一种离子束注入诱变选育蛹虫草菌株的方法和所育菌株

摘要

本发明涉及一株蛹虫草菌株(Cordyceps militaris)，于2014年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9818。本发明还提供了所述菌株在液体发酵生产虫草素、蛹虫草菌丝体及固体培养生产虫草素中的应用以及一种离子束注入诱变选育蛹虫草菌株的方法。本发明所提供的蛹虫草菌株具有优异的虫草素生产性能，其虫草素产量比出发菌株提高8.85倍。

说明书

技术领域

本发明涉及食用菌培育领域，具体涉及一种离子束注入诱变选育 蛹虫草菌株的方法和所育菌株。

背景技术

蛹虫草(Cordyceps militaris)，又名北冬虫夏草，是我国传统的 重要食药用菌之一，也是卫生部批准的新资源食品，现在称为食品 新原料，允许作为食品直接食用。虫草素是蛹虫草生物活性成分中 最重要的一种，具有免疫调节、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、治疗白血 病等作用。虫草素价格昂贵，化学合成目前在实验室能够实现，但 是由于条件限制不能实现生产，所以目前市场上销售的虫草素主要 从蛹虫草培养物中提取分离得到，因此选育高产虫草素蛹虫草菌株 能够大大提高虫草素产量，对降低虫草素的价格以及扩大临床应用 具有重要意义。

离子束注入诱变技术应用于生物诱变育种领域起源于20世纪 80年代，起初主要用于选育水稻、小麦、玉米等农作物，后逐渐应 用到微生物菌株选育中，专利文献“低能N⁺注入诱变选育灵芝菌株 的方法及所选育的菌株”(专利号：ZL 201010550775.8)采用氮离子 束诱变选育灵芝，获得产量提高15.9％的菌株。专利文献“银耳菌 株离子束注入诱变选育方法及所育的一个银耳菌株”(专利号：ZL 201310228604.7)采用氮离子束诱变选育银耳菌株，得到产量提高 13.5％的菌株。虽然离子束注入诱变是本领域的一种已知的技术，已 经有文献报道采用离子束注入诱变选育真菌菌株，但是不同种类的 微生物对离子束注入诱变能量及剂量的承受能力不同，即使同一菌 种的不同菌株之间也仍然存在较大差异，因此对于每一个菌株都有 一个最佳诱变剂量范围，在此条件下菌株突变率最高，经过反复诱 变才能够获得更多的正突变菌株，这个最佳条件的获得对菌株诱变 选育意义重大，而且由于微生物菌株的个体差异是不能照搬应用的， 必须经过大量实验优化才能得到。

因此有必要找到一种适合特定蛹虫草出发菌株(蛹虫草菌株 CM-3)的氮离子束注入诱变最佳条件，从而筛选得到一种高产虫草 素及菌丝体的蛹虫草菌株。

发明内容

本发明的目的是提供蛹虫草菌株选育的新途径，从而获得高产虫 草素及菌丝体的蛹虫草菌株资源。

本发明提供了一种N⁺离子束注入诱变选育蛹虫草菌株的方法及 所育的一株生长速度快、菌丝体产量高且高产虫草素的蛹虫草菌株。

本发明首先提供一种离子束注入诱变选育蛹虫草菌株的方法， 包括以下步骤：

1)蛹虫草菌株离子束注入诱变前样品的处理方法优化：

本发明的发明人以北京市辐射中心微生物实验室保存的蛹虫草 菌株CM-3为出发菌株，进行氮离子束注入诱变。由于离子束注入 诱变是在真空状态下完成的，因此要保证注入前蛹虫草孢子存活率 最高才能保证注入诱变效果最佳。首先要研究合适的孢子培养时间， 保证孢子活力最强；其次研究合适的溶剂保护孢子在干燥时受到最 少的损伤，保证孢子的存活率最高；然后研究孢子悬液稀释浓度对 涂布单层菌膜的影响，保证涂布到金属培养皿上的孢子是单层的， 能够均匀的接受带电离子的注入；最后研究干燥时间对涂布的孢子 存活率的影响。通过对上述条件的优化找到样品制备的最优条件， 保证离子束注入诱变前样品的存活率最高。

