一种快速检测灵芝孢子粉中孢子值的方法

摘要

本发明涉及真菌孢子破壁情况的测定方法，尤其是灵芝孢子的孢子值的测定方法。本发明为一种测定灵芝孢子的孢子值的方法，其要点在于取待测孢子粉B制得适当的悬浮液，定容后，混合均匀，在具C6目镜测微尺的显微镜下观察统计单位视野完整孢子数与破壁孢子数，计算出孢子值即完整孢子数占完整孢子数与破壁孢子数总和的百分比值。本发明的优点在于利用C6测微尺对分散均匀的孢子粉完整孢子和破壁孢子的面积进行计数，达到了操作简单、价格低廉、检测结果具有代表性的目的。

说明书

技术领域

本发明涉及一种真菌孢子粉中孢子值检测方法，尤其是能快速检测灵芝孢子破壁后且无同批次未破壁灵芝孢子粉中的孢子值，属于中药领域。

背景技术

灵芝孢子是灵芝在生长成熟期，从灵芝菌褶中弹射出来的及其微小的卵形生殖细胞，及灵芝的种子。它凝聚了灵芝的精华，具灵芝的全部遗传物质和保健作用。灵芝孢子粉的外壳包括两层由十分坚硬的几丁质和葡聚糖构成的孢壁；孢壁质地坚硬，具有耐酸碱、抗氧化、耐压抗热、耐酶抗消化等性质，限制了人体对灵芝孢子内营养成分的吸收利用。孢壁破碎或消除之后，由孢壁所紧裹的有效成分才能最大程度地被人体肠胃直接吸收。有资料表明，破壁的灵芝孢子粉有利于三萜、粗多糖、粗脂肪等成分的溶出，其中粗多糖含量比未破壁灵芝孢子粉高出70%。若直接食用未破壁的灵芝孢子粉，人体仅能利用12%左右的有效成分，而服用破壁后的灵芝孢子粉，有效成分利用率可达95%以上。因此，破壁灵芝孢子粉的破壁率的大小就是能否最大程度上利用灵芝孢子粉有效成分的关键所在。对于市场上众多的灵芝孢子粉，破壁率常被作为衡量这种产品质量的重要指标。

目前，破壁灵芝孢子粉的质量标准主要是破壁率，破壁率的测定主要参考农业部标准《NY/T1677-2008破壁灵芝孢子粉破壁率的测定》以及国家标准《GB/T29344-2012 灵芝孢子粉采收加工技术规范》附录A “破壁灵芝孢子粉破壁率的测定方法”。在这两个标准中，破壁率测定原理都是通过血球计数板对未破壁的孢子进行计数，然后计算出单位重量所含完整孢子的数量，利用公式

孢子破壁率（%）=（1- 破壁后完整的孢子/破壁前完整的孢子）×100%

计算出孢子的“破壁率”。需建立灵芝孢子粉质量与孢子个数之间的标准曲线，利用此标准曲线确定同批次一定质量待测破壁孢子粉中未破壁孢子粉的孢子个数，获得破壁孢子粉的破壁率。但是，此种方法需同批次待测破壁孢子粉中未破壁孢子粉，而实际生活中消费者购买的均为破壁灵芝孢子粉，无法获得同批次未破壁灵芝孢子粉，进而无法对其破壁率进行检测，因而本发明提出检测其孢子值。

除血球计数板法外，目前公开报道的破壁率的测定方法还有水装片结合显微技术的方法、悬浮法结合物理技术检测方法以及化学指纹检测方法。但化学成分分析方法的检测步骤复杂，所用仪器昂贵，检测成本较高。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术中的不足之处，提供一种使孢子平均分散程度较高，较为精确的测定破壁灵芝孢子粉孢子值的方法。孢子值即为破壁灵芝孢子粉中的完整孢子数占完整孢子数与破壁孢子数总和的百分比值。由于破壁孢子数无法计数，采用C6型目镜测微尺，对其面积进行计数，小格内含物质超过1/2记为1个小格，不满1/2记为0个小格，恰好1/2则记为0.5个小格。分别对未破壁灵芝孢子和已破壁灵芝孢子计数，未破壁灵芝孢子数占未破壁灵芝孢子数与已破壁孢子数总和的平均百分比值，即为孢子值。

本发明为一种快速检测灵芝孢子的孢子值的方法，其特征在于：

（1）取待测孢子值的灵芝孢子粉B，烘干至恒重，并使用一定量的水合氯醛试液与玻璃研钵上多次轻柔研匀，超声混匀，后定容至相同体积，混合均匀，得到相应的悬浮液；

（2）取上述灵芝孢子粉悬浮液点滴在载玻片上，在显微镜下，使用C6型目镜测微尺，分别读出完整孢子及破碎孢子所占小格数；小格内含完整孢子或破碎孢子超过1/2记为1个小格，不满1/2记为0个小格，恰好1/2则记为0.5个小格；利用公式

