一种蓝靛果提取物及其在制备肝脏细胞氧化损伤抑制剂中的应用

摘要

本发明公开了一种蓝靛果提取物，按质量百分含量计，该蓝靛果提取物的组成为：矢车菊素-3-葡萄糖苷72.4％～87.5％，矢车菊素-3-芸香糖苷1.4％～9.6％，芍药素-3-葡萄糖苷2.7％～7.1％，矢车菊-3,5-二葡萄糖苷2.1％～3.7％，芍药素-3-芸香糖苷1.3％～3.4％，天竺葵素-3-葡萄糖苷2.3％～3.9％。提取步骤为：蓝靛果鲜果依次经胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解后，离心分离得到上清液，所述上清液经超滤膜过滤后截留分子量大于5kDa的成分，滤出液经真空冷冻干燥，得到所述的蓝靛果提取物。本发明还公开了该蓝靛果提取物在制备肝脏细胞氧化损伤的抑制剂中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种蓝靛果提取物及其在制备肝 脏细胞氧化损伤抑制剂中的应用。

背景技术

丙烯酰胺(Acrylamide，AA)俗称丙毒，是一种具有神经毒性和潜在 致癌性的化学物质，它可作为化工原料，而富含淀粉的食品在热加工过程 中也会产生丙烯酰胺。研究表明，丙烯酰胺具有神经毒性、遗传毒性以及 致癌性，国际癌症研究机构(IARC)1994年对其致癌性进行了评价，将 丙烯酰胺列为2类致癌物(2A)即人类可能致癌物。周继等(周继，黄红 焰，李玉白，刘劭钢，丙烯酰胺毒性与氧化损伤的实验研究[J].实用预防 医学，2008，15(2):537-539)以0.5，1.0，1.5μg/kg 3个剂量对SD大鼠 每天腹腔注射丙烯酰胺染毒1次，每周6d，连续3个月，发现高剂量组动 物肝脏脏器系数明显增大(p<0.05)，血清中丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬 氨酸转氨酶(AST)活性明显增加(p<0.05)；另外，与空白对照组和溶剂 对照组比较，肝、肾中ROS含量未见明显差别(p均>0.05)；中、高剂量 组丙二醛(MDA)含量明显升高(p<0.05)，各剂量组超氧化物歧化酶(SOD) 活性明显降低(p<0.05)。实验发现丙烯酰胺染毒大鼠，其心、肝、肾均 受到一定成都的损伤，同时发现丙烯酰胺具有一定的氧化损伤作用。

自由基是机体内氧化反应产生的物质，具有很强的氧化性，现代研究 表明，自由基是引起人体衰老和某些慢性疾病发生的原因之一，当人体内 的自由基产生过多或清除过慢时，就会转而攻击各种细胞器官，损害机体 的组织，进而引起慢性疾病及衰老效应并诱发各种疾病。

因此，研制一种对肝脏损伤有保护作用的物质，尤其是由丙烯酰胺导 致的肝脏损伤有保护作用的物质是很有必要的。

蓝靛果忍冬(Blue honeysuckle)别称蓝靛果、山茄子、黑瞎子果、鸟 啄李和羊奶子等，为忍冬科(Caprifoliaceae)、忍冬属(Lonicera)落叶 灌木。蓝靛果果实呈蓝黑色或紫色，柔软多汁，酸甜略带苦味，营养丰富， 富含维生素，多种微量元素及多酚、花色苷等功能性成分，具有抗肿瘤、 抗氧化、抗疲劳、调节免疫、保护视力、降血脂、抗炎以及促进肝损伤修 复等多种生物活性。