在本发明中，所述蛹虫草菌株离子束注入诱变前样品的处理方 法为：蛹虫草孢子由液体培养获得，将固体菌种在25℃恒温条件下 以150r/min的转速摇床培养7d获得液体培养物，用200目细胞筛过 滤所述液体培养物得到孢子悬液，以液体培养基为稀释剂稀释100 倍获得浓度为3.6×10⁵个/mL的孢子悬液，吸取0.1mL所述稀释后的 孢子悬液涂布到金属培养皿上，无菌风吹干后在2-8h内做离子束注 入诱变；本发明的发明人通过大量实验发现经过此条件下能保证蛹 虫草孢子的存活率最高。

2)在真空度为10^-3Pa条件下，采用连续注入方式对金属培养皿 上的蛹虫草孢子进行N⁺离子束注入诱变，能量为30kev，剂量为 3×10¹⁴ions/cm²-6×10¹⁴ions/cm²，获得诱变后的蛹虫草孢子。

3)培养诱变后的蛹虫草孢子，通过平板初筛筛选得到菌丝生长 速度快、菌丝密度大、色素颜色深、菌落较规则等特征的蛹虫草菌 株；

4)将步骤3)筛选到的蛹虫草菌株进行液体发酵培养，然后采 用高效液相色谱法测定发酵液中虫草素含量，筛选得到正突变菌株；

5)将筛选得到的正突变菌株采用优化后的培养工艺液体培养， 然后恒温静置培养，得到虫草素产量高的蛹虫草发酵液。

本发明还提供了采用本发明的离子束注入诱变选育蛹虫草菌株 的方法选育的一株蛹虫草菌株(Cordyceps militaris)，其保藏号为 CGMCC No.9818，于2014年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。

蛹虫草菌株CGMCC No.9818的菌学特性：

本发明所提供的蛹虫草菌株具有优异的虫草素生产性能，其虫草 素产量比出发菌株提高8.85倍。菌株固体培养形态：固体PDA平板 上菌落生长旺盛，菌丝浓密，菌落背面颜色明显比出发菌株变深，菌 丝密度明显大于出发菌株，菌落背面颜色为橘红色，颜色比出发菌株 深。菌株液体培养形态：液体培养基中布满直径大小约为2-3mm的 白色菌丝球，液体透明澄清。显微镜观察形态：突变菌株无性阶段分 生孢子为球形，大小为2-4μm，萌发后为椭圆形及棒状，菌丝有少量 分枝。

本发明还提供了所述蛹虫草菌株CGMCC No.9818在液体发酵生 产虫草素及菌丝体中的应用。

其中，液体发酵培养基的组成成分包括：蔗糖10-30g/L，蛋白胨 10-30g/L，磷酸二氢钾0.5-2.0g/L，硫酸镁0.5-1.0g/L，pH自然；配 制时将各原料加热溶解，121℃，灭菌30min；

液体发酵的培养条件包括：首先在25-28℃的恒温条件下，以 150-180r/min的转速摇床培养5-7d，然后于25℃光照培养箱中静置培 养20-30d获得含虫草素的培养液，吸取培养液用0.22μm无菌滤膜过 滤后HPLC方法测定虫草素含量。

本发明还提供了所述蛹虫草菌株CGMCC No.9818在固体培养生 产虫草素中的应用。本发明所提供的方法还包括通过固体培养蛹虫草 菌株CGMCC No.9818生产核苷类物质，所述核苷类物质包括腺苷、 尿苷、鸟苷。

其中，固体培养基配方为：所述固体培养中所使用的固体培养基 由培养基质和营养液组成。

其中，培养基质选自燕麦、大米、大麦、小麦、小米和高粱中的 至少一种，优选为燕麦。

营养液的组成成分包括：葡萄糖5-30g/L，蛋白胨1-30g/L，酵母 粉1-10g/L，磷酸二氢钾0.5-2g/L，硫酸镁0.5-1.0g/L。

其中，相对于100g的培养基质，营养液的用量为120mL-140mL。

所述营养液的配制方法包括将各组分按比例混合并加热溶解于 蒸馏水中，在121℃，灭菌30min，pH值自然。

固体培养条件为：灭菌的固体培养基冷却后，接入液体种子液， 均匀的洒在固体培养基表面。20-25℃恒温避光培养，3-7d菌丝长满 培养基表面，在超净台内用无菌镊子将培养基上层的菌丝及米粒打散 成小颗粒，平铺在培养瓶中。放入18-25℃光照培养箱中培养，设定 白天为8h，温度为22-23℃，光照强度为1200lux，黑夜为16h，温 度为18-20℃，关闭光照，1-2天后菌丝变为橘色然后越来越深，最后 菌丝全部长满，再继续培养20-30d。将固体培养物取出50℃烘干后 粉碎。