孢子值（%）= [完整孢子数÷（完整孢子数+破壁孢子数）]×100%

计算出孢子值；其中，孢子值是指破壁灵芝孢子粉中的完整孢子数占完整孢子数与破壁孢子数总和的百分比值，完整孢子数是指完整孢子所占的格子，破壁孢子数是指破碎孢子所占的格子。且以孢子粉A的孢子值为评判标准。

   本发明选用混悬液为水合氯醛，在孢子粉分散均匀后，定量点样于载玻片，经试验比对，选用水合氯醛试液孢子粉的分散效果较硫酸锌试液等效果好，因其密度和黏度有利于孢子在悬浮液中的物理稳定性，但这不是本发明最重要的原因。

为了计量准确，所使用的破壁孢子粉需为未添加任何辅料的破壁灵芝孢子粉，且应除去杂质，60℃烘干至恒重。

为了增加孢子在水合氯醛中的分散性和减少孢子重新聚集，在定容后进行机械搅拌，如超声混匀。

由于孢子破壁后，单个视野中所含完整的未破壁的孢子数较少，为了计量准确，所取的破壁孢子粉的量应适当增多，若孢子粉量太多，载玻片上破壁孢子粉聚集，视野下不能形成单层孢子粉。

本发明的优点在于利用同一孢子粉破壁与完整孢子数固定不变，在孢子粉悬浮液中均匀分散，从而达到了技术精确，操作简单低廉，检测结果具有代表性的目的。

附图说明

图1 显微镜下在硫酸锌乙醇溶液里的孢子分布状态(注：A. 未破壁灵芝孢子; B. 破壁灵芝孢子)。

图2 显微镜下在本专利方法处理后的未破壁孢子分布状态(注：A. 未破壁灵芝孢子; B. 破壁灵芝孢子)。

图3 显微镜下在本专利方法处理后的破壁孢子分布状态(注：A. 未破壁灵芝孢子; B. 破壁灵芝孢子)。

图4 显微镜下C6目镜测微尺中孢子分布状态(注：A. 未破壁灵芝孢子; B. 破壁灵芝孢子)。

 图5 实施例1中样本的孢子值分析结果。

图6 实施例2中样本的孢子值分析结果。

图7 实施例3中样本的孢子值分析结果。

图8 实施例4中样本的孢子值分析结果。

具体实施方式

以下进一步说明本发明的具体步骤及条件：

实施例1：

1、制备孢子悬浮液

   （1）取4份（分别来源于不同厂家或同一厂家不同批次的样品，见表1，样品编号为P01-P04）适量的已知破壁率的灵芝孢子粉A（破壁率≧98%）和市售未知破壁率孢子粉B（孢子粉B采用常规方法，即国家标准《GB/T29344-2012 灵芝孢子粉采收加工技术规范》附录A “破壁灵芝孢子粉破壁率的测定方法”，测得其破壁率>98%；见表1，样品编号为P05)，在烘箱60℃下烘干5小时。

   （2）精确定量称取经烘干的孢子粉A和B（W=0.04g）。

   （3）将上述孢子粉放入直径5mm的玻璃研钵，用水合氯醛试液少量多次轻轻研匀孢子粉尽量使其团块分散，并用水合氯醛定容到5ml容量瓶中，再超声20min，使孢子在悬浮液中充分分散。

   2、观察与计数

  （1）用移液枪吸取10μl上述检测用孢子悬浮液，置于盖玻片的边缘，使液体缓缓渗入，多余的液体用吸水纸吸除，稍等片刻后，在400倍显微镜下观察孢子，如图2、3所示，孢子平均分散。

（2）在10×40倍数的显微镜下，分别读取C6测微尺上5×5mm²大格中完整孢子数和破壁孢子数，移动载物台标尺，使25个视野平均分布于整玻片，25个视野的平均值即为孢子值。每份待测液平行6张玻片，计算它们的平均数，N_A和N_B。

3、数据计算

（1）孢子值（%）= [完整孢子数÷（完整孢子数+破壁孢子数）]×100%

完整孢子数即为完整孢子所占小格数，破壁孢子数即为破壁孢子所占小格数，具体结果请见图5.

