用于鲤鱼种质鉴定的SNP标记组合、方法及用途

摘要

本发明公开了用于鲤鱼种质鉴定的SNP标记组合，其包括如SEQ ID NO：1～29所示的核苷酸序列。本发明还公开一种用于鲤鱼种质鉴定的方法，包括：步骤一、获取待鉴定种质鲤鱼的基因组DNA和已知种质候选亲本鲤鱼的基因组DNA；步骤二、利用微流体系统检测待鉴定种质鲤鱼的基因组DNA和候选亲本的基因组DNA，获得每条鲤鱼的多个SNP标记位点的基因型；以及，步骤三、根据孟德尔遗传规律分析每条鲤鱼的多个SNP标记位点的基因型的结果，判断出待鉴定种质鲤鱼与已知种质候选亲本鲤鱼中的哪条鲤鱼有亲缘关系，以确定待鉴定种质鲤鱼的种质。本发明还公开了SNP标记组合在鲤鱼种质鉴定中的用途。本发明分型准确、效率高。

说明书

技术领域

本发明涉及鲤鱼种质鉴定领域，特别涉及用于鲤鱼种质鉴定的SNP标记组合，也特别涉及一种用于鲤鱼种质鉴定的方法，同时也特别涉及SNP标记组合用于鲤鱼种质鉴定中的用途。

背景技术

目前，应用于鲤鱼种质鉴定的分子标记主要是微卫星。利用微卫星对基因组DNA进行分型的一般思路为，PCR扩增和电泳检测，然后根据片段大小分离等位基因进行分析；扩增后的等位微卫星可以用多种方法检测，传统方法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，该方法费时费力效率低；目前较为先进的是荧光标记毛细管电泳，该方法虽然效率高，但成本也比较高。微卫星分型的主要不足之处体现在，使用同一引物进行重复扩增时，较难得到稳定一致的条带，严重影响分型的准确性，这极大限制了微卫星分型技术的广泛推广。由此可见，当前的微卫星分型技术存在操作繁琐，效率较低等缺点。尤其是微卫星标记数量有限，在一定程度上限制了其在种质鉴定中的应用。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供用于鲤鱼种质鉴定的SNP标记组合，本发明提供的SNP标记是从不同品系的鲤鱼中开发得到的全新的SNP标记，且能够利用该SNP标记组合中的不同的标记组合来进行鲤鱼的种质鉴定。

本发明的再一个目的是一种用于鲤鱼种质鉴定的方法，本发明通过微流体系统利用SNP标记组合进行鲤鱼的种质鉴定，扩增时条带稳定一致，提高了分型的准确性，并且操作简便、效率高，以解决利用微卫星分型时较难得到稳定一致的条带的问题及操作繁琐，效率较低等缺点。

本发明的又一个目的是SNP标记组合用于鲤鱼种质鉴定中的用途，本发明的SNP标记数量多，能够通过几组数量不同的SNP标记形成几组不同的组合广泛深入地用于鲤鱼种质鉴定。

为此，本发明提供的技术方案为：

用于鲤鱼种质鉴定的SNP标记组合，所述SNP标记组合包括：碱基序列如SEQ ID NO：1～29所示的核苷酸序列。

优选的是，所述的用于鲤鱼种质鉴定的SNP标记组合中，所述SNP标记组合还包括：碱基序列如SEQ ID NO：30～37所示的核苷酸序列。

优选的是，所述的用于鲤鱼种质鉴定的SNP标记组合中，所述SNP标记组合还包括：碱基序列如SEQ ID NO：38～44所示的核苷酸序列。

优选的是，所述的用于鲤鱼种质鉴定的SNP标记组合中，所述SNP标记组合还包括：碱基序列如SEQ ID NO：44～48所示的核苷酸序列。

一种用于鲤鱼种质鉴定的方法，包括如下步骤：

步骤一、获取待鉴定种质鲤鱼的基因组DNA和已知种质候选亲本鲤鱼的基因组DNA；之后进入步骤二，

步骤二、利用微流体系统检测待鉴定种质鲤鱼的基因组DNA和候选亲本的基因组DNA，获得每条鲤鱼的多个SNP标记位点的基因型，其中，所述多个SNP标记位点包括碱基序列如SEQ ID NO：1～29所示的核苷酸序列，在微流体系统检测中，利用特定的探针序列组一一对应检测所述多个SNP标记位点的基因型，每组探针序列组均由等位基因1特异探针、等位基因2特异探针、和位点特异探针组成，检测时，等位基因1特异探针、等位基因2特异探针分别和位点特异探针各自组成一对引物，以用于分别检测SNP位点处两个等位基因的基因型，SEQ ID NO：1～29所示的核苷酸序列对应的探针序列组的碱基序列依次各自分别为如SEQ ID NO：49～135所示的核苷酸序列；以及，之后进入步骤三，