本发明的有益效果：本发明所提供的离子束注入诱变选育蛹虫草 菌株的方法，得到了针对蛹虫草菌株的N⁺离子束注入诱变的最佳剂 量范围，以本发明所提供的方法诱变选育蛹虫草菌株，可以使得诱变 后的蛹虫草孢子保持较高的突变率，突变率可以达到15.1％-21.3％， 能够筛选得到更多高产虫草素的蛹虫草突变菌株，更大的开发了蛹虫 草菌株资源。

蛹虫草菌株(Cordyceps militaris)，其保藏号为CGMCC No.9818， 于2014年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生 物研究所，邮政编码：100101。

附图说明

图1为不同注入剂量对蛹虫草菌株存活率的影响

其中：横坐标数字1-14分别代表不同的离子束注入剂量，1-14 的注入剂量分别为：1×10¹²ions/cm²、5×10¹²ions/cm²、1×10¹³ions/cm²、 5×10¹³ions/cm²、1×10¹⁴ions/cm²、2×10¹⁴ions/cm²、3×10¹⁴ions/cm²、 4×10¹⁴ions/cm²、5×10¹⁴ions/cm²、6×10¹⁴ions/cm²、7×10¹⁴ions/cm²、 8×10¹⁴ions/cm²、9×10¹⁴ions/cm²、1×10¹⁵ions/cm²。

图2为离子束注入诱变蛹虫草菌株突变率

其中：横坐标数字1-14分别代表不同的离子束注入剂量，1-14 的注入剂量分别为：1×10¹²ions/cm²、5×10¹²ions/cm²、1×10¹³ions/cm²、 5×10¹³ions/cm²、1×10¹⁴ions/cm²、2×10¹⁴ions/cm²、3×10¹⁴ions/cm²、 4×10¹⁴ions/cm²、5×10¹⁴ions/cm²、6×10¹⁴ions/cm²、7×10¹⁴ions/cm²、 8×10¹⁴ions/cm²、9×10¹⁴ions/cm²、1×10¹⁵ions/cm²。

图3为虫草素HPLC色谱图

A为出发菌株，B为突变菌株。

图4为核苷类物质测定的HPLC色谱图

C为出发菌株，D为突变菌株。

具体实施方式

下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。

实施例1

本实施例用于说明本发明所提供的蛹虫草菌株的筛选过程。

1、菌种：

出发菌种：蛹虫草(Cordycepsmilitaris)编号：CM-3，北京市 辐射中心微生物实验室保存。

2、培养基及试剂：

PDA固体培养基：葡萄糖20g，磷酸二氢钾1g，土豆汁1000mL， pH自然，琼脂20g，121℃，灭菌30min。

液体培养基：葡萄糖30g，胰蛋白胨4g，酵母粉2g，磷酸二氢 钾1g，硫酸镁0.5g，pH自然，加热溶解，蒸馏水定容至1000mL， 121℃，灭菌30min。

试剂：葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁均为分析纯试剂，购自国 药集团北京化学试剂公司；虫草素为高效液相色谱纯级别，购自 Sigma公司；胰蛋白胨、酵母粉、琼脂均为生物培养基级别，购自 国药集团北京化学试剂公司；

3、蛹虫草离子束注入样品制备方法

(1)蛹虫草液体培养最佳时间的确定

将PDA固体培养基上的蛹虫草菌种用打孔器打成大小相同的接 种块，取5块接入到装有200mL液体培养基的500mL三角瓶中， 恒温摇床25℃培养，转速为150r/min，培养时间为7d。

(2)孢子悬液的制备方法

将蛹虫草菌悬液以4000r/min离心3min，此时菌丝体和少部分 孢子刚好沉淀，上清液中孢子悬浮，得到的孢子悬液孢子较多，但 会有少量菌丝体。采用200目细胞筛过滤，将孢子和菌丝体分离的 效果好，所得滤液中不含菌丝体，且孢子浓度较大，适合稀释后涂 布到金属培养皿中。

(3)蛹虫草孢子悬液稀释溶剂的选择

选择2％甘油、4％甘油、6％甘油、8％甘油、10％甘油、生理盐 水(0.9％NaCl)、无菌水、液体培养基总计8种溶剂稀释蛹虫草孢 子悬液，然后涂布到金属培养皿中，无菌风吹干。采用液体培养基 稀释的孢子存活率最高，因此选择液体培养基作为孢子液稀释溶剂。

