一种美洲斑潜蝇气味结合蛋白及其应用

摘要

本发明涉及一种分离的美洲斑潜蝇气味结合蛋白基因、其编码的蛋白及其应用，该蛋白能结合包括4-乙基苯甲醛、甘菊蓝、3，4-二甲基苯乙酮、对乙基苯乙酮在内的气味物质，利用该蛋白和气味物质的结合可以进一步用于防治美洲斑潜蝇。

说明书

技术领域

本发明涉及昆虫生物技术领域，具体涉及美洲斑潜蝇的新的气味结合蛋白及其应用。

背景技术

美洲斑潜蝇(Liriomyza sativae Blanchard)是一种多食性害虫，危害多种寄主植物。目前，使用化学杀虫剂仍是重要的防治手段。然而，斑潜蝇属害虫对化学杀虫剂的高抗性直接导致了我国海南省2009-2010年“毒豇豆”事件(http://english.peopledaily.com.cn/90001/90776/90882)的发生。怎样持续有效地控制美洲斑潜蝇的为害，是当前面临的一个严峻的问题。

随着分子生物学的发展，通过调节目标害虫对寄主植物的化学感受作用来进行防治是一种潜在的有效方法。美洲斑潜蝇对寄主的选择性主要是由成虫对其寄主挥发物的趋避反应来决定。寄主植物挥发物对美洲斑潜蝇的觅食、产卵等行为具有显著的引诱和趋避作用。因此，对美洲斑潜蝇化学感受系统的研究尤为重要。昆虫的化学感受系统主要包括嗅觉和味觉感受系统。嗅觉感受系统主要存在于昆虫嗅觉感受器中，气味结合蛋白是气味分子进入昆虫感受器后接触的第一类嗅觉蛋白，了解气味结合蛋白的性质和功能对理解昆虫的嗅觉感受系统至关重要。

发明内容

本发明根据美洲斑潜蝇转录组结果克隆了气味结合蛋白基因，利用荧光定量PCR(quantitative PCR)对基因在虫体中的表达谱进行了分析，同时通过原核表达、纯化得到了气味结合蛋白，应用荧光结合技术分析了美洲斑潜蝇主要寄主挥发物的结合特性。

本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种分离的美洲斑潜蝇气味结合蛋白基因，其中，所述基因的结构如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供一种分离的美洲斑潜蝇气味结合蛋白，其中，所述蛋白的结构如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供一种引物，其中所述引物能特异性的扩增美洲斑潜蝇气味结合蛋白基因，所述引物的序列如SEQ ID No.15和16所示。

本发明还提供一种上述分离的美洲斑潜蝇气味结合蛋白的应用，其中，所述蛋白和气味物质结合。

本发明还提供一种与上述美洲斑潜蝇气味结合蛋白结合的气味物质在防治美洲斑潜蝇中的应用。

本发明还提供一种美洲斑潜蝇的防治方法，其中，用与上述美洲斑潜蝇气味结合蛋白结合的气味物质对美洲斑潜蝇进行防治。

优选的，所述气味物质是2，4-二甲基苯乙烯、4-乙基苯甲醛、甘菊蓝、3，4-二甲基苯乙酮、对乙基苯乙酮、异烟酸甲酯、萘、1，4-桉叶素、邻-异丙基苯、萜品油烯、醋酸丁酯、苯甲醛，更优选的，所述气味物质是4-乙基苯甲醛、甘菊蓝、3，4-二甲基苯乙酮、对乙基苯乙酮。

优选的，上述气味物质与捕虫装置和/或试剂相结合，利用气味物质将美洲斑潜蝇吸引到捕虫装置和/或试剂处，从而进行防治。

本发明通过基因克隆和原核表达的方法获得一种纯化的美洲斑潜蝇气味结合蛋白，为研究美洲斑潜的气味结合蛋白的性质和功能提供材料，并用荧光结合的方法检测了该蛋白与寄主植物挥发物的结合谱，筛选出和本发明的气味结合蛋白结合的12中气味分子。从分子层面为美洲斑潜蝇对不同寄主挥发物做出的趋避反应提供理论依据，也为防治美洲斑潜蝇提供新的思路与途径。