步骤三、利用生物信息学软件根据孟德尔遗传规律分析步骤二中得到的每条鲤鱼的多个SNP标记位点的基因型的结果，判断出待鉴定种质鲤鱼与已知种质候选亲本鲤鱼中的哪条鲤鱼有亲缘关系，以确定待鉴定种质鲤鱼的种质。

优选的是，所述的用于鲤鱼种质鉴定的方法中，所述步骤二中，所述多个SNP标记位点还包括：碱基序列如SEQ ID NO：30～37所示的核苷酸序列，用于检测所述如SEQ ID NO：30～37所示的核苷酸序列的基因型的对应的探针序列组的碱基序列依次各自分别为如SEQ ID NO：136～159所示的核苷酸序列。

优选的是，所述的用于鲤鱼种质鉴定的方法中，所述步骤二中，所述多个SNP标记位点还包括：碱基序列如SEQ ID NO：38～44所示的核苷酸序列，用于检测所述如SEQ ID NO：38～44所示的核苷酸序列的基因型的对应的探针序列组的碱基序列依次各自分别为如SEQ ID NO：160～180所示的核苷酸序列。

优选的是，所述的用于鲤鱼种质鉴定的方法中，所述步骤二中，所述多个SNP标记位点还包括：碱基序列如SEQ ID NO：44～48所示的核苷酸序列，用于检测所述如SEQ ID NO：44～48所示的核苷酸序列的基因型的对应的探针序列组的碱基序列依次各自分别为如SEQ ID NO：181～192所示的核苷酸序列。

优选的是，所述的用于鲤鱼种质鉴定的方法中，所述步骤一中，所述基因组DNA从该鲤鱼的鳍条、肌肉、或血液得到。

所述的SNP标记组合用于鲤鱼种质鉴定中的用途。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明获得鲤鱼各个品系中共有的48个SNP位点，并对这48个SNP位点在鲤鱼种质鉴定中的作用进行了研究。以29、37、44、48个SNP分型，都能够对鲤鱼种质鉴定进行很好的鉴别。与微卫星标记相比，SNP标记具有明显的优越性，主要体现在，标记数量大基因组覆盖率高，分型操作简单且速度快，分型准确度高且容易在不同环境下形成统一标准。基于目前SNP分型技术的特点，本发明更以Fluidigm公司的微流体芯片(microfluidic-basedchip)为技术支撑设计了专门应用于鲤鱼种质鉴定的“48SNP array”，其中包括48个SNP位点，且分别位于鲤鱼的48条染色体上，这既满足了SNP位点在鲤鱼全基因组范围内的覆盖，也有效地避免了连锁不平衡。尤其是该微流体芯片分型技术具有通量高、准确率高、操作简单等优点，使得其更容易广泛应用于实际生产实践中。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1a为本发明其中一个实施例中166个子代黄河鲤样本的基因型分型结果基因型分型检出率(call rate)分布情况。

图1b为本发明其中一个实施例中20个亲本黄河鲤样本的基因型分型结果基因型分型检出率(call rate)分布情况。

图2为本发明其中一个实施例中从186个黄河鲤样本(166个子代，20个亲本)得到的48个SNP位点的最小等位基因频率(MAF)分布情况。

图3为本发明其中一个实施例中从186个黄河鲤样本(166个子代，20个亲本)得到的48个SNP位点的多态信息含量(PIC)分布情况。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

发明人通过对33尾不同品系的鲤鱼进行基因组重测序，然后比对到参考基因组序列，获得了超过2000万个SNP。是从其中选择出来的各个品系中共有的48个SNP位点并对这48个SNP位点在鲤鱼种质鉴定中的作用进行了研究。

