幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测试剂盒

摘要

本发明涉及基因检测试剂盒，尤其涉及一种幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测试剂盒，所述试剂盒包括：用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测的核酸膜条和PCR反应液；所述PCR反应液包括：PCR反应液Ⅰ、PCR反应液Ⅱ、PCR反应液Ⅲ和PCR反应液Ⅳ；所述PCR反应液还分别含有内控引物1对。本发明的幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测试剂盒能在一次试验中，区分HP的2个分型，并检测与5个治疗药物耐药相关的9个热点突变位点的15种突变类型，用VacA基因和CagA基因进行分型，为病情的判断提供参考依据；耐药突变检测的突变类型更多更全面，可以快速、全面地评价患者感染的HP发生基因耐药的情况。

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测试剂盒，尤其涉及一种幽门螺旋杆菌分型与耐药突变 基因检测试剂盒。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori，简称HP)，由年巴里·马歇尔(Barry J. Marshall)和罗宾·沃伦(J.Robin Warren)于1983年首次从胃炎患者的胃黏膜中 分离得到。研究显示由HP引起的炎症可导致萎缩性胃炎、肠上皮化生、不典型 增生，最终演变为胃腺癌。

HP的全基因序列已经测出，其中尿素酶基因有四个开放性读框，分别是 UreA、UreB、UreC和UreD。UreA和UreB编码的多肽与尿素酶结构的两个亚 单位结构相当。幽门螺杆菌的尿素酶极为丰富，约含菌体蛋白的15％，活性相 当于变形杆菌的400倍。尿素酶催化尿素水解形成“氨云”保护细菌在高酸环境下 生存。

HP含有VacA和CagA两种基因，分别编码空泡毒素和细胞毒素相关蛋白， 根据这两种基因的表达情况，又将HP菌株分成两种主要类型：I型和II型。I 型含有CagA和VacA基因并表达其中一种或两种蛋白，即VacA基因中间区域 型M1、M2与信号序列型Sl、S2的组合(S1/M1、S1/M2、S2/Ml、S2/M2)需 与CagA基因同时存在，I型与胃疾病密切相关。II型不含CagA基因，不表达 两种蛋白，其毒性较弱，感染后一般无明显临床症状。

根据第四次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告，检测Hp感染的方法有侵 入性和非侵入性两类。侵入性方法依赖胃镜活检，包括快速尿素酶试验(RUT)、 胃黏膜直接涂片染色镜检、胃黏膜组织切片染色镜检、细菌培养、基因检测方 法。而非侵入性检测方法不依赖内镜检查，包括13C或14C-尿素呼气试验 (UBT)、粪便Hp抗原(HpSA)检测(依检测抗体可分为单抗和多抗两类) 等。以上的检测方法仅限于检出是否有HP感染，均未对HP进行分型检测。

根据第四次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告和文献数据筛选出5个常用 于治疗的抗生素(克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林、氟喹诺酮类、四环素)。根据 查找的文献资料总结出上述抗生素耐药基因和耐药位点如表1。

表1各治疗药物耐药突变位点

治疗药物 相关基因 突变位点 甲硝唑 rdxA G565T、G616A(核苷酸位点) 克拉霉素 23S rRNA A2142C/G、A2143G(核苷酸位点) 阿莫西林 PBP1 Thr556Ser、Asn562Tyr(氨基酸位点) 喹诺酮类 gyrA Asn87→Lys、Asp91→Gly/Asn/Tyr(氨基酸位点) 四环素 16S rRNA AGA926～928TTC、AGA926～928TGA、AGA926～928GTA(核苷酸位点)

1、现有产品和相关专利如下：

目前，国内市面上暂无幽门螺旋杆菌分型和耐药突变同时检测的产品，仅 有1个与核酸检测相关的产品(幽门螺旋杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针 法)，生产厂家为中山大学达安基因股份有限公司)。本发明的产品能在一次试 验中同时实现分型和耐药同时检测，产品所用的技术平台为PCR-反向点杂交。 与本发明申请发明专利相关的已经公开或授权的部分专利见表2。