(4)孢子悬液稀释浓度的选择

将细胞筛过滤得到的浓度为3.6×10⁷个/mL的孢子悬液分别稀释 10倍、100倍、1000倍、10000倍，然后分别涂布到玻璃培养皿中， 用倒置显微镜观察菌膜是否为单层，并涂布到金属培养皿上风干后 洗下，计算存活率。最终得到稀释100倍的孢子液最适合涂布金属 培养皿。

(5)干燥时间对孢子存活率的影响

分别研究涂布菌膜后干燥2h、4h、8h、12h、16h、20h对孢子 存活率的影响，结果发现干燥2-16h对孢子存活率影响不大。

离子束注入诱变前样品制备方法：蛹虫草液体培养7d，25℃摇 床转速150r/min，用200目细胞筛过滤后的孢子悬液，用液体培养 基稀释100倍至孢子浓度为3.6×10⁵个/mL，涂布到金属培养皿上， 超净台无菌风吹干，在2h后做离子束注入诱变，然后再用无菌水洗 脱涂布固体平板。

4、离子束注入诱变

离子束注入设备为北京师范大学核科学与技术学院(北京市辐 射中心)的离子注入机BNU400，注入能量最大为400kev，离子注 入机运行时靶室内真空度为10^-3Pa。离子注入机靶室部分安置在洁 净间内，靶室使用前用75％酒精擦拭干净，放入金属培养皿，进行 离子束注入。注入离子种类为N⁺离子，注入能量为30kev，注入剂 量为1×10¹²-1×10¹⁵ions/cm²，通过建立不同注入剂量与菌体存活率 的关系，分析找到蛹虫草离子束注入诱变最佳条件。

(1)离子束注入剂量对存活率的影响

在1×10¹²-1×10¹⁵ions/cm²注入剂量范围内选取1×10¹²ions/cm²、 5×10¹²ions/cm²、1×10¹³ions/cm²、5×10¹³ions/cm²、1×10¹⁴ions/cm²、 2×10¹⁴ions/cm²、3×10¹⁴ions/cm²、4×10¹⁴ions/cm²、5×10¹⁴ions/cm²、 6×10¹⁴ions/cm²、7×10¹⁴ions/cm²、8×10¹⁴ions/cm²、9×10¹⁴ions/cm²、 1×10¹⁵ions/cm²总计14个注入剂量诱变蛹虫草菌株。将离子束注入 后培养皿上菌膜用1mL无菌水洗掉，吸取放入无菌EP管中为诱变 后原液，并依次稀释10倍及100倍。将每个浓度梯度的菌液吸取 0.1mL均匀涂布到PDA平板上，每个样品3个平行实验。将涂布好 的平板置于25℃恒温培养箱中培养4d计数。以未经离子束注入样品 的菌落数作为空白对照。选取菌落数在30-300个之间的平板进行计 数，计算每个注入剂量下存活的菌落数，按照如下公式计算存活率：

存活率(％)＝离子束注入后存活菌落数/空白对照菌落数×100％

按照存活率计算方法得到注入剂量与菌株存活率之间的关系如 图1所示，未进行离子束注入的空白对照存活率作为100％。根据图 1数据可以得出，在剂量从0-2×10¹⁴ions/cm²时存活率由100％降为 最低，然后随着剂量的增加存活率逐渐上升后缓慢下降，逐渐趋近 于零，这是离子束注入诱变存活率“马鞍形”曲线，也是选择最佳注 入剂量的参考依据。

(2)蛹虫草菌株平板初筛方法

将离子束注入诱变后分离得到的蛹虫草单菌落挑取放入新的 PDA平板上培养，根据平板中单菌落生长的速度、菌落颜色、菌落 形态，对诱变后蛹虫草菌株进行固体平板初筛，根据蛹虫草菌株的 特点筛选标准为：菌落背面颜色为深橘红色或深橘黄色；菌落直径 较大且菌丝茂密；菌落为较规则的圆形；菌落为多个同心圆成放射 状；菌落有褶皱且菌落表面颜色为橘黄色。

(3)高效液相色谱(HPLC)法测定虫草素含量复筛

蛹虫草突变株发酵液获得：将初筛得到的平板菌种，用打孔器 打出大小相同的接种块，挑取5块放入液体培养基中，摇床180r/min， 25℃恒温培养7d。将液体培养的蛹虫草培养物混匀，吸取到EP管 中，8000r/min，离心3min，吸取上清液0.22μm无菌滤膜过滤，直 接放入2mL的液相样品瓶中，采用高效液相色谱法测定发酵液中虫 草素含量。