如图1、图2和图3所示，本发明提供用于鲤鱼种质鉴定的SNP标记组合，所述SNP标记组合包括：碱基序列如SEQ ID NO：1～29所示的核苷酸序列。

在上述的方案中，作为优选，所述SNP标记组合还包括：碱基序列如SEQ ID NO：30～37所示的核苷酸序列。

在上述的方案中，作为优选，所述SNP标记组合还包括：碱基序列如SEQ ID NO：38～44所示的核苷酸序列。

在以上方案中，所述SNP标记组合还包括：碱基序列如SEQ IDNO：44～48所示的核苷酸序列。

本发明还提供一种用于鲤鱼种质鉴定的方法，包括如下步骤：

步骤一、获取待鉴定种质鲤鱼的基因组DNA和已知种质候选亲本鲤鱼的基因组DNA；

步骤二、利用微流体系统检测待鉴定种质鲤鱼的基因组DNA和候选亲本的基因组DNA，获得每条鲤鱼的多个SNP标记位点的基因型，其中，所述多个SNP标记位点包括碱基序列如SEQ ID NO：1～29所示的核苷酸序列，在微流体系统检测中，利用特定的探针序列组一一对应检测所述多个SNP标记位点的基因型，每组探针序列组均由等位基因1特异探针、等位基因2特异探针、和位点特异探针组成，检测时，等位基因1特异探针、等位基因2特异探针分别和位点特异探针各自组成一对引物，以用于分别检测SNP位点处两个等位基因的基因型，SEQ ID NO：1～29所示的核苷酸序列对应的探针序列组的碱基序列依次各自分别为如SEQ ID NO：49～135所示的核苷酸序列；以及，

步骤三、利用生物信息学软件根据孟德尔遗传规律分析步骤二中得到的每条鲤鱼的多个SNP标记位点的基因型的结果，判断出待鉴定种质鲤鱼与已知种质候选亲本鲤鱼中的哪条鲤鱼有亲缘关系，以确定待鉴定种质鲤鱼的种质。

在上述方案中，作为优选，所述步骤二中，所述多个SNP标记位点还包括：碱基序列如SEQ ID NO：30～37所示的核苷酸序列，用于检测所述如SEQID NO：30～37所示的核苷酸序列的基因型的对应的探针序列组的碱基序列依次各自分别为如SEQ ID NO：136～159所示的核苷酸序列。

在上述方案中，作为优选，所述步骤二中，所述多个SNP标记位点还包括：碱基序列如SEQ ID NO：38～44所示的核苷酸序列，用于检测所述如SEQID NO：38～44所示的核苷酸序列的基因型的对应的探针序列组的碱基序列依次各自分别为如SEQ ID NO：160～180所示的核苷酸序列。

在上述方案中，作为优选，所述步骤二中，所述多个SNP标记位点还包括：碱基序列如SEQ ID NO：44～48所示的核苷酸序列，用于检测所述如SEQID NO：44～48所示的核苷酸序列的基因型的对应的探针序列组的碱基序列依次各自分别为如8EQ ID NO：181～192所示的核苷酸序列。

在上述方案中，作为优选，所述步骤一中，所述基因组DNA从该鲤鱼的鳍条、肌肉、或血液得到。

本发明还提供所述的SNP标记组合用于鲤鱼种质鉴定中的用途。

本发明采用的一个核心技术为：“48 SNP array”

使用简要介绍

首先，提取鲤鱼基因组DNA。然后用本发明设计的“48 SNP assay”对其进行基因型分型，最后根据分型结果利用软件对样本进行亲缘关系分析。具体分型操作采用Fluidigm公司的微流体系统(48.48 SNPtype^TMGenotyping)。亲缘关系分析使用CERVUS 3.0.7软件，该软件采用似然法推断亲缘关系，其原理是对候选亲本按照LOD值(亲子鉴定似然比的对数转换值：logL)从大到小排列，并且计算出最可能亲本与第二可能亲本LOD值的差值(DELTA)。LOD值越大是真实亲本的可能性越高，DELTA值越大可靠性越高。

1、样本准备

提取样本基因组DNA(对DNA质量要求较高，适宜浓度为60-100ng/μl)，取样可以是活鱼鳍条、肌肉、血液(在不影响鱼存活的情况下)。

2、基因型分型(基因型分型过程参考48.48 SNPtype^TMGenotyping Quick Reference，PN 100-3910，Rev.A1或Fluidigm SNPGenotyping User Guide，PN 68000098.)

利用设计的“48SNP array”(见表1和表2)对基因组DNA进行SNP分型，操作平台为Fluidigm公司的微流体系统。具体操作如下：

2.1、初始化(prime)。通过运行IFC ControllerMX仪器上的Prime(124x)脚本将control line fluid注入到芯片(48.48Dynamic Array^TM IFC芯片)中。

2.2、转移(transfer)。分别取4μl探针(Assay)和5μl样本(Sample)对应地加入到芯片的探针孔(Assay Inlets)和样本孔(Sample Inlets)。(Assay与Sample的配制参考48.48 SNPtype^TM Genotyping QuickReference，PN 100-3910，Rev.A1或Fluidigm SNP Genotyping User Guide，PN68000098)一个芯片的探针孔中加入一组可检测一个SNP位点的探针序列组。