附图说明

图1为OBP蛋白的5个疏水性区域示意图

图2为美洲斑潜蝇雌雄成虫不同组织OBP基因表达量

图3美洲斑潜蝇不同发育阶段OBP表达量

图4重组质粒载体构建图

图5PCR扩增电泳检测图(A)和重组OBP质粒酶切(B)电泳分析

图6重组OBP蛋白表达产物的SDA-PAGE分析(A)和Western印迹检测(B)

图7OBP与1-NPN结合的荧光特征

图8荧光探针1-NPN与OBP的结合曲线及Scathard方程

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。可以理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，其并不作为对本发明的限制。在不偏离于本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。本领域的技术人员将会意识到或能够确认，仅仅使用常规实验，许多等同物都能应用于本文所描述的特定步骤中。这些等同物被认为处在本发明的范围之内，并且被权利要求所覆盖。

实施例1美洲斑潜蝇气味结合蛋白OBP全长基因测序

材料与方法

(1)提取美洲斑潜蝇成虫总RNA

根据(EASYspin Plus组织/细胞RNA快速提取试剂盒)使用说明进行：

1)液氮研磨匀浆：将收集的虫体及各组织液氮冷冻，在研磨仪中充分研磨，加入350ul组织裂解液，剧烈振荡20s，转入1.5ml离心管中。1ml枪头抽打裂解物(剪切DNA)。

2)匀浆后裂解物13000rpm离心3min，将裂解物上清全部加到DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)。

3)立刻13000rpm离心60s，保留过滤液(RNA在滤过液中)。

4)用微量移液器较精确估计滤过液体积，加入等体积的70％乙醇，立即吸打混匀。

5)立刻将混合物加入一个吸附柱RA中，13000rpm离心30s，弃掉废液。

6)加入700ul去蛋白液RW1，室温放置1min，12000rpm离心30s，弃掉废液。

7)加入500ul漂洗液RW，12000rpm离心30s，弃掉废液。加入500ul漂洗液RW，重复一遍。

8)将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

9)取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30ul RNase free water(事先在70-90℃水浴中加热)，室温放置1min，12000rpm离心1min。

(2)合成cDNA第一链

反应体系为：MgCl2(25mM)4ul；Reverse Transcriptio 10×Buffer 2ul；dNTP Mixture(10mM)2ul；Recombinant Rnasin Ribonuc leaselnhibitor(40U/ul)0.5ul；AMV Reverse Transcription(23U/ul)0.5ul；Oligo(dT)Primer 1ul；总RNA 2ul，加ddH20至20ul。反应条件为：42℃45min，95℃5min，保存于0-5℃备用。

(3)OBP基因中间片段的扩增

表1 试验中所用引物

RT-PCR反应体系：

反应程序：

(4)美洲斑潜蝇OBP基因3′端扩增

反转录体系：

反应条件：

42℃        60min

70℃        15min

-20℃       Hold

Outer PCR反应体系：

反应条件：

(5)美洲斑潜蝇OBP基因5′端扩增

去磷酸化处理(CIAP)

去磷酸反应液：

50℃反应1h。

向上述反应液中加入20ul的3M CH3COONa(pH5.2)，130ul的RNaseFree dH20后，充分混匀。

加入200ul的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀后13000rpm室温离心5min，将上层水相转移至新的Microtube中。

加入200ul的氯仿，充分混匀后13000rpm室温离心5min，将上层水相转移至新的Miorotube中。

加入2ul的NA Carrier后均匀混合。

加入200ul的异丙醇，充分混匀后，冰上冷却10min，13000rpm 4℃离心20min，弃上清。

加入500ul的70％冷乙醇(RNase Free dH20配制)漂洗，13000rpm 4℃离心5min，弃上清后干燥。

加入7ul的RNase Free dH20溶解沉淀，得到CIAP-treated RNA。

“去帽子”反应(TAP)