表2与本发明申请相关的已经公开或者有权的部分专利

2、现有产品或技术的缺点

从表2中可以看出，现有技术不能实现一次试验即可进行分型和耐药突变 检测，且只能进行克拉霉素耐药突变检测，由于检测的耐药突变类型不够全面， 会给临床指导造成困扰。现有用于幽门螺旋杆菌分型和耐药突变检测的方法主 要有：PCR-荧光探针法、基因芯片(PCR-反向点杂交)等。PCR-荧光探针法， 该方法操作简便，可检测变异发生率低于10％的耐药变异。由于受到荧光报告 基团及仪器检测通道的限制，1管PCR mix可检测的突变类型有限，需多管PCR mix才能满足如此多突变类型的检测，成本高。目前还没有一种全面、快速地进 行幽门螺旋杆菌基因分型和耐药突变检测的产品和方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种能一次试验区分幽门螺旋杆菌的2 种基因型并检测与药物耐药相关的8个热点突变位点的15种突变类型的幽门螺 旋杆菌分型与耐药突变基因检测试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种用于幽门螺旋杆 菌分型与耐药突变基因检测的试剂盒，所述试剂盒包括：用于幽门螺旋杆菌分 型与耐药突变基因检测的核酸膜条和PCR反应液；所述PCR反应液包括：PCR 反应液Ⅰ、PCR反应液Ⅱ、PCR反应液Ⅲ和PCR反应液Ⅳ；

所述PCR反应液Ⅰ包括分型扩增引物：

引物VacAS-F2：SEQ ID NO：1；

引物VacAS-R2：SEQ ID NO：2；

引物VacAM-F2：SEQ ID NO：3；

引物VacAM-R2：SEQ ID NO：4；

所述PCR反应液Ⅱ包括分型扩增引物：

引物UreA-F2：SEQ ID NO：5；

引物UreA-R2：SEQ ID NO：6；

引物CagA-F2：SEQ ID NO：7；

引物CagA-R2：SEQ ID NO：8；

所述PCR反应液Ⅲ包括耐药突变扩增引物：

引物16S-F2：SEQ ID NO：9；

引物16S-R2：SEQ ID NO：10；

引物rdxA-F2：SEQ ID NO：11；

引物rdxA-R2：SEQ ID NO：12；

引物PBP1-F2：SEQ ID NO：13；

引物PBP1-R2：SEQ ID NO：14；

所述PCR反应液Ⅳ包括耐药突变扩增引物：

引物23S-F2：SEQ ID NO：15；

引物23S-R2：SEQ ID NO：16；

引物gyra-F2：SEQ ID NO：17；

引物gyra-R2：SEQ ID NO：18；

所述PCR反应液Ⅰ、PCR反应液Ⅱ、PCR反应液Ⅲ和PCR反应液Ⅳ还分 别含有内控引物1对：

引物β-globin-F2：SEQ ID NO：19；

引物β-globin-R2：SEQ ID NO：20。

优选的，上述的用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测的试剂盒中， 所述核酸膜条包括用于幽门螺旋杆菌分型检测的分型膜条和用于幽门螺旋杆菌 耐药检测的耐药膜条；

所述分型膜条包括基底和固定于所述基底上的核酸探针，所述核酸探针包 括：

用于幽门螺旋杆菌分型检测的核酸探针，其碱基序列如：SEQ ID NO：21-26；

内参照核酸探针，其碱基序列如：SEQ ID NO：50；

所述耐药膜条包括基底和固定于所述基底上的核酸探针，所述核酸探针包 括：

用于幽门螺旋杆菌耐药突变检测的核酸探针，其碱基序列如：SEQ ID NO： 27-49；内参照核酸探针，其碱基序列如：SEQ ID NO：50。

优选的，上述的用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测的试剂盒中， 所述基底为尼龙膜。

优选的，上述的用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测的试剂盒中， 所述引物5’端标记生物素,所述探针3’端标记氨基。

