一种植物总黄酮及其制备方法与应用

摘要

本发明属于中药领域，具体涉及一种植物总黄酮及其制备方法与应用。所述的植物总黄酮的制备方法，包含如下步骤：(1)通过将大蓟根上部分粉碎过筛，然后用乙醇溶液加热回流提取，提取液过滤，然后减压浓缩蒸干至膏状，得到大蓟乙醇粗提物；(2)大蓟乙醇粗提物采用石油醚脱脂，然后上大孔树脂，水洗脱至无色，然后用乙醇溶液洗脱，洗脱液减压浓缩蒸干，得到植物总黄酮；所述的植物总黄酮在体外能显著抑制肝癌细胞HepG2的增殖，而且能保护人肝细胞L02不受四氯化碳的损伤，可作为新型的护肝药物，用药途径简单，易操作。

说明书

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及一种植物总黄酮及其制备方法与应用。

背景技术

大蓟为菊科(Composite)管状花亚科菜蓟族(Cvnareae)蓟属(Cirsium Mill.) 植物C.japonicum DC.的干燥地上部分或根。菊科蓟属植物是广泛分布于北温 带的一个大属，全世界约有300种蓟属植物，我国约有50种，全国各地都产， 其中常用作药用植物的有10余种。大蓟是凉性植物，其味甘、苦，归经于心、 肝，常用作凉血止血药，并有祛疲痛，治吐血、尿血、衄血、血淋、血崩、肠 风、带下、肠痈、疔疮、痈疡肿毒、高血压等功效。

肝脏是人体最大的实质性器官，担负消化、解毒、分泌和生物合成功能， 其功能障碍直接影响人体健康,甚至危及生命。我国是肝病发生率较高的国家之 一，各种肝病严重危害着人们的身体健康，寻找和开发治疗肝病的有效药物是 目前国内外肝病领域研究中的热点。引起肝病发生的因素很多，主要有病毒、 酒精和化学物质三大因素，而肝细胞损伤是各型肝病共同的病理基础。其中， 在我国以肝炎病毒和化学物质导致的肝病居多。化学性肝损伤是由化学性肝毒 性物质所造成的肝损伤。这些化学物质和药物包括四氯化碳(CC1₄)、乙醇、半 乳糖胺、扑热息痛及抗结核药物等。它们能通过生成氧自由基和前致炎因子， 从诱导氧化应激和炎症反应，造成细胞膜和酶类破坏，进而引起肝细胞功能障 碍，导致肝细胞凋亡或坏死，进一步引起整个肝脏功能的障碍。化学性肝损伤 的起始靶部位都是质膜，质膜一经破坏就引起连锁反应,形成恶性循环降。在各 种化学性肝病中，CC1₄所致的肝损伤是最常见的。

近年来研究发现，天然药物在肝病治疗方面有良好的效果和巨大潜力。天 然药物治疗肝损伤作用主要为改善肝功能，降低转氨酶活性、降低血清总胆红 素；促进肝糖元合成，保护肝细胞，防止急慢性肝损伤造成的糖元合成障碍； 改善肝组织病理,对急性肝损伤能减轻细胞肿胀，防止细胞坏死、减少炎性细胞 浸润，对慢性肝损伤能减轻细胞肿胀，防止脂肪变性；抑制肝胶原纤维、网状 纤维增生，防止肝纤维化发生。天然药物抗肝损伤的作用机制主要为两方面： ①抗氧化和②减少炎症因子生成。多种天然药物被认为能清除自由基，阻止肝 细胞脂质过氧化，同时减少前炎症因子生成，抑制炎症反应，从而维持细胞膜 的正常结构，避免细胞的损害。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种植物总 黄酮的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的植物总黄酮。

本发明的再一目的在于提供上述植物总黄酮的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种植物总黄酮的制备方法，包含如下步骤：

