长链非编码RNA及在制备抑制结直肠癌细胞转移药物的应用

摘要

本发明公开了一种与人结直肠癌转移相关的长链非编码RNA(即lncRNA-DRIC)及其在制备抑制结直肠癌细胞转移药物中的应用。lncRNA-DRIC的转录本序列如SEQ ID NO:1所示。实验表明，lncRNA-DRIC在结直肠癌组织中表达下调，过表达lncRNA-DRIC可以抑制结直肠癌细胞迁移。本发明首次发现一个长链非编码RNA lncRNA-DRIC在结直肠癌组织中的特异性表达，并证明其抑制结直肠癌细胞的迁移，为结直肠癌转移的辅助诊断提供了新的有力工具，也提供了一个具有基因治疗潜力的RNA过表达载体，具有重要的意义和极大的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种与人结直肠癌转移相关的长链非 编码RNA(即lncRNA-DRIC)及其在制备抑制结直肠癌细胞转移药物中的应用。

背景技术

根据资料显示，2014年全球结直肠癌(colorectal cancer，CRC)新发病例 占全部癌症的8％，发病率和死亡率均排第3位。在中国，结直肠癌已成为最 常见的十大恶性肿瘤之一，近年来发病率持续上升。据统计，我国2010年大 肠癌的发生率为20.9/10⁵，死亡率为10.05/10⁵，分别位居我国肿瘤发生率的第 6位和死亡率的第5位。因此，阐明大肠癌的发生、发展的分子机制，寻找新 的诊断和治疗靶点，将有助于其早期诊断、预后预测及提高治疗效果。

长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNA)是一类转录本长度超过 200nt的RNA分子，它们几乎不编码蛋白，由RNA聚合酶II转录并经可变剪 切形成，转录水平低于蛋白质编码基因，曾一度被认为是基因组转录的“噪音”。 近来研究证实，lncRNA能在表观遗传学、转录调控、转录后调控等多种层面 上调控基因的表达水平，参与生物体的发育、分化等基本生命过程，其表达或 功能异常与人类心血管疾病、神经系统疾病、肿瘤等疾病的发生发展密切相关。 lncRNA有望成为肿瘤诊断、预测预后的标志物，同时也为肿瘤的治疗提供了新 的靶点。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种与人结直肠癌转移相关的长链非编码 RNA——lncRNA-DRIC，lncRNA-DRIC有可能成为结直肠癌转移的标志物。

本发明的另一目的在于提供lncRNA-DRIC在制备抑制结直肠癌细胞转移药 物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种与人结直肠癌转移相关的长链非编码RNA，是lncRNA-DRIC，其转录 本序列如SEQ ID NO:1所示。

lncRNA-DRIC在结直肠癌中的表达水平明显低于正常肠上皮。进一步构建 其表达载体plNCX2-lncRNA-DRIC，转染结直肠癌细胞HCT116后，发现相较 于对照组，lncRNA-DRIC过表达可以抑制结直肠癌细胞的迁移。因此， lncRNA-DRIC可以用于制备抑制结直肠癌细胞转移的药物。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明首次发现一个长链非编码RNA lncRNA-DRIC在结直肠癌组织中的 特异性表达，并证明其抑制结直肠癌细胞的迁移，为结直肠癌转移的辅助诊断 提供了新的有力工具，也提供了一个具有基因治疗潜力的RNA过表达载体，具 有重要的意义和极大的应用价值。

附图说明

图1是lncRNA-DRIC在79例结直肠癌组织及配对的正常肠上皮组织的表 达量示意图(N代表正常组织，T代表肝癌组织)。

图2是过表达lncRNA-DRIC的HCT116细胞及对照细胞的迁移实验结果示 意图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。

实施例1

lncRNA-DRIC的克隆，包括以下步骤：

1.临床组织样本收集

收集中山大学附属肿瘤医院2004-2009年期间存档的结直肠癌冰冻新鲜组 织标本及其配对正常肠上皮组织共79对。以上标本用于科学研究均获得患者的 知情同意。

2.lncRNA定量PCR实验：

(1)RNA抽提

利用Trizol从冰冻组织中抽提总RNA，用紫外分光光度计测定RNA的浓 度和纯度。

(2)逆转录反应

①在PCR管中加入以下试剂：

总RNA                  2ug

随机引物(0.5ug/ul)     1ul

无RNA酶双蒸灭菌水  补至10ul

②置PCR仪中70℃、5min，立即放入冰中静置至少2min；

③再在上述PCR管中依次加入以下试剂：

④置PCR仪中42℃、1h；

(3)以SEQ ID NO:1为对象设计引物

lncRNA-DRIC：F：5’-AGGGCGTGTCTGAGATTGTG-3’(SEQ ID NO:2)

R：5’-TAGGAGTTCCACCGACGTGA-3’(SEQ ID NO:3)

β-actin：F：5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’(SEQ ID NO:4)

R：5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’(SEQ ID NO:5)

(4)实时定量PCR实验检测lncRNA-DRIC在结直肠癌组织中的表达量 反应体系如下(15μL)：

热循环参数：

实验结果见图1(N代表正常组织，T代表肝癌组织)，可以看出 lncRNA-DRIC在结直肠癌组织中呈低表达。

实施例2

建立稳定表达lncRNA-DRIC的HCT116细胞株

(1)病毒包装

合成lncRNA-DRIC cDNA序列，XhoI和NotI双酶切插入逆转录病毒载体 plNCX2中，构建成功后进行测序验证，结果正确并将该质粒命名为 plNCX2-lncRNA-DRIC。

应用293T细胞系包装病毒。293T细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM 培养液，37℃，5％CO₂培养细胞至70-80％融合后，按照Lipofectamine(Invitrogen) 转染试剂说明书，将携带质粒plNCX2-lncRNA-DRIC和包装质粒PVSV-G共转 染，48h后收集病毒上清。

(2)感染细胞及嘌呤霉素筛选

直接将上述病毒上清感染结直肠癌HCT116细胞，感染两天后加G418筛选 两周，以获得最大感染效率的稳定表达lncRNA-DRIC或对照的细胞株，分别命 名为HCT116-plNCX2-lncRNA-DRIC和HCT116-NC。

实施例3

细胞迁移实验

(1)采用Transwell方法。Transwell小室购自BD公司，孔径0.8μm，聚碳 酸脂微孔滤膜封闭。

(2)胰酶消化细胞，用无血清DMEM重悬上述稳定株细胞 HCT116-plNCX2-lncRNA-DRIC和HCT116-NC至浓度为5×10⁵cells/mL。

(3)Transwell小室上室加200uL以上细胞悬液，下室加入700μL含10％FBS 的细胞培养基，每组3复孔，37℃，5％CO₂培养细胞。

(4)24小时后，取出Transwell小室，PBS漂洗，棉签擦去上室上面未发 生侵袭的细胞，移去Transwells，倒置，风干。

(5)染色：24孔板中加入500μL含0.1％结晶紫甲醇溶液，将小室置于其 中，使膜浸没在培养基中，室温染色10分钟，取出，PBS清洗，风干。

(6)计数：直径上取6个视野，照相，计数。

结果见图2，可以看出稳定过表达lncRNA-DRIC的HCT116细胞的迁移能力 比对照株的显著降低，说明lncRNA-DRIC有抑制结直肠癌细胞转移的功能。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。