2.3、上样(load)。运行IFC Controller MX仪器上的Load Mix(124x)脚本，将Assay与Sample上样到芯片中。

2.4、热循环(cycle)。将已上样的芯片转移到Biomark^TM HD上，通过运行SNP type 48X48 Fast v1.pcl.实现热循环(thermal cycling)

芯片(PCR)反应条件为：先保持98度，40s；96度，10s；64度，15s；72度，20s；98度，40s；96度，10s；62度，15s；72度，20s；98度，40s；96度，10s；60度，15s；72度，20s；98度，40s；96度，10s；59度，15s；72度，20s；然后，以下4步循环33次：98度，40s；96度，10s；58度，15s；72度，20s；最终25度恒温。

2.5、读取数据(read)。将芯片转移到EP1 Reader上进行荧光检测，此时芯片上的数据(IFC barcode and type)被存储到芯片运行文件中。

2.6、分析(analysis)。应用Fluidigm Genotyping Analysis Software查看并分析彩色等位基因图谱和集群图。

3、亲缘关系分析

应用CERVUS3.0.7软件进行亲缘关系分析。

实施例1

选取鲤鱼的代表品种黄河鲤对本发明的可行性及其在种质鉴定中的准确性做了验证，其中黄河鲤样本包括子代166尾，候选父本和候选母本各10尾，样本基因组DNA取自黄河鲤血液。

利用上述的“48SNP array”进行实验，实验结果如下：

1、SNP分型结果

1.1、基因型分型检出率(Call rate)

子代的call rate平均数是96.86％，最低和最高值分别是79.19％和100％，其中10个个体低于90％，如图1a所示，图1a中A区域表示子代call rate小于90％的个体所占的比例，B区域表示子代call rate处于90％-95％之间的个体所占的比例，C区域表示子代call rate处于95％-100％之间的个体所占的比例。所有候选亲本的call rate均高于90％，平均值为98.17％，最低和最高值分别是92.63％和100％，如图1b所示。研究发现，基因型分型检出率和分型精确度密切相关，要得到可靠的母(父)子推断、双亲推断，最低检出率分别是80％和90％(Cooper，T.A.，G.R.Wiggans，et al.(2013).″Shortcommunication：Relationship of call rate and accuracy of single nucleotidepolymorphism genotypes in dairy cattle.″Journal of Dairy Science 96(5)：3336-3339.)。由此可见，该芯片的分型精确度达到双亲推断的要求。

1.2、最小等位基因频率(MAF)

应用PLINK中的“-freq”参数，对所得的SNP分型结果(包括166个子代、20个候选亲本)做最小等位基因频率分析。48个SNP位点中，超过85％的SNP位点的最小等位基因频率大于0.1，只有4个SNP位点的最小等位基因频率小于0.05，如图2所示。由此可见，该48个位点确实是多态性位点，可以应用于鲤鱼的家系鉴定。

1.3、遗传多态性

利用CERVUS3.0.7计算SNP分型结果的遗传多态性，例如，等位基因频率(allele frequency)、期望杂合度(expected heterozygosity(HExp))、多态信息含量(polymorphic information content(PIC))、排除概率(combinednon-exclusion probability(NE-P))，哈代温伯格平衡(Hardy-Weinbergequilibrium(HWE))，无效等位基因(null allele)等，见表3。PIC的平均值为0.2810，其中有4个SNP位点的PIC小于0.1，如图3所示。由图3可见，48个SNP位点的遗传多样性比较低，这主要取决于SNP位点的特性。1个SNP位点包含两个等位基因，然而一个微卫星位点包含多个等位基因，所以，SNP位点具有较低的多态信息含量。