“去帽子”反应液：

37℃反应1h。

此反应液为CIAP/TAP-treated RNA。取5ul用于5′RACE Adaptor连接反应，剩余的5ul保存于-80℃。

5′RACE Adaptor的连接。

CIAP/TAP-treated RNA      5ul

5′RACE Adaptor(15uM)    1ul

RNase Free dH20          4ul

65℃保温5min后冰上放置2min，然后加入

16℃反应1h。

向上述反应液中加入20ul的3M CH3COONa(pH5.2)，140ul的RNase FreedH20后，充分混匀。

加入200ul的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀后13000rpm室温离心5min，将上层水相转移至新的Microtube中。

加入200ul的氯仿，充分混匀后13000rpm室温离心5min，将上层水相转移至新的Microtube中。

加入2ul的NA Carrier后均匀混合。

加入200ul的异丙醇，充分混匀后，冰上冷却10min，13000rpm 4℃离20min，弃上清。

加入500ul的70％冷乙醇(RNase Free dH20配制)漂洗，13000rpm 4℃离心5min，弃上清后干燥。

加入6ul的RNase Free dH20溶解沉淀，得到Ligated RNA。

反转录反应。

反转录体系：

反应条件：

30℃   10min

42℃   1h

70℃   15min

Outer PCR反应

Outer PCR反应液：

反应条件：

Inner PCR反应

Inner PCR反应体系：

反应条件：

目标片段经切胶回收，连接载体，转化后测序。

通过RACE技术获得了美洲斑潜蝇气味结合蛋白OBP全长基因(644bp)，其中开放阅读框(ORF)469bp。通过生物信息学方法对其碱基序列(SEQ IDNo.1)及氨基酸序列(SEQ ID No.2)进行分析，美洲斑潜蝇OBP的氨基酸序列的亲疏水性根据Kyte J和Doolittle(1982)(http://web.expasy.org/protscale/)算法得到，正值表示疏水，负值表示亲水。分析发现其具有5个明显的疏水性区域(图1A-E所示)，这5个疏水性区域可能组成蛋白内部的疏水腔，与其结合疏水性的气味分子有关。

实施例2OBP在美洲斑潜蝇体内的组织表达

材料与方法

收集美洲斑潜蝇雌雄成虫及头部、胸部、腹部、足部不同组织，不同发育阶段虫体，液氮冷冻后置于-80℃储存备用。

提取美洲斑潜蝇雌雄成虫各部位及不同发育阶段总RNA，并合成cDNA第一链。方法同上

设计并合成用于荧光定量PCR的引物：

美洲斑潜蝇气味结合蛋白基因特异性引物为：

YG-3S：5′-CCGACAAGTCAGACGGCAAAAA-3′(SEQ ID No.11)

YG-3A：5′-TACGACGGGGCACAAACAAAAG-3′(SEQ ID No.12)扩增片段长度为234bp

作为内参的β-actin基因特异性引物为：

actin-F3：5′-GCCCAAAGCAAAAGAGGT-3′(SEQ ID No.13)

actin-R3：5′-GGAGCGACACGGAGTTCA-3′(SEQ ID No.14)扩增片段长度为188bp

以cDNA为模板进行PCR实验，电泳检测PCR结果，验证此引物是否具有特异性。

荧光定量PCR

取美洲斑潜蝇雌雄成虫不同组织、不同发育阶段虫体cDNA，每个处理设定3个重复

反应体系：

反应条件：

反应结束后确认荧光定量PCR反应的扩增曲线和熔解曲线。

以β-actin为内参基因，通过2^-ΔΔct方法对美洲斑潜蝇雌雄成虫不同组织、不同发育阶段OBP基因表达量进行相对定量分析，PCR结果的差异显著性应用SPSS19.0版统计软件的单因素方差分析法进行分析，显著性测定采用邓肯氏新复极差法检验，显著性检验水平为P＜0.05。