(4)不同注入剂量下蛹虫草菌株突变率

按照方法(3)中处理蛹虫草诱变后菌株，获得发酵液，采用 HPLC方法测定虫草素峰面积响应值，根据虫草素标准曲线方程计 算虫草素含量，与出发菌株相比，变化幅度大于10％者为突变菌株， 产量提高的为正突变菌株，产量降低的为负突变菌株，变化幅度小 于10％者视为未产生突变。每个注入剂量最少检测50个菌株，菌株 存活总数不足50的突变率不统计，以零计。根据以上标准统计每个 离子束注入剂量下的突变率，计算公式如下：

突变率(％)＝突变菌株数/检测总菌数×100％

按照上述公式计算突变率，其中1×10¹⁴ions/cm²、2×10¹⁴ions/cm²、8×10¹⁴ions/cm²、9×10¹⁴ions/cm²、1×10¹⁵ions/cm²总计5 个注入剂量由于菌株存活率低，存活总菌株数小于50个，因此这些 剂量下突变率不计算，图中显示为0，具体突变率结果如图2所示。 由图2数据可得出离子束注入剂量在3×10¹⁴ions/cm²-6×10¹⁴ions/cm² 剂量范围内突变率最高可以达到21.3％，且根据筛选结果测定数据 可知正突变菌株较多，因此选择这个剂量范围多次对蛹虫草菌株进 行诱变，筛选突变菌株。

5、虫草素含量的测定

(1)HPLC测定虫草素方法：

采用HPLC法测定，本方法经过发明人优化，具体参数：DAD 检测器，检测波长为260nm，色谱柱：XDB-C18，4.6×250mm，5μm， 流动相，甲醇：纯水＝15：85(v％：v％)，流速1mL/min，进样量 10μL，柱温箱温度为25℃。

(2)虫草素标准曲线的制作

虫草素标样配置浓度为500、250、125、62.5、31.25、0μg/mL， 根据虫草素浓度(x)与峰面积响应值(y)之间的线性关系，制作 标准曲线，得到方程为：y＝46.317x-20.774，R²＝0.9997，表明 0-500μg/mL浓度的虫草素线性关系良好，适合测定本研究中样品虫 草素含量。

6、突变菌株的获得与培养

根据离子束诱变选育蛹虫草菌株条件优化实验得到，最佳诱变 剂量为3×10¹⁴ions/cm²-6×10¹⁴ions/cm²范围内，在此条件下多次诱变 筛选菌株，最终得到正突变菌株1株，于2014年10月22日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC  No.9818。

将突变菌株与出发菌株在完全相同的条件下进行液体发酵培 养，培养基配方及培养条件为：蔗糖30g/L，蛋白胨30g/L，磷酸二 氢钾1.0g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然，加热溶解，121℃，灭菌30min， 250mL三角瓶装液体培养基100mL，摇床25℃恒温培养，转速为 150r/min，培养时间为7d。然后于25℃光照培养箱中静置培养30d。 将蛹虫草培养液吸取到EP管中，8000r/min，离心3min，无菌注射 器吸取上清液，0.22μm无菌滤膜过滤，滤液直接放入高效液相色谱 仪(HPLC)的样品瓶中，然后HPLC方法测定虫草素含量。剩余的 液体培养物8000r/min，离心5min，将菌丝体与发酵液分离，发酵液 倒出，菌丝体放入培养皿中50℃烘干至恒重，称重计算菌丝体干重。

按照虫草素测定方法进行测定，得到出发菌株与突变菌株虫草 素HPLC图谱如图3，A为出发菌株，B为突变菌株，图中11.230min 保留峰为虫草素，由图可以直观得出突变菌株虫草素含量大大高于 出发菌株。将峰面积代入标准曲线方程计算得到虫草素含量结果见 表1。

表1蛹虫草出发菌株与突变菌株虫草素含量

菌株名称 虫草素浓度(μg/mL) 菌丝体干重(g/100mL) 说明 CM-3 151.03 1.21 出发菌株 CGMCC No.9818 1487.83 1.64 正突变菌株

7、突变菌株的稳定性

对筛选得到的上述正突变菌株进行传代稳定性实验，以转接1 次为传代1次计算，总计传代8次，每次采用相同的液体发酵培养 条件，采用相同的样品处理方法和虫草素含量测定方法，各代之间 虫草素产量无显著性差异(P>0.05)，突变菌株虫草素产量比出发菌 株提高8.85倍，该蛹虫草菌株保存于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心。