本发明有益效果：本发明的幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测试剂盒 能在一次试验中，区分HP的2个分型，并检测与5个治疗药物耐药相关的9个 热点突变位点的15种突变类型，而PCR-荧光探针法，则受到荧光报告基团及 仪器检测通道的限制，1管PCR mix可检测的突变类型有限，需多管PCR mix 才能满足如此多突变类型同时检测。本发明用VacA基因和CagA基因进行分型， 为病情的判断提供参考依据；耐药突变检测的突变类型更多更全面，可以快速、 全面地评价患者感染的HP发生基因耐药的情况，为合理用药，制定个体化医疗 提供参考依据。

附图说明

图1为本发明具体实施方式中的用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检 测的试剂盒的分型膜条检测结果示意图；

图2为本发明具体实施方式中的用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检 测的试剂盒的耐药膜条检测结果示意图；

图3为本发明具体实施方式中的用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检 测的试剂盒的耐药膜条检测结果示意图；

图4为本发明具体实施方式中的用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检 测的试剂盒的耐药膜条检测结果示意图；

图5为本发明具体实施方式中的用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检 测的试剂盒的耐药膜条检测结果示意图；

图6为本发明具体实施方式中的用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检 测的试剂盒的耐药膜条检测结果示意图；

图7为本发明具体实施方式中的用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检 测的试剂盒的耐药膜条检测结果示意图；

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合 实施方式并配合附图详予说明。

本发明最关键的构思在于：本发明的幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检 测试剂盒能在一次试验中，准确区分HP的2种基因型的组合并检测与耐药相关 的9个热点突变位点的15种突变类型。

本发明将分型扩增引物和耐药突变扩增引物分别组成不同的PCR扩增体 系，按照从一重PCR到多重PCR组合的顺序进行组合优化，对于存在互相抑制 的两对引物再拆分到两个反应体系中，消除互相之间的抑制。主要优点是：一 是引物分为4管扩增可以消除引物间的互相抑制作用的影响，提高检测的有效 性；二是分为4管后每管中的引物对较少，减少引物间的互相竞争，提高引物 的扩增效率；三是分为4管扩增后分型和耐药检测的结果相对独立，应用中可 以自由选择做哪种检测，为应用提供方便。

实施例1本发明具体技术方案的实施

1、技术基础

1.1根据已知的HP基因组序列进行引物及扩增反应液的设计和实施。

其主要研究内容是：根据HP基因组中UreA、CagA、VacA基因的序列特 点，设计PCR引物以扩增获得用于分型检测的目的片段；根据HP基因组中23S  rRNA、16S rRNA、rdxA基因、PBP1基因、gyrA基因的序列特点，设计PCR 引物以扩增获得用于耐药检测的目的片段；此外，还设计IC内控，用于监测整 个实验过程。

PCR反应液分为4管，两管分型反应液(第一管VacA基因中间区域型引物 与信号序列型引物，第二管为UreA和CagA基因扩增引物)，两管耐药反应液 (第一管为23S rRNA、rdxA和PBP1基因扩增引物，第二管为16S rRNA和gyrA 基因扩增引物)，每一管反应液中均含有IC内控(β-globin)。

1.2本项目将开发的芯片建立在膜芯片的基础上

基因芯片由玻璃片或尼龙膜和固定在其上的探针阵列构成，二者基本原理 相似，玻璃芯片的制备工艺复杂，检测过程繁琐，尤其是信号检测需要激光扫 描仪，直接导致了其使用成本高昂，在市场特别是临床检测中不能得到有效的 推广，因此其研发方向主要针对科学研究机构；膜芯片的开发则具有制备相对 简单、操作简便、成本低廉等明显优势，十分有利于市场的推广，更能快速、 有效地实现研究成果的产业化。