利用荧光定量PCR分析了OBP在美洲斑潜蝇体内的组织表达特异性。结果表明：OBP基因在美洲斑潜蝇头、胸、腹、足中均有表达，头部表达量远远高于其他组织，与雌虫的头部组织(表达量看作是1)相比，雌虫的胸，腹和足部组织中的相对表达量分别为0.08，0.06和0.12雄虫的头，胸，腹和足部组织的表达量分别为1.3，0.1，0.08和0.14，雄虫各部分组织的表达量均高于雌虫相应部位(图2)。在不同发育阶段的虫体中OBP基因也存在表达，与雌成虫(表达量看作是1)相比，在1龄、2龄、3龄幼虫、预蛹，蛹和雄虫中表达量分别为0.15，0.2，0，05，0.04，0.01和1.8，总之，在成虫中表达量相对较大，同时雄虫表达量也比雌虫表达量要高。(见图3)。

实施例3制备OBP重组蛋白

材料与方法

美洲斑潜蝇OBP蛋白表达引物设计

OBP-O-S：5′-GATATCGAAGAGTGGAAACGCAAGGAAT-3′(SEQ ID No.15)

OBP-O-A：5′-CTCGAGTTATTCTTCTTTCTTTTGGGCT-3′(SEQ ID No.16)(斜体加下划线部分为酶切位点，分别为EcoRV，Xho I酶切位点)

经PCR扩增后，切胶回收纯化，与载体过夜连接，得到重组的OBP，转化到大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1中，PCR扩增经行电泳检测，然后测序。测序正确后转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行原核表达。

通过构建原核表达载体(图4，5)，IPTG诱导表达，亲和层析纯化得到了纯度较高的OBP重组蛋白(图6)图6重组OBP蛋白表达产物的SDA-PAGE分析(A)和Western印迹检测(B)，其中M：标准蛋白分子量；1，a：未经诱导的pET30菌体；2，b：诱导的pET30菌体；3，c：未经诱导的重组OBP蛋白菌体；4，d：诱导的重组OBP蛋白菌体

实施例4OBP与探针N-苯基-1-萘胺的结合效应

OBP与探针N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-I-naphthy lamine，1-NPN)具有结合效应(图7)。随着1-NPN浓度加大，蛋白内源荧光强度降低，外源荧光强度逐渐增强，并趋于饱和，其饱和值为22umol/L。I-NPN与OBP结合常数为13.06umol/L(图8)。

实施例5OBP与气味化合物的结合

对美洲斑潜蝇的五种嗜好寄主植物菜豆、豇豆、生菜、白萝卜和黄瓜叶片挥发物通过GC-MS分析得到34种气味化合物。

利用竞争性结合实验研究34种气味标样与重组OBP蛋白的结合常数。在实验中，将2ml浓度为1nmol/L的重组OBP蛋白(溶于20mmol/L pH7.4Tris-HCl)与14umol/L 1-NPN混合，逐步加入不同浓度的气味标样(溶于甲醇中)，在337nm激发光下，以350-480nm处最大发射光谱处的荧光强度估计被结合的配基浓度。用Scatchard法线性化做图，横坐标为被结合配基的浓度，纵坐标为被结合配基的浓度与自由配基浓度的比值。根据[IC₅₀]值(竞争配基能替换50％的1-NPN时的浓度)计算竞争配体的解离浓度公式如下：K_D＝[IC₅₀]/(I+[1-NPN]/K_1-NPN)，其中[I-NPN]为未结合I-NPN浓度；K_1-NPN为OBP/I-NPN复合物的解离浓度。

对美洲斑潜蝇的五种嗜好寄主植物菜豆、豇豆、生菜、白萝卜和黄瓜叶片挥发物通过GC-MS分析得到的气味化合物的34种气味标样的结合试验结果显示有12种气味化合物与OBP蛋白有结合反应，其中4-乙基苯甲醛、甘菊蓝、3，4-二甲基苯乙酮、对乙基苯乙酮4种气味化合物能在22umol/L浓度下可完成50％的替换，这4种气味化合物的结合常数分别为11.497、12.383、8.639和20.098umol/L，结合能力相对较强。

表2 34种气味标准化合物结合特性