(1)将大蓟根上部分粉碎过筛，然后用乙醇溶液加热回流提取，提取液过 滤，然后减压浓缩蒸干至膏状，得到大蓟乙醇粗提物；

(2)对步骤(1)制备得到的大蓟乙醇粗提物采用石油醚脱脂，然后上大 孔树脂，水洗脱至无色；然后用乙醇溶液洗脱，洗脱液减压浓缩蒸干，得到植 物总黄酮(CJF)；

步骤(1)中所述的过筛的目数优选为10～100目；

步骤(1)中所述的乙醇的体积分数优选为70％；

步骤(1)中所述的加热回流提取的温度优选为90～100℃；所述的加热回 流提取次数优选为2～4次；所述的加热回流提取每次提取的时间优选为2～4h；

步骤(1)中所述的加热回流提取的温度进一步优选为100℃微沸状态下； 所述的加热回流提取次数进一步优选为3次；所述的加热回流提取每次提取的 时间进一步优选为3h；

步骤(1)中所述的减压浓缩的温度为40～45℃；

步骤(1)中所述的减压浓缩的温度优选为40℃；

步骤(2)中所述的石油醚脱脂的具体方法为：大蓟乙醇粗提物用石油醚萃 取至基本无颜色为止；所述的石油醚与大蓟乙醇粗提物的体积比优选为1:1；

步骤(2)中所述的大孔树脂优选为大孔树脂AB-8；

步骤(2)中所述的乙醇的体积分数优选为50％；

步骤(2)中所述的减压浓缩的温度优选为40～45℃；

步骤(2)中所述的减压浓缩的温度优选为40℃；

一种植物总黄酮，通过上述制备方法制备得到；

所述的植物总黄酮具有抗肿瘤作用，可以应用于制备抗肿瘤药物；

所述的植物总黄酮具有护肝作用，可以应用于制备护肝药物；

一种抗肿瘤药物，含有上述植物总黄酮(CJF)；

一种护肝药物，含有上述植物总黄酮(CJF)；

本发明的原理：植物来源的总黄酮(CJF)可以保护四氯化碳损伤的肝细胞， 减少化学毒物对肝细胞的生长。本发明发现和确证CJF具有显著的护肝活性， 且CJF的使用剂量低，在同样剂量下的毒副作用也较低。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明首次发现CJF在体外能够保护L02细胞不受四氯化碳损伤。

(2)CJF在体外能明显抑制肝癌细胞HepG2的增殖，同阳性对照效果相当。

(3)CJF的用药剂量比较低，而且在有效用药剂量范围内毒性较低。

(4)CJF为黄酮类化合物。

附图说明

图1是CJF对HepG2细胞增殖的抑制效果图，其中，5-F：五-氟尿嘧啶。

图2是CJF对四氯化碳诱导的L02细胞的保护作用图，其中，**：与control 组比较，P<0.01；***：与control组比较，P<0.001。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方 式不限于此。

实施例中，人正常肝细胞L02、人肝癌细胞HepG2购自中科院上海生命科 学研究院细胞资源中心；大蓟根上部分采自河南。

CJF从大蓟根上部分中制备得到；

实施例1 从大蓟根上部分中制备得到CJF

(1)将购买的大蓟根上部分粉碎后过20目筛，称取100g，用体积分数为 70％的乙醇溶液在100℃微沸状态下加热回流提取3次，每次3h，合并提取液， 用2层40目纱布过滤，然后用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩蒸干至膏状，得到 大蓟乙醇粗提物，黄酮含量为4.33mg/g；

(2)对步骤(1)制备得到的大蓟乙醇粗提物采用等体积石油醚脱脂，萃 取至基本无颜色为止；然后上大孔树脂AB-8，水洗脱至无色；再用体积分数为 50％的乙醇溶液洗脱，洗脱液用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩蒸干，即制得植 物总黄酮(CJF)；测得其黄酮含量为203.33mg/g。

实施例2 从大蓟根上部分中制备得到CJF

(1)将购买的大蓟根上部分粉碎后过10目筛，称取100g，用体积分数为 70％的乙醇溶液在90℃条件下加热回流提取4次，每次2h，合并提取液，用2 层40目纱布过滤，然后用旋转蒸发仪在45℃下减压浓缩蒸干至膏状，得到大蓟 乙醇粗提物，黄酮含量为4.05mg/g；