1.3根据已知的HP基因组研究成果进行检测探针和基因芯片的设计和实施

其主要研究内容是：根据每一段分型检测扩增产物之间序列的差异，设计 特异的分型检测探针；根据每一段耐药突变检测产物各突变位点的序列差异， 设计野生型和突变型的特异检测探针。将分型检测探针按一定的排列方式固定 在尼龙膜上，制备成分型检测膜条；将各位点的野生型和突变型的检测探针按 一定的排列方式固定在尼龙膜上，制备成耐药突变检测膜条。

2、具体技术实施方案

2.1扩增引物的设计和筛选

在Genebank数据库中查找并下载UreA基因、CagA基因、VacA基因、23S rRNA、16S rRNA、PBP1基因、gyrA基因、rdxA基因的序列多条，用DNAStar 进行比对，找出每个靶标中同源性最高的序列，耐药检测则需确保检测位点在 序列以内，用primer premier5.0对各靶标同源性最高的序列设计引物，分型和耐 药突变扩增引物的Tm值相近；如此，分型引物和耐药突变引物可以在同一条件 下进行扩增。设计好的引物由Life Technologies公司合成。引物合成后由公司人 员核对序列，然后溶解稀释成所需浓度的引物溶液。通过大量试验筛选到能够 高效稳定扩增的分型扩增引物和耐药突变扩增引物。本发明引物的长度和位置 的改变会降低本试剂盒的灵敏度和重复性，引物的编号和序列见表3。

表3分型扩增引物和耐药突变扩增引物

2.2PCR扩增反应体系的确认

利用正交试验方法，通过大量实验对比优化，最终确定的PCR反应体系见 表4。

表4PCR扩增反应体系配方

注：扩增模板加样量为4μL，总反应体积为25μL。

上述分型扩增引物和耐药突变扩增引物分别组成不同的PCR扩增体系，按 照从一重PCR到多重PCR组合的顺序进行组合优化，对于存在互相抑制的两对 引物再拆分到两个反应体系中，消除互相之间的抑制。通过正交试验组合和大 量实验对比，最终确认按照4管PCR扩增是效率最高的。主要优点是：一是引 物分为4管扩增可以消除引物间的互相抑制作用的影响，提高检测的有效性； 二是分为4管后每管中的引物对较少，减少引物间的互相竞争，提高引物的扩 增效率；三是分为4管扩增后分型和耐药检测的结果相对独立，应用中可以自 由选择做哪种检测，为应用提供方便。

2.3PCR扩增反应条件的确定

经过大量试验的对比优化，最终确定的PCR扩增反应条件见表5。

表5PCR扩增反应条件

2.4探针和基因芯片的设计和实施

在Genebank数据库中查找并下载UreA基因、CagA基因、VacA基因(S1、 S2、M1、M2)的序列以及23S rRNA(A2142C/G、A2143G)、16S rRNA (AGA926～928TTC、AGA926～928TGA、AGA926～928GTA)、PBP1基因 (Thr556Ser、Asn562Tyr)、gyrA基因(Asn87→Lys、Asp91→Gly/Asn/Tyr)、rdxA 基因(G565T、G616A)检测位点野生型和突变型的序列。

根据VacA基因中间区域型M1、M2及信号序列型Sl、S2与CagA基因、 UreA基因序列间的差异，设计基因型特异性检测探针，本着减少漏检的原则， 每段PCR产物根据需求设计不同探针数量进行检测。

根据各检测位点野生型和突变型，以及检测位点侧翼序列的特点，设计各 检测位点野生型及突变型的特异检测探针。为了保证这些探针在同一温度下进 行杂交的特异性和灵敏度，探针设计时充分考虑序列的多态和二级结构的影响， 并要求所有的探针的Tm值差异不超过5℃。

设计好的探针由Life Technologies公司合成，并在每条探针的3’端进行氨基 修饰。探针合成后由公司人员核对序列，然后溶解稀释成所需浓度的引物溶液。 通过氨基与羧基的缩合反应将探针固定在尼龙膜上，制备成分型检测芯片和耐 药突变检测芯片。通过大量试验的优化和筛选，获得稳定、特异性强的分型和 耐药突变检测探针。此探针的长度和碱基组成会影响本试剂盒检测的特异性和 准确性，因此，探针序列是本发明的保护内容。各位点的探针编号和序列见表6。 分型检测芯片位点图见表7，耐药突变检测芯片位点图见表8。