金政等(金政,王启伟,金美善,李相伍.蓝靛果对四氯化碳所致小鼠 肝损伤修复作用的形态学研究[J].中国中医药科技,2002,9(1):46-46.)的 研究表明四氯化碳可以诱导肝脏细胞的损伤，主要是导致小鼠肝组织损伤 显示以中央静脉为中心的出血和坏死,坏死区周围有大量脂肪变性细胞。 而蓝靛果提取物会使小鼠肝组织损伤大为减轻，各肝小叶变性坏死范围缩 小，仅表现为少数的灶性坏死和轻度的脂肪变性。四氯化碳会损伤组肝细 胞使糖原减少，而蓝靛果会使糖原损伤基本恢复。四氯化碳还会损伤组琥 珀酸脱氢酶活性显著降低，而蓝靛果提取物则能降低损伤。

发明内容

本发明公开了一种蓝靛果提取物，模拟人体胃消化的方式，采用胃蛋 白酶、胰蛋白酶等制备得到。该蓝靛果提取物能够有效抵抗丙烯酰胺诱导 的氧化损伤。

一种蓝靛果提取物，提取步骤如下：

蓝靛果鲜果依次经胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解后，酶解液经分离得到上 清液，所述上清液经过滤后截留分子量大于5kDa的成分，滤出液再经真 空冷冻干燥，得到所述的蓝靛果提取物；

以质量百分比计，所述蓝靛果提取物包括：

本发明蓝靛果提取物含有人体最终吸收的有效成分，由于采用体外模 拟的方式，最大限度的保留了有效成分，其功能性具有实用性；而通过传 统方法提取的蓝靛果产物，进入人体后，会有部分有效物质被人体消化系 统分解消化，因而功能性具有不可预测性，不能代表进入人体后的真实情 况。

作为优选，蓝靛果鲜果经胃蛋白酶酶解的具体步骤为：

蓝靛果鲜果与水等质量混合打浆，加入HCl调节pH＝1.5～2后得到匀 浆，再加入胃蛋白酶，37℃、200～300rpm下水浴振荡2～3h，得到混合浆 液；

进一步优选，所述HCl的浓度为5mol/L；

所述胃蛋白酶的加入量为5000～7000单位胃蛋白酶/20g匀浆。

作为优选，胰蛋白酶酶解的具体步骤为：

取经胃蛋白酶酶解得到的混合浆液，加入NaOH调节pH＝6，再加入 胰液，然后用NaHCO₃调节pH至7.2～7.5，37℃，200～300rpm水浴振荡 2～3h后，再经5000～8000rpm下离心10～15min得到上清液。

进一步优选，所述NaOH的浓度为1mol/L，NaHCO₃的浓度为1mol/L；

所述胰液中胰蛋白酶的含量为5～6mg/mL，胆盐的含量为20～30 mg/mL；所述胰液的加入量为5mL/18mL混合浆液。

本发明还公开了所述蓝靛果提取物在制备肝脏细胞氧化损伤的抑制 剂中的新用途，拓展了蓝靛果的应用领域。

进一步公开了所述的蓝靛果提取物在制备由丙烯酰胺诱导的肝脏细 胞氧化损伤的抑制剂中的应用。

作为优选，所述的抑制剂中蓝靛果提取物的有效剂量为0.25mg/mL。

丙烯酰胺使肝脏细胞产生氧自由基从而对其造成氧化损伤，本研究发 现，蓝靛果提取物可以有效减少活性氧的生成，从而抑制丙烯酰胺诱导的 肝脏细胞氧化损伤。与金政等(金政,王启伟,金美善,李相伍.蓝靛果对 四氯化碳所致小鼠肝损伤修复作用的形态学研究[J].中国中医药科技, 2002,9(1):46-46.)的四氯化碳损伤研究中，蓝靛果提取物是直接用水提取， 而本实验是采用模拟体外消化的方法提取蓝靛果活性物质，所得蓝靛果提 取物的成分不同。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明模拟人体胃消化的方式，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶制备蓝靛果 提取物。

