一种利用无色杆菌降解邻苯二甲酸二异辛酯的方法

摘要

本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体公开了一种利用无色杆菌降解邻苯二甲酸二异辛酯的方法，本发明将新分离得到无色杆菌(Achromobacter sp.)菌株MT-H用于降解DEHP，并优化了菌株的降解温度和pH值，因为该菌株对DEHP具有很高的降解效率，且在较宽的pH和温度范围内均能较好地降解DEHP，因此，以该菌株建立的降解方法可以用于不同复杂环境中DEHP污染的生物修复。

说明书

技术领域

本发明涉及环境污染物生物处理技术领域，具体地，涉及一种利用无色杆菌降解邻苯二甲酸二异辛酯的方法。

背景技术

邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAEs，是邻苯二甲酸形成的酯的统称。其中，邻苯二甲酸二异辛酯（DEHP）是一种典型的邻苯二甲酸酯类物质，在人们日常生活中用途非常广泛，特别是作为塑料添加剂，在重量上可达20～50%。由于塑料制品中DEHP 极易转移进入环境，从而广泛存在于大气、水体、土壤以及生物体中。DEHP在邻苯二甲酸酯类物质中毒性最强，可以通过各种途径进入生物体内，严重干扰其内分泌、生殖及神经系统，并具有极强的致畸性、致突变性、致癌性。目前，DEHP 已成为全球最普遍的污染物之一，并被美国国家环保局和中国环境监测总站列为优先控制污染物。

自然环境中 DEHP 的水解、光解和挥发速率非常缓慢，生物降解成为其从环境中消失的主要途径。但由于DEHP的侧链较长，尽管土壤中存在许多能降解 DEHP的菌种，其自然降解能力也极弱，远远不能满足 DEHP 环境污染治理的需要。因此，对 DEHP 的处理有待于寻求高效降解菌。

目前对于微生物降解DEHP，国内外已经开展了大量研究。例如，Kim等筛选分离出的一株尖孢镰刀菌，及Chao和Cheng等分离出的一株红球菌均对DEHP均具有良好的降解效果。但已报道的菌株对DEHP的降解速率还不能满足实际污染控制的要求，且有关能降解DEHP的无色杆菌种质资源鲜有报道。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种降解邻苯二甲酸二异辛酯的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一株无色杆菌(Achromobacter sp.)菌株MT-H，所述菌株于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC M 2015058，保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学，菌株分类命名为Achromobactersp. MT-H。

本发明所述无色杆菌(Achromobacter sp.)菌株MT-H来源于广州市大坦沙城市污水处理厂的回流污泥，经人工富集培养、分离纯化得到。该菌株对DEHP具有很高的降解效率，且在较宽的pH和温度范围内均能较好地降解DEHP，证明MT-H菌株可以作为优良的DEHP降解菌应用于DEHP污染的生物处理方面。

无色杆菌(Achromobacter sp.)菌株MT-H在LB培养基上培养七天的菌落为圆形，微凸起，淡黄色，湿润，半透明，边缘整齐，光滑。扫描电镜下多为球状或椭球状，直径为0.5~1μm。

无色杆菌(Achromobacter sp.)菌株MT-H的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，通过NCBI官方网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLAST程序与其他已登录细菌菌株16S rDNA序列进行比对，结果表明该菌株与Achromobactersp. 相似性最高，同源率达99%。

    一种降解DEHP的方法，将无色杆菌(Achromobacter sp.)菌株MT-H接种到DEHP污染介质中，在pH5~10、温度为20~40℃条件下降解4天以上；所述菌株于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC M 2015058。

    MT-H菌株在降解DEHP时的优选条件为在pH6~9、温度为30~40℃条件下降解4天以上。

优选地，MT-H菌株在降解DEHP时，将菌株MT-H制备成菌悬液接种到DEHP污染介质中。

更优选地，所述菌悬液的制备方法为将纯化后的菌株MT-H接入常规微生物液体培养基培养至对数期，离心收集菌体，用PBS洗菌后重悬调节OD_600 nm = 0.8~1.2作为菌悬液。

更优选地，所述菌悬液的OD_600 nm = 1.0。

优选地，所述常规微生物液体培养基为LB液体培养基、NA液体培养基或PDA液体培养基。

优选地，在制备菌悬液时，要用PBS洗菌2~4次。

将OD_600 nm = 1.0的MT-H的菌悬液用于降解DEHP时，菌悬液的用量根据污染介质中DEHP的浓度来确定，优选地，当DEHP的浓度为50~600mg L^-1时，100mL的污染介质中加入1~5mL的OD_600 nm = 1.0的MT-H的菌悬液。

如上所述方法在修复DEHP污染介质中的应用。

优选地，所述介质为土壤或水。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种高效降解DEHP的方法，本发明将新分离得到无色杆菌(Achromobacter sp.)菌株MT-H用于降解DEHP，并优化了菌株的降解温度和pH值，因为该菌株对DEHP具有很高的降解效率，且在较宽的pH和温度范围内均能较好地降解DEHP，因此，以该菌株建立的降解方法可以用于不同复杂环境中DEHP污染的生物修复。