表6探针序列和编号

注，所有探针的3’端进行氨基(-NH₂)修饰。上述分型探针中的同一型别 含多条探针，需要同一型别的探针同时对样本进行检测，可减少漏检的比例。 上述耐药位点野生型和突变型均设计了多条探针，经过试验优选后上引物组合 为最优组合。

表7分型检测芯片位点图

表8耐药突变检测芯片位点图

2.5杂交条件的确定

杂交温度对最后结果的判读影响很大，杂交温度偏低会导致PCR产物与膜 条上的探针非特异结合，从而有可能误判为阳性；杂交温度偏高会导致目的产 物与目的探针的结合效率下降，杂交信号强度减弱，从而有可能误判为阴性。 洗膜时间和显色时间的长短对杂交结果也会有类似的影响。通过一系列优化实 验，最终确定的杂交、洗膜和显色等条件如下：

2.5.1杂交

含取15mL塑料离心管，放入标有样品编号的分型和耐药检测芯片膜条(应 在膜条的一角用铅笔标记)，加入A液(2×SSC、0.1％SDS)6-7mL及分型和耐 药突变扩增PCR反应液中所有PCR产物，拧紧管盖，再回旋一圈稍拧松。将离 心管放入沸水浴中加热10分钟(确保杂交液液面完全位于沸水浴液面之下)， 取出拧紧盖子，放入杂交箱48℃杂交1.5小时。

取50mL塑料管，加入40mL B液(0.5×SSC、0.1％SDS)于杂交箱中进行 预热至48℃。

2.5.2洗膜

取出膜条，移至装有预热B液的50mL管中，于48℃轻摇洗涤15分钟(每 管40mL溶液，最多可同时洗涤4张膜)。

2.5.3显色

按A液：POD＝2000:1配制孵育液(单做两张膜只需4μLPOD母液，配制 成8mL使用液，做四张膜可用6μLPOD母液，配制成12mL使用液)，室温轻 摇浸泡30分钟，弃去POD溶液。用A液室温轻摇洗两次，每次5分钟。用C 液(0.1mol/L柠檬酸钠，pH5.0)室温洗膜1-2分钟，同时配制显色液(各成份 比例：19mL C液，1mL TMB，2μL 30％的H₂O₂)。将膜条浸泡于显色液中避光 显色15分钟即可观察结果。

3、本发明有益效果

目前，除本发明的幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测试剂盒可以实现 一次试验即可进行分型和耐药突变检测外，其它现有产品均不能进行分型检测， 只能进行耐药突变检测。而且，现有的检测耐药突变的产品中，检测的耐药突 变类型不够全面，其只进行克拉霉素耐药检测，给临床指导造成困扰。

本发明的幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测试剂盒能在一次试验中， 区分HP的2个分型并检测与5个治疗药物耐药相关的9个热点突变位点的15 种突变类型。而PCR-荧光探针法，则受到荧光报告基团及仪器检测通道的限制， 1管PCR mix可检测的突变类型有限，需多管PCR mix才能满足如此多突变类 型同时检测。本发明用VacA基因和CagA基因进行分型，为病情的判断提供参 考依据；耐药突变检测的突变类型更多更全面，可以快速、全面地评价患者感 染的HP发生基因耐药的情况，为合理用药，制定个体化医疗提供参考依据。

实施例2

本发明幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测试剂盒的使用

1、用途：在胃炎、胃溃疡、胃糜烂患者初治前或者复治前进行HP分型和 耐药突变基因检测，能够：

1.区分I型和II型，确定幽门螺旋杆菌的毒力强弱；

2.检测5个HP治疗药物9个热点突变位点的15种突变类型；

3.辅助确定个性化的临床诊疗方案，进行HP流行病学研究。

2、临床适应症背景：

幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori，简称HP)，由年巴里·马歇尔(Barry J. Marshall)和罗宾·沃伦(J.Robin Warren)于1983年首次从胃炎患者的胃黏膜中 分离得到。研究显示由HP引起的炎症可导致萎缩性胃炎、肠上皮化生、不典型 增生，最终演变为胃腺癌。