本发明首次发现了蓝靛果提取物能够有效抗丙烯酰胺诱导的氧化损 伤，减少活性氧的生成，是一个具有良好开发前景的化合物；

本发明为蓝靛果提取物提供了新的医疗用途，拓展了一个新的应用领 域。

附图说明

图1实施例1为蓝靛果提取物ABTS·+自由基清除能力；

图2实施例2为蓝靛果提取物的FRAP抗氧化实验；

图3实施例2为蓝靛果提取物对丙烯酰胺诱导的HepG2细胞氧化损伤的 保护作用；

图4实施例3为蓝靛果提取物对丙烯酰胺诱导的HepG2细胞活性氧自由 基ROS(DCF荧光)的抑制作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明 的具体实施例，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

蓝靛果鲜果与水等质量混合打浆，用5M HCl将蓝靛果匀浆酸化至 pH＝2，加入胃蛋白酶(5000单位胃蛋白酶/20g匀浆)，在37℃，200rpm 水浴振荡3h，模拟胃消化后，继续用1M NaOH调pH至6，每18ml混 合浆液加入5mL胰液(胰液中胰酶含量为6mg/mL，胆盐含量为20 mg/mL)，再用1M NaHCO₃调pH至7.2，在37℃，200rpm水浴振荡2h， 8000rpm条件下离心10min，上清液即为蓝靛果粗提取物。利用Millipore  Pellicon超滤系统，将上清液泵至截留分子量为5kDa的再生纤维素超滤 膜表面，收集滤出液，真空冷冻干燥，得到蓝靛果提取物。

经液相色谱测试可知，该蓝靛果提取物的主要成分如下表所示：

表1

成分 含量 矢车菊素-3-葡萄糖苷 87.5％ 矢车菊素-3-芸香糖苷 1.4％ 芍药素-3-葡萄糖苷 2.7％ 矢车菊-3,5-二葡萄糖苷 2.1％ 芍药素-3-芸香糖苷 1.3％ 天竺葵素-3-葡萄糖苷 2.2％

实施例2

蓝靛果鲜果与水等质量混合打浆，用5M HCl将蓝靛果匀浆酸化至 pH＝1.5，加入胃蛋白酶(6000单位胃蛋白酶/20g匀浆)，在37℃，250rpm 水浴振荡2。5h，模拟胃消化后，继续用1M NaOH调pH至6，每18ml 混合浆液加入5mL胰液(胰液中胰酶含量为5mg/mL，胆盐含量为25 mg/mL)，再用1M NaHCO₃调pH至7.3，在37℃，250rpm水浴振荡2.5 h，6000rpm条件下离心12min，上清液即为蓝靛果粗提取物。利用 Millipore Pellicon超滤系统，将上清液泵至截留分子量为5kDa的再生纤 维素超滤膜表面，收集滤出液，真空冷冻干燥，得到蓝靛果提取物。

实施例3

蓝靛果鲜果与水等质量混合打浆，用5M HCl将蓝靛果匀浆酸化至 pH＝2，加入胃蛋白酶(8000单位胃蛋白酶/20g匀浆)，在37℃，300rpm 水浴振荡2h，模拟胃消化后，继续用1M NaOH调pH至6，每18ml混 合浆液加入5mL胰液(胰液中胰酶含量为6mg/mL，胆盐含量为25 mg/mL)，再用1M NaHCO₃调pH至7.4，在37℃，300rpm水浴振荡2h， 5000rpm条件下离心15min，上清液即为蓝靛果粗提取物。利用Millipore  Pellicon超滤系统，将上清液泵至截留分子量为5kDa的再生纤维素超滤 膜表面，收集滤出液，真空冷冻干燥，得到蓝靛果提取物。

性能测试

以实施例1制备的蓝靛果提取物为样品，测试其对丙烯酰胺诱导的肝脏细 胞氧化损伤的保护作用

(1)体外抗氧化测定(ABTS法)

ABTS[2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)]法可用于测定生物样品 的抗氧化能力。ABTS经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基 ABTS·+，若受试物能与ABTS·+发生反应而使反应体系褪色，则提示受试 物具有降低ABTS·+自由基的活性。