2、种质鉴定结果

实验结果表明，本专利推断出的子代的最可能双亲中，134个个体的LOD值和DELTA值均大于0，且亲缘关系极显著(置信度超过95％)，表明这134(81％)个个体的推断双亲为可靠双亲；32(19％)个个体的LOD值小于0，DELTA值等于0，表明这32个个体的推断双亲的可靠性较低。另外，在DELTA值大于0的134个个体的推断双亲中，128个均与真实双亲一致；DELTA值等于0的32个个体中，17个个体的推断双亲与真实双亲一致。所以，在不考虑置信度的情况下，双亲推断的成功率可以达到87％。具体实验数据见表4。研究表明，亲本鉴定的精确度受多重因子的影响，例如，位点个数、多态信息含量、候选亲本取样比例，分型精确度(Ma，Q.Q.，H.Y.Ma，et al.(2013).″Parentage assignment of the mud crab(Scylla paramamosain)based onmicrosatellite markers.″Biochemical Systematics and Ecology 49：62-68.；Clarke，S.M.，H.M.Henry，et al.(2014).″A High Throughput Single NucleotidePolymorphism Multiplex Assay for Parentage Assignment in New ZealandSheep.″Plos One 9(4).)。在本实施例中，位点个数、多态信息含量、分型精确度可能是导致9％子代亲本鉴定错误的主要原因。研究还发现，即使在等位基因频率相等的情况下，要达到相同的亲缘关系排除概率，所需包含两个等位基因的位点的个数是包含三(四)个等位基因的位点的个数的3.23(4.38)倍(Vignal，A.，D.Milan，et al.(2002).″A review on SNP and other types ofmolecular markers and their use in animal genetics.″Genetics Selection Evolution34(3)：275-305.)。应用最大似然法(允许存在分型错误)鉴定真实亲本所需位点个数还取决于候选亲本，尤其在候选亲本间存在亲缘关系的情况下(Hill，W.G.，B.A.Salisbury，et al.(2008).″Parentage identification using single nucleotidepolymorphism genotypes：Application to product tracing.″Journal of AnimalScience 86(10)：2508-2517.)。综合以上，随着位点数的增加，亲本鉴定的成功率会增加。

表1 “48SNP array”中48个SNP位点的具体信息

表2 48个SNP位点的探针序列组

表3 48个SNP位点的遗传多态性

^a n umber of alleles(等位基因数)，^b Number of genotypes(基因型数)，^c observed heterozygosity(实际杂合度)，^d expected heterozygosity(期望杂合度)，^e polymorphic information content(多态信息含量)，^fnon-exclusion probability(first parent)(排他概率(第一亲本))，^g non-exclusion probability(second parent)(排他概率(第二亲本))，^h non-exclusion probability(parent pair)(排他概率(亲本对))，ⁱ non-exclusionprobability(identity)(排他概率(同一性))，^j non-exclusion probability(sib identity)(排他概率(近亲同一性))，^k Hardy-Weinberg(哈代温伯格平衡)，^lnull allele frequency(无效等位基因)。

表4 亲缘关系鉴定结果

Confidence level(置信度)，Critical LOD(临界LOD)，Critical DELTA(临界DELTA)，Expectedassignment(期望配对)Correct assignment(正确配对)Percent of correct assignment(正确配对率)

实施例2

利用实施例1中的材料和数据，选用PIC大于0.3的29个SNP位点做家系鉴定，鉴定结果如表5所示。

表5 亲缘关系鉴定结果

实施例3

利用实施例1中的材料和数据，选用PIC大于0.2的37个SNP位点做家系鉴定，鉴定结果如表6所示。

表6 亲缘关系鉴定结果

实施例4

利用实施例1中的材料和数据，选用PIC大于0.1的44个SNP位点做家系鉴定，鉴定结果如表7所示。

表7 亲缘关系鉴定结果

研究表明，亲本鉴定的精确度受多重因子的影响，例如，位点个数、多态信息含量、候选亲本取样比例，分型精确度(Ma，Q.Q.，H.Y.Ma，et al.(2013).″Parentage assignment of the mud crab(Scylla paramamosain)based onmicrosatellite markers.″Biochemical Systematics and Ecology 49：62-68.；Clarke，S.M.，H.M.Henry，et al.(2014).″A High Throughput Single NucleotidePolymorphism Multiplex Assay for Parentage Assignment in New ZealandSheep.″Plos One 9(4).)。在实施例1中，位点个数、多态信息含量、分型精确度可能是导致9％子代亲本鉴定错误的主要原因。研究还发现，即使在等位基因频率相等的情况下，要达到相同的亲缘关系排除概率，所需包含两个等位基因的位点的个数是包含三(四)个等位基因的位点的个数的3.23(4.38)倍(Vignal，A.，D.Milan，et al.(2002).″A review on SNP and other types ofmolecular markers and their use in animal genetics.″Genetics Selection Evolution34(3)：275-305.)。应用最大似然法(允许存在分型错误)鉴定真实亲本所需位点个数还取决于候选亲本，尤其在候选亲本间存在亲缘关系的情况下(Hill，W.G.，B.A.Salisbury，et al.(2008).″Parentage identification using single nucleotidepolymorphism genotypes：Application to product tracing.″Journal of AnimalScience 86(10)：2508-2517.)。综合以上，随着位点数的增加，亲本鉴定的成功率会增加。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。