附图说明

图1为 MT-H菌在LB培养基上培养7天的生长形态特征。

图2为 MT-H菌的扫描电镜照片。

图3为 MT-H菌的16S rDNA的系统发育树。

图4为 MT-H菌对不同浓度的DEHP的降解效果。

图5为 MT-H菌在不同条件下（pH、温度和转速）对DEHP的降解效果。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例来进一步详细阐述本发明。本发明以下实施例为本发明较佳的实施方式，本发明主要阐述所述菌株以及基于所述菌株的应用思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明的保护范围，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，包含在本发明的保护范围之内。

实施例中所述培养基配方如下：

无机盐培养液（MSM，g/L）：K₂HPO₄：5.8，KH₂PO₄：4.5，(NH₄)₂SO₄：2.0，MgCl₂：0.16，CaCl₂：0.02，Na₂MoO₄·2H₂O：0.0024，FeCl₃：0.0018，MnCl₂·2H₂O：0.0015。最终pH为7.5。

牛肉膏蛋白胨培养基（LB）：酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠10.0 g，加超纯水至1L，调节pH= 7.0；121℃灭菌20min。固体平板则添加1.5%（w/v）琼脂粉。

实施例1菌株的分离与鉴定

采集广州市大坦沙城市污水处理厂的回流污泥，称取5 g活性污泥样品于含有50 mL无菌水的150 mL三角瓶中，在30℃，140 rpm 培养3天后取5 mL污泥悬液加入到100 mL含有 DEHP（50 mg L^-1）的上述MSM培养基中。经30℃，140 rpm培养7天后，每次按取1 mL的接种量连续富集、转接10次，并相应提高培养基中DEHP的含量至1000 mg L^-1。然后将转接10次的培养液稀释10³~10⁵ 倍涂布于LB固体平板上，30℃倒置培养1~3天。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落多次划线纯化，分离获得一株细菌，编号MT-H。然后将菌株接种于LB固体平板上30℃倒置培养7天，观察其菌落形态。LB平板培养7天的菌落成圆形，微凸起，淡黄色，湿润，半透明，边缘整齐，光滑（见图1）。

扫描电镜样品制备与观察：将纯化后的菌株MT-H接入含有10 mL的LB液体培养基过夜活化。吸取800μL菌液经8000 rpm离心3~5 min，去上清液，加入500μL PBS 洗菌3次。在收获的菌体沉淀中加入1 mL 的2.5%戊二醛充分混匀，4℃静置过夜。然后再次经8000 rpm离心3~5 min，去上清液，加入500μL PBS 洗菌3次。随后将菌体分别在30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脱水2次，每个梯度约浸泡15 min，然后8000 rpm离心去上清液，最后用乙酸异戊酯置换乙醇2次，每次20 min，方法同乙醇脱水。经过CO₂干燥后制片观察。扫描电镜下可以观察到该菌呈球状或椭球状，直径约为0.5~1μm（见图2）。

菌株的16S rDNA分子鉴定：提取细菌总DNA，用细菌16S rDNA通用引物对该菌基因组进行PCR扩增。PCR产物经测序（由上海生工完成测序）后，序列如SEQ ID NO：1所示，将测序结果与GenBank中已报道的16S rDNA序列进行同源性比对，并选取若干菌种做进化树分析。如图3所示，本发明分离纯化得到的菌株MT-H的16S rDNA序列与无色杆菌（Achromobactersp. D-12）同源率达99%，进化距离最近。其培养特征与扫描电镜观察特征与无色杆菌（Achromobactersp.）也最为相似，因此本发明筛选获得的降解菌为无色杆菌（Achromobactersp.）。

因此，发明人将该菌株于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC M 2015058，保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学，菌株分类命名为Achromobactersp. MT-H。

实施例2 Achromobactersp.MT-H对DEHP的降解效果实验

S1.菌悬液制备：将纯化后的菌种MT-H接入含有10 mL的LB液体培养基过夜活化培养至对数期，经5000 rpm 离心10 min收集菌体，用PBS洗菌3次后重悬，调节OD_600 nm = 1.0 作为菌种悬液。

S2.降解性能测定：分别向100mL含有不同浓度DEHP（50、100、200、400、600 mg L^-1）的MSM培养液中接菌1 mL，以不接菌作为对照，并调节pH为8.0，每组三个重复。在30℃，140 rpm恒温摇床培养9天，定期取样，经GC/MS测定DEHP的降解情况。

    色谱条件：采用岛津公司QP2010 Plus型GC/MS串联质谱仪。色谱柱为安捷伦HP-5 柱子(0.25 μm × 0.25 mm × 30 m)，进样温度为250℃，离子源（EI）温度为220℃，采用不分流进样 1 μL，载气为高纯氦气。升温程序为：初始温度为100℃，保持2 min，15℃/min梯度上升至129℃，然后以40℃/min升温至280℃，保持5min。

质量控制：采用外标法和六点校正标准物质制作标准曲线。6种PAEs混标的基质加标平均回收率为92.5~110.2%，相对偏差低于10.5%，仪器检测限为0.12-0.45 ug g^-1。该方法满足痕量有机物定量分析要求。