HP含有VacA和CagA两种基因，分别编码空泡毒素和细胞毒素相关蛋白， 根据这两种基因的表达情况，将HP菌株分成两种主要类型：I型和II型。I型 含有CagA和VacA基因并表达其中一种或两种蛋白，I型与胃疾病密切相关。 II型不含CagA基因，不表达两种蛋白，其毒性较弱，感染后一般无明显临床症 状。

根据第四次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告和文献数据筛选出5个常用 于治疗的抗生素：克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林、氟喹诺酮类、四环素并总结 出抗生素耐药基因和耐药位点。

3、检验原理

PCR和DNA反向点杂交。

设计特异的PCR引物用于分型和耐药突变目的基因片段的扩增，分型检测 扩增片段包含了各基因型间的保守差异位点，耐药突变检测扩增片段包含了所 要检测的耐药突变位点。通过PCR产物与设计的探针进行特异性杂交，根据膜 条特定位置显色(蓝色)与否来判断HP的基因型和耐药突变类型。

4、本发明试剂盒组成

4.1本发明试剂盒主要成份如表9。

表9本发明试剂盒主要成份

说明：试剂盒中不同批号的组分可以互换使用。

4.2自备试剂

A液：100mL 20×SSC，10mL 10％SDS加纯水定容至1000mL，常温保存。

B液：25mL 20×SSC，10mL 10％SDS加纯水定容至1000mL，常温保存。

C液：100mL 1M柠檬酸钠加纯水定容至1000mL，常温保存。

显色液：19mL C液加入1mL TMB和2μL 30％H2O2。

4.3储存条件及有效期

储存条件：试剂盒I置于-18℃以下保存；试剂盒II置于2～8℃保存。如果 打开包装各组分分开保存时，除了满足各自的温度保存条件之外，需特别注意 TMB应该避光保存。有效期：6个月

4.4适用仪器

PCR仪(黑马9600)

分子杂交箱(FinePCR Combi-H12)

注：PCR仪退火速率设置为3.0℃/s可能获得最佳的扩增效果。

5、样本要求、

本试剂盒样本来源为胃粘膜组织活检样本。

专业医师在胃窥镜下取可疑病变部位粘膜置入无菌玻璃管，密闭送检。标 本-18℃以下保存，保存期为12个月，应避免反复冻融。运输时需用冰壶或泡沫 箱加冰袋密封。

6、检验方法

1.核酸提取

取黏膜组织至1.5mL离心管中，加入5μL蛋白酶K和45μLHP提取液I， 上下颠倒混匀，低速离心数秒，将离心管置于56℃恒温裂解1h，直至组织块消 化完全；加入50μLHP提取液II充分混匀，100℃恒温处理10min；13000rpm离 心5min，备用。

阳性质控品和阴性质控品与待检样本的处理方式相同，并应与样本同步处 理。提取的HP DNA如不立即使用，必须置于-18℃以下保存。

2.PCR扩增

取出PCR反应液管I、II、III、IV各N管，稍事离心，在管盖上做好标记， 分别加入4μL已提取的待测样品DNA至PCR反应液管I、II、III、IV中。同时 应取PCR反应管分别加入阳性质控品和阴性质控品DNA，作为产品使用的质量 控制。

PCR按以下表10的条件进行扩增。

表10

3.杂交

取15mL塑料离心管，放入标有样本编号的膜条(HP分型膜条和HP耐药 膜条)(应在膜条的编号处用铅笔标记)，加入A液6-7mL，取相应样本编号的 PCR反应液I、II、III、IV扩增产物各25μL加到A液液面以下，拧紧管盖。将 离心管放入沸水浴中加热10分钟(确保杂交液液面完全位于沸水浴液面之下)， 取出离心管，放入杂交箱48℃杂交1.5小时。