实施例2

1、蛹虫草菌株的固体培养

蛹虫草菌株固体培养采用液体种子，种子液的制备方法如下： 采用固体平板菌种，用打孔器打成大小相同的接种块，每瓶接种5 块，250mL三角瓶装100mL种子液培养基，配方如下，放入摇床中 25℃恒温培养，转速为150r/min，培养时间为5d。

蛹虫草菌株种子液培养基配方为：葡萄糖30g，胰蛋白胨4g， 酵母粉2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，pH自然，加热溶解，蒸 馏水定容至1000mL，121℃，灭菌30min。

蛹虫草固体培养基配方为：燕麦(也可用大米、大麦、小麦、 小米、高粱等)60g，加入80mL营养液，121℃，灭菌30min。

营养液配方为：葡萄糖20g，蛋白胨15g，酵母粉5g，磷酸二氢 钾1.5g，硫酸镁1.0g，pH自然，加热溶解，蒸馏水定容至1000mL， 121℃，灭菌30min。

灭菌的固体培养基冷却后，接入5mL种子液，均匀的洒在固体 培养基表面。25℃恒温避光培养，5d菌丝长满培养基表面，在超净 台内用无菌镊子将培养基上层的菌丝及米粒打散成小颗粒，平铺在 培养瓶中。放入25℃光照培养箱中培养，设定白天为8h，温度为 22℃，光照强度为1200lux，黑夜为16h，温度为20℃，关闭光照， 1天后菌丝逐渐转黄变为橘色，黄色然后越来越深，最后菌丝全部长 满，再继续培养25d。将固体培养物取出50℃烘干后粉碎备用。

2、蛹虫草菌株固体培养物中核苷类物质含量的测定

(1)样品处理方法

分别准确称量蛹虫草固体培养物粉末1.0g，加入20mL超纯水， 放入磨口三角瓶中，连接回流冷凝装置，沸水浴回流提取1h，将提 取液8000r/min离心5min，取上清液补超纯水至20mL，0.22μm无 菌滤膜过滤待测。

(2)核苷类物质测定方法

标准曲线的制作：分别准确称取虫草素、腺苷、尿苷、鸟苷及 胸苷标样，梯度稀释得到不同浓度标准溶液，腺苷、尿苷、鸟苷及 胸苷均为：0、5、10、20、40、80、100μg/mL，虫草素为：0、31.25、 62.5、125、250、500μg/mL，采用高效液相色谱法(HPLC)测定核 苷类物质的含量，根据标样浓度与峰面积响应值制作标准曲线。

HPLC测定条件：DAD检测器；检测波长为260nm；色谱柱： XDB-C18，4.6×250mm，5μm；流动相：甲醇：纯水＝15：85(体积 比)；流速1mL/min；进样量10μL；柱温箱温度为25℃。

(3)核苷类物质含量

根据尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷、虫草素浓度与峰面积响应值之 间的关系，得到标准曲线方程分别为：y＝30.941x-16.477，R²＝0.9999； y＝28.704x+2.5897，R²＝0.9999；y＝31.122x–24.159，R²＝0.9997； y＝43.035x-42.977，R²＝0.9997；y＝46.317x-20.774，R²＝0.9997。这 5种核苷类物质在测定的浓度范围内峰面积响应值与浓度线性关系 良好，说明该方法适合测定本实验样品。通过上述HPLC法测定的 固体培养物中核苷类物质含量的色谱图如图4所示，其中图C为出 发菌株CM-3，图D为正突变菌株CGMCC No.9818。其中尿苷保留 时间为3.311min，鸟苷保留时间为4.398min，腺苷保留时间为 8.549min，虫草素保留时间为11.230min，胸苷未检测到，图中的结 果显示正突变菌株核苷类物质的含量远远高于出发菌株。将测定的 样品峰面积值代入标准曲线方程，计算得到样品浓度，折算后得到 蛹虫草固体培养物中核苷类物质含量，结果如表2所示(表2中单 位为μg/g)。

表2蛹虫草固体培养物中核苷类物质含量

菌株名称 尿苷 鸟苷 胸苷 腺苷 虫草素 说明 CM-3 296.48 137.79 未检测到 151.24 408.15 出发菌株 CGMCC No.9818 2171.47 1462.03 未检测到 1032.22 2659.01 正突变菌株

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了 详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这 对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。