戊唑醇与萘啶酮酸混合进行莱茵衣藻培养过程中除菌方法

摘要

一种戊唑醇与萘啶酮酸混合进行莱茵衣藻培养过程中除菌方法，属于莱茵衣藻除细菌与真菌的方法。方法：A.将含有混合菌污染的衣藻接种到TAP固体培养基平板上，在23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下培养3-5天；B.配制含有10ug/ml戊唑醇以及15ug/ml萘啶酮酸的TAP固体培养基平板备用；C.将已经在TAP固体培养基平板长好的衣藻转接划线至含有混合抗菌剂的TAP平板上，在23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下培养5-8天；D.将已经除过菌的衣藻再次转接划线至普通的TAP固体培养基平板上，在23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下培养3-5天，为后续实验或者保种备用。优点：利用混合抗菌剂对衣藻细菌与真菌污染处理，解决利用衣藻进行科学实验与应用过程中产生的杂菌污染问题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种莱茵衣藻除细菌与真菌的方法，特别是一种戊唑醇与萘啶酮酸混合进 行莱茵衣藻培养过程中除菌方法。

背景技术

莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是一种真核单细胞微藻，具有生长周期短，易于 培养，基因组已被注释，相关遗传生化技术与分子生物学技术成熟，具备重金属吸附能力， 油脂生产量高等特点，而被作为生命科学研究与应用的模式生物，目前已经开展了纤毛类 疾病模型衣藻的研究，以及生物柴油与生物去污的研究。然而在科学研究与应用过程中不 可避免的在接种的时候造成衣藻藻种的污染问题，而这些杂菌污染会危及到衣藻藻种的保 存，特别是稀有藻种，以及影响研究结果的准确性。

目前的除菌方法包括有物理方法与化学方法。

在物理方法中，常用单克隆划线或铺板法与离心沉淀洗脱法。单克隆划线法要求将 杂菌污染的衣藻藻种挑取少许进行培养基平板划线，单克隆铺板法要求将杂菌污染的衣藻 藻种使用少许液体培养基重悬后再铺平板，培养数日，二者都将使得衣藻细胞与污染杂菌 分离，将未污染衣藻单克隆细胞挑出至新的平板，保种。离心沉淀洗脱法要求将杂菌污染 的衣藻藻种使用液体培养基重悬后进行低速离心(600g)，使得衣藻细胞体沉淀至底部， 去除上清污染液，可多次洗涤沉淀，最后铺板，培养数日，将未污染衣藻单克隆细胞挑出 至新的平板，保种。但是上诉常用的物理方法对于污染严重的衣藻藻种的成功率很低，并 且离心沉淀洗脱法对于具有高粘附性细菌也是不起作用的。

在化学方法中，Mahan等研究者发现使用20～40ug/mL的多菌灵、甲基托布津、苯 菌灵三种苯并咪唑类除真菌剂均可有效去除衣藻的真菌污染(Mahan,2005, BioTechniques)；Kan等研究者进一步研究发现组合使用多菌灵(40ug/mL)、氨苄青霉素 (500ug/mL)、头孢噻肟(100ug/mL)可以有效去除