(2)对步骤(1)制备得到的大蓟乙醇粗提物采用等体积石油醚脱脂，萃 取至基本无颜色为止；然后上大孔树脂AB-8，水洗脱至无色；再用体积分数为 50％的乙醇溶液洗脱，洗脱液用旋转蒸发仪在45℃下减压浓缩蒸干，即制得植 物总黄酮(CJF)；测得其黄酮含量为203.33mg/g。

实施例3 从大蓟根上部分中制备得到CJF

(1)将购买的大蓟根上部分粉碎后过100目筛，称取100g，用体积分数 为70％的乙醇溶液在100℃微沸状态下加热回流提取3次，每次4h，合并提取 液，用2层40目纱布过滤，然后用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩蒸干至膏状， 得到大蓟乙醇粗提物，黄酮含量为4.17mg/g；

(2)对步骤(1)制备得到的大蓟乙醇粗提物采用等体积石油醚脱脂，萃 取至基本无颜色为止；然后上大孔树脂AB-8，水洗脱至无色；再用体积分数为 50％的乙醇溶液洗脱，洗脱液用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩蒸干，即制得植 物总黄酮(CJF)；测得其黄酮含量为203.33mg/g。

实施例4 MTT法检测CJF对肝癌细胞HepG2增殖的影响

将HepG2细胞以1×10⁵个/mL浓度接种于96孔细胞培养板(100μL/孔)，置 37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养；待孔板中的细胞完全贴壁后，加入含有不同 终浓度(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL)CJF(实施 例1制备)的细胞培养液100μL，同时设细胞对照组，即加入与样品液等量的 完全培养液；阳性对照组，加与样品同浓度梯度同体积的五-氟尿嘧啶作为阳性 对照，每个浓度设6个平行。在37℃，5％CO₂培养箱中继续培养，24h后取出， 倒置显微镜观察细胞形态的变化。用1mL注射器小心地吸弃96孔板中的培养 液，用不含钙、镁离子的PBS洗板2次，然后每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL (需关灯操作，MTT见光易分解)和DMEM完全培养液180μL，在37℃，5％CO₂培养箱中继续培养4h。小心吸弃孔内的细胞培养液，每孔加入150μL DMSO， 振荡10min；用酶联免疫检测仪在波长为490nm下测定其吸光度值。

结果见图1，CJF能够抑制HepG2细胞增殖，并呈现梯度依赖性。

实施例5 CJF对四氯化碳损伤的正常人肝细胞L02细胞的保护作用

取对数生长期的L02细胞，以1×10⁵个/mL浓度接种于96孔细胞培养板(100 μL/孔)，置37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养。待孔板中的细胞完全贴壁后，吸 弃上清，按如下分组要求给药，每组6个复孔。样品组：加入含有不同终浓度 (12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)CJF(实施例1 制备)的细胞培养液；正常细胞对照组和模型组(control组)：加入与样品液等 量的培养液；阳性对照组：加入与样品组相同浓度梯度的水飞蓟素。6h后除正 常细胞对照组加入不含CCl₄的100μL培养液，其余各孔中都加100μL含CCl₄(10 mmol/L)的培养液。37℃，饱和湿度，5％的CO₂恒温培养箱中培养24h后，倒 置显微镜观察细胞形态的变化。并小心地吸弃96孔板中的培养液，用不含钙、 镁离子的PBS洗板2次，然后每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL(需关灯操作， MTT见光易分解)和DMEM完全培养液180μL，在37℃，5％CO₂培养箱中继续 培养4h。小心吸弃孔内的细胞培养液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min。 用酶联免疫检测仪在波长为490nm下测定其吸光度值。

结果见图2，与模型组对比，样品组细胞存活率显著增大，并呈现浓度依赖 性，且细胞存活率与阳性对照相当。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、 替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。