图5 样本的孢子值分析结果 （见说明书附图）

 注：样品来源如下：P01（四川辅正药业有限责任公司，批号：140801）；P02（成都市康华药业有限公司，批号：L140701）；P03（成都市康华药业有限公司，批号：L131101）；P04（成都市康华药业有限公司，批号：L140101）；P05（荷花池中药材市场）。

由图5中的数据可知，利用本发明提供的检测方法能够快速检测出样品的孢子值，且结果精确，与其反应灵芝孢子的破壁情况与其相应的破壁率在误差范围内，操作简单低廉，具有推广价值。

实施例2：

1、制备孢子悬浮液

   （1）取适量的已知破壁率的灵芝孢子粉C（未破壁） ，在烘箱60℃下烘干5小时。

   （2）精确定量称取经烘干的孢子粉C（W=0.04g）。

   （3）将上述孢子粉放入直径5mm的玻璃研钵，用水合氯醛试液少量多次轻轻研匀孢子粉尽量使其团块分散，并用水合氯醛定容到5ml容量瓶中，再超声20min，使孢子在悬浮液中充分分散。

   2、观察与计数

  （1）用移液枪吸取10μl上述检测用孢子悬浮液，置于盖玻片的边缘，使液体缓缓渗入，多余的液体用吸水纸吸除，稍等片刻后，在400倍显微镜下观察孢子，如图2、3所示，孢子平均分散。

（3）在10×40倍数的显微镜下，分别读取C6测微尺上5×5mm²大格中完整孢子数和破壁孢子数，移动载物台标尺，使25个视野平均分布于整玻片，25个视野的平均值即为孢子值。每份待测液平行6张玻片，计算它们的平均数，N_C。

4、数据计算

（1）孢子值（%）= [完整孢子数÷（完整孢子数+破壁孢子数）]×100%

完整孢子数即为完整孢子所占小格数，破壁孢子数即为破壁孢子所占小格数，具体结果请见图6.

图6 样本的孢子值分析结果（见说明书附图）

 实施例3：

1、制备孢子悬浮液

   （1）取适量的已知破壁率的灵芝孢子粉D（破壁率50%），在烘箱60℃下烘干5小时。

   （2）精确定量称取经烘干的孢子粉D（W=0.04g）。

   （3）将上述孢子粉放入直径5mm的玻璃研钵，用水合氯醛试液少量多次轻轻研匀孢子粉尽量使其团块分散，并用水合氯醛定容到5ml容量瓶中，再超声20min，使孢子在悬浮液中充分分散。 

   2、观察与计数

  （1）用移液枪吸取10μl上述检测用孢子悬浮液，置于盖玻片的边缘，使液体缓缓渗入，多余的液体用吸水纸吸除，稍等片刻后，在400倍显微镜下观察孢子，如图2、3所示，孢子平均分散。

（4）在10×40倍数的显微镜下，分别读取C6测微尺上5×5mm²大格中完整孢子数和破壁孢子数，移动载物台标尺，使25个视野平均分布于整玻片，25个视野的平均值即为孢子值。每份待测液平行6张玻片，计算它们的平均数N_D。

5、数据计算

（1）孢子值（%）= [完整孢子数÷（完整孢子数+破壁孢子数）]×100%

完整孢子数即为完整孢子所占小格数，破壁孢子数即为破壁孢子所占小格数，具体结果请见图7.

图7 样本的孢子值分析结果（见说明书附图）

 实施例4：

1、制备孢子悬浮液

   （1）取适量的已知破壁率的灵芝孢子粉E（破壁率75%），在烘箱60℃下烘干5小时。

   （2）精确定量称取经烘干的孢子粉E（W=0.04g）。

   （3）将上述孢子粉放入直径5mm的玻璃研钵，用水合氯醛试液少量多次轻轻研匀孢子粉尽量使其团块分散，并用水合氯醛定容到5ml容量瓶中，再超声20min，使孢子在悬浮液中充分分散。

   2、观察与计数

  （1）用移液枪吸取10μl上述检测用孢子悬浮液，置于盖玻片的边缘，使液体缓缓渗入，多余的液体用吸水纸吸除，稍等片刻后，在400倍显微镜下观察孢子，如图2、3所示，孢子平均分散。

（5）在10×40倍数的显微镜下，分别读取C6测微尺上5×5mm²大格中完整孢子数和破壁孢子数，移动载物台标尺，使25个视野平均分布于整玻片，25个视野的平均值即为孢子值。每份待测液平行6张玻片，计算它们的平均数N_E。

6、数据计算

（1）孢子值（%）= [完整孢子数÷（完整孢子数+破壁孢子数）]×100%

完整孢子数即为完整孢子所占小格数，破壁孢子数即为破壁孢子所占小格数，具体结果请见图8.

图8 样本的孢子值分析结果（见说明书附图）