取50mL塑料离心管，加入40mL B液于杂交箱或水浴箱中进行预热至48 ℃。

阳性质控品和阴性质控品同步处理。

4.洗膜

取出膜条移至装有预热B液的50mL管中，于48℃轻摇洗涤15分钟(每 管40mL B液最多可同时洗涤4张膜条)。按A液：POD＝2000：1配制孵育液 (单做2张膜条只需4μL POD配制成8mL孵育液，做4张膜条可用6μL POD 配制成12mL孵育液)，室温轻摇孵育30分钟。

5.显色

取出膜条，用A液室温轻摇洗两次，每次5分钟。用C液室温洗膜1～2分 钟，同时配制显色液。将膜条浸泡于显色液中(20mL显色液最多浸泡10张膜 条)避光显色15分钟即可观察结果。

6.结果判读

膜条阵列位点如下：HP分型膜条如表8所示：HP耐药膜条如表8所示； HP耐药膜条第一排的基因型为各位点的野生型；HP耐药膜条第二、三排的基 因型为各位点的突变型。

根据显色(蓝色斑点)出现的阵列位点直接判读HP耐药突变类型，其基因 型判读如下表11。

表11

7.参考值(参考范围)

本发明试剂盒只能对检测对象进行定性分析，以检测位点显色与否来进行 判断，显色强弱不能提供任何定量方面的参考。

8.检验结果的解释

1)临床样本试验成立条件

显色控制点IC正常显色。

阳性质控品正常显色且阴性质控品除IC外其他所有阵列位点不显色。

2)结果判读

在试验成立的条件下，根据显色(蓝色斑点)出现的阵列位点直接判读HP 的基因型和耐药突变类型。

当临床样本除IC外其余所有阵列位点均不显色，表明被检样本中无HP或 者其拷贝数在本试剂盒最低检出限以下。

3)异常结果分析

显色控制点IC不显色，提示显色不成功，建议重做。

阳性质控品相应阵列位点部分不显色或所有阵列位点不显色，提示可能是 样本DNA提取、PCR扩增、杂交失败，建议重做。

阴性质控品除IC外任何阵列位点显色，提示发生污染，建议排除污染后重 做。

9.产品性能指标

1)准确性：检测100例临床HP感染阳性样本，结果与测序比较显示为相 同的基因型和耐药突变类型，准确率为100％。

2)特异性：检测30例临床HP阴性样本结果全部为阴性；检测非HP感染 性病原体DNA，包括大肠杆菌，结果均为阴性。

3)灵敏度：能稳定检测胃粘膜HP的最低检出限为0.05ng/μL。

4)精密度：检测0.1ng/μL的胃粘膜HP，批内和批间的一致性为100％。

5)稳定性：产品有效期为6个月，在有效期内产品性能稳定。

10.本发明试剂盒结果示意图

在试验成立的条件下，根据显色(蓝色斑点)出现的阵列位点直接判读HP 的基因型和耐药突变类型。参见以下示意图。

1)分型为I型，耐药检测为敏感型的HP分型膜条：参见图1；HP耐药膜 条：参见图2。

2)分型为I型，耐药检测为A2143G的HP分型膜条：参见图1；HP耐药 膜条：参见图3。

3)分型为I型，耐药检测为87Lys、616A的HP分型膜条：参见图1；HP 耐药膜条：参见图4。

4)分型为I型，耐药检测为91Gly、616A的HP分型膜条：参见图1；HP 耐药膜条：参见图5。

5)分型为I型，耐药检测为556Ser、562Tyr的HP分型膜条：参见图1； HP耐药膜条：参见图6。

6)分型为I型，耐药检测为A2143G、562Tyr、16STTC、565T的HP分型 膜条：参见图1；HP耐药膜条：参见图7。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利 用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运 用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。