结果如图4所示，Achromobactersp. MT-H在培养初期对DEHP的降解速率非常缓慢，随着培养时间的延长，其降解作用也随之增大；在DEHP浓度低于200 mg L^-1时，7d内DEHP几乎完全降解；当DEHP的浓度较高时，其降解速率虽明显受到抑制；当DEHP的浓度高至600 mg L^-1时，培养至第9天，其降解率也可达50%以上。

本实施例说明分离所得到的Achromobactersp. MT-H可利用DEHP作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，在DEHP浓度较低时，该菌具有高效降解DEHP的能力。

实施例3  pH、温度和转速对Achromobactersp. MT-H降解DEHP的影响

pH对Achromobactersp.MT-H降解DEHP的影响：分别向100mL不同pH(5、6、7、8、9、10)的含有DEHP（500mg/L）的MSM培养液中接菌1mL，以不接菌作为对照，每组三个重复。在30℃，140 rpm恒温摇床培养48h之后，经GC/MS测定DEHP的降解情况。

温度对Achromobactersp.MT-H降解DEHP的影响：向100mL含有DEHP（500mg/L）的MSM培养液中接菌2.5mL，以不接菌作为对照，每组三个重复，分别在温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的恒温摇床中经140 rpm培养48h之后，经GC/MS测定DEHP的降解情况。

转速对Achromobactersp. MT-H降解DEHP的影响：向100mL含有DEHP（500mg/L）的MSM培养液中接菌2.5mL，以不接菌作为对照，每组三个重复，分别在转速为80、110、140、170、200 rpm转速的恒温摇床经30℃培养48h之后，经GC/MS测定DEHP的降解情况。

实验结果如图5所示，从Achromobactersp. MT-H菌在不同pH条件下对DEHP的降解效果图可以看出，Achromobactersp. MT-H菌在不同pH条件下对DEHP的降解能力不同。在pH为6~9的范围内，该菌对DEHP的降解率均达到80%以上；尤其是pH为7~8范围内，降解效率可达90%以上；在pH为5时降解率受到较大的抑制。从Achromobactersp. MT-H菌在不同温度条件下对DEHP的降解效果图可以看出，当温度在30~40℃范围内，该菌对DEHP的降解率可达80%以上；但在较低温度下，其降解率明显受到了抑制。从Achromobactersp. MT-H菌在不同转速条件下对DEHP的降解效果图可以看出，转速对该菌的DEHP降解效率影响并不是很显著，大致趋势为转速越高越有利于该菌降解DEHP，但当转速达到170rpm时，其降解率基本趋于不变。

本实施例说明，菌株Achromobactersp. MT-H在中性和偏碱性的较宽pH和温度范围内均能较好的降解DEHP, 为其在不同的复杂环境中的应用提供了保证。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  暨南大学

 

<120> 一种利用无色杆菌降解邻苯二甲酸二异辛酯的方法

 

<130> 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1419

<212>  DNA

<213>  MT-H菌株的16S rDNA序列

 

<400>  1

tgagacgatc taccgtggta tcgccctcct tgcggttagt gctaactact tctggtaaaa     60

 

cccactccca tggtgtgacg ggcggtgtgt acaagacccg ggaacgtatt caccgcgaca    120

 

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accttcctcc ggtttgtcac cggcagtctc attagagtgc cctttcgtag caactaatga    360

 

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acatgtcaag ggtaggtaag gtttttcgcg ttgcatcgaa ttaatccaca tcatccaccg    540

 

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gtcaacttca cgcgttagct gcgctaccaa ggtccgaaga ccccaacagc tagttgacat    660

 

cgtttagggc gtggactacc agggtatcta atcctgtttg ctccccacgc tttcgtgcat    720

 

gagcgtcagt gttatcccag gaggctgcct tcgccatcgg tgttcctccg catatctacg    780

 

catttcactg ctacacgcgg aattccacct ccctctgaca cactctagcc cggtagttaa    840

 

aaatgcagtt ccaaagttaa gctctgggat ttcacatctt tctttccgaa ccgcctgcgc    900

 

acgctttacg cccagtaatt ccgattaacg cttgcaccct acgtattacc gcggctgctg    960

 

gcacgtagtt agccggtgct tattctgcag gtaccgtcag ttccgcgggg tattaacccg   1020

 

cgacgtttct ttcctgccaa aagtgcttta caacccgaag gccttcatcg cacacgcggg   1080

 

atggctggat cagggtttcc cccattgtcc aaaattcccc actgctgcct cccgtaggag   1140

 

tctgggccgt gtctcagtcc cagtgtggct ggtcgtcctc tcaaaccagc tacggatcgt   1200

 

cgccttggtg agccgttacc ccaccaacta gctaatccga tatcggccgc tccaatagtg   1260

 

caaggtcttg cgatcccctg ctttcccccg tagggcgtat gcggtattag ctacgctttc   1320

 

gcgtagttat cccccgctac tgggcacgtt ccgatacatt actcacccgt tcgccactcg   1380

 

ccaccagacc gaagttgcgt gctgccgttc gactgcatg                          1419