中谱带的消失来评价蛋白质 (缀合或未缀合)的残留量，用考马斯亮蓝染色。结果(附图2)表明， 具有四个支链的结构的缀合物的热稳定性高于其他两种情况[天 然IFN(■)，与两个支链结构的IFN缀合物(●)]。

实施例6.PEG_4,12K-IFN-α2b的药代动力学

在平均重量为2kg的新西兰兔中进行未变性干扰素和与树枝状大 分子样四支链-PEG的蛋白质缀合物之间的比较药代动力学研究。使用 两支链-PEG的IFN-α2b缀合物作为对照。通过每kg体重150μg蛋白 质的皮下途径来注射生物分子。在144小时的间隔里，在预定时间取 血样。离心样品，分离血清，并在-20℃下贮存至分析。用对该细胞因 子具有特异性的单克隆抗体通过ELISA-型分析来确定IFN-α2b浓度 (缀合或未缀合)。判读是基于经典的房室乳突模型。结果如表2所示。

表2.天然IFN-α2b、与两支链-PEG缀合的IFN-α2b和 PEG_4,12K-IFN-α2b的比较药代动力学

实施例7.其他治疗性蛋白质与树枝状大分子样四支链-PEG的缀 合

其他治疗性蛋白质例如重组链激酶(r-SK)、红细胞生成素(EPO)、 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和表皮生长因子(EGF)可以与树枝状大 分子样四支链-PEG缀合。评价缀合对蛋白酶降解率的效应。

激活为N-羟基琥珀酰亚胺酯的树枝状大分子样四支链-PEG的缀 合

将100mg的激活为N-羟基琥珀酰亚胺酯的树枝状大分子样四支 链-PEG(PEG_4,12K-NHS)加入到溶液中，该溶液是包含6mg/mL的25mg 治疗性蛋白质的120mM硼酸盐缓冲溶液、pH 8.5的溶液。温和搅拌 下将反应在4℃下保持1小时，然后用10mM乙酸钠缓冲溶液，pH 4 稀释50倍来停止反应。通过SDS-PAGE的光密度测定来确定反应的收 率，用考马斯亮蓝R-250将样品染色。在所有情况中，含有树枝状大 分子样四支链-PEG的单PEG化的蛋白质的比例都在30％以上。

用激活为醛的树枝状大分子样PEG进行缀合

将100mg的激活为醛的树枝状大分子样四支链-PEG(PEG_4,12K-ALD) 加入到溶液中，该溶液是包含4mg/mL的15mg治疗性蛋白质的100mM 乙酸盐缓冲溶液、pH 5并包含20mM氰基硼氢化钠的溶液。温和搅拌 下将反应在4℃下持续24小时，然后用1mM HCl稀释20倍来停止反 应。通过SDS-PAGE的光密度测定来确定反应的收率，用考马斯亮蓝 R-250将样品染色。在所有情况中，含有树枝状大分子样四支链-PEG 的单PEG化的蛋白质的比例都在30％以上。

树枝状大分子样四支链-PEG的缀合对于蛋白酶降解蛋白质的效 应

将包含400μg/mL天然蛋白质、或与四支链-PEG的缀合物的40 微升4％碳酸氢钠溶液，pH 8与10μL的160μg/mL胰岛素溶液混合。 将样品在37℃和温和搅拌下培养4小时。然后用10μL的三氟乙酸使 反应停止。通过SDS-PAGE分析中谱带的消失来评价蛋白质(缀合或未 缀合)的残留量，用考马斯亮蓝染色。结果(表3)表明，与树枝状大分 子样四支链-PEG的缀合保护了缀合的蛋白质免受胰岛素的降解。在所 有情况中，不依赖于所使用的化学缀合方法，在与胰岛素反应4小时 后，超过35％的蛋白质都没有消化。但是，天然蛋白质在该反应时间 后，没有检测到任何信号。

表3：相对于反应前的蛋白质量，未消化的蛋白质的份数(％)