根据参考文献的方法，配制ABTS·+工作液，在适量的ABTS·+工作 液中加入适量的样品液，充分混合，室温条件下反应6min(避光)，测定 734nm下的吸光度Ai，以等量的双蒸水代替样品液做空白，记其吸光度 为A0，以抗坏血酸作为阳性对照。ABTS·+自由基清除率(％) ＝[(A0-Ai)/A0]×100％。如图1显示，蓝靛果提取物具有较好的体外抗氧 化能力，经计算，对照组(未经过消化)的IC50为2.43mg/ml，实验组(蓝 靛果提取物)的IC50为1.46mg/ml。

(2)体外抗氧化测定(FRAP法)

FRAP法(铁离子还原法)常用于天然产物抗氧化活性的评价。三价 铁离子经还原后可与TPTZ(2,4,6-三吡啶基三嗪)反应生成蓝色复合物， 其生成量与受试物的还原能力成一定比例，若受试物能与其反应并使体系 产生该蓝色复合物，则提示受试物具有还原三价铁离子的能力。

根据参考文献的方法：配制FRAP工作液，即100ml的300mM的醋 酸盐缓冲液(pH3.5)，10ml的10mM TPTZ，10ml的20mM三氯化铁以 10:1:1体积混合。在适量的FRAP工作液中加入适量的样品液，充分混合， 37℃水浴下避光反应30min，测定593nm下的吸光度。以Vc当量表示样 品的抗氧化能力。如图2显示，蓝靛果提取物具有较好地体外抗氧化能力， 经计算，对照组(未经过消化)为1.2519μg Vc/mg，实验组(蓝靛果提取 物)为1.5645μg Vc/mg。

(3)细胞存活率测定(MTT法)

按照参考文献的方法，采用MTT法检测细胞的存活率。将对数期的 HepG2细胞接种到96孔细胞培养板中(浓度为3.5×10³个细胞/孔)，孵育 24h后；在含有0.25mg/mL浓度蓝靛果提取物的条件下，用丙烯酰胺 (5mM)处理HepG2细胞24h，然后用MTT(0.5mg/mL)孵育4h。生 成的沉淀物溶解于150μL的DMSO中，用酶标仪检测费490nm处的吸 光度。

细胞存活率(％)＝[A样品/A空白]×100％

如图3显示，HepG2细胞经5mM AA损伤2h后，细胞密度明显降低， 与正常组相比，细胞存活率为75.14％，具有统计学意义(p<0.05)。蓝 靛果提取物在5mM AA浓度作用下时，对HepG2细胞有较好的保护作用， 与对照组相比，具有显著性差异，0.25mg/mL蓝靛果提取物作用下(细胞 存活率达81.08％，p<0.05)，上述结果证实了蓝靛果提取物具有干预丙烯 酰胺诱导的细胞损伤的保护作用。

(4)细胞内ROS水平检测(DCF荧光)

收集对数期的HepG2细胞，将细胞接种到6孔细胞培养板中(浓度 为8×10⁵个细胞/孔)，孵育24h后；在含有0.25mg/mL浓度蓝靛果提取物 的条件下，分别用丙烯酰胺(5mM)处理HepG2细胞24h，然后用 DCFH-DA染色，37℃孵育30min，将染料洗净后用荧光显微镜观察并拍 照，然后分析其荧光强度。

如图4显示，与未处理的对照组(control)相比，经5mM AA作用 肝细胞HepG22h，荧光强度明显增强(荧光强度151.1％)。蓝靛果提取物 能显著降低AA诱导产生的ROS荧光强度，且具有统计学意义，0.25 mg/mL蓝靛果提取物效果最佳(荧光强度117.9％)。上述结果表明蓝靛果 提取物能有效降低AA诱导产生的细胞ROS水平。

最后，本发明可用其他的不违背本发明的精神和主要特征的具体形式 来概述。因此，无论从那一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是 对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而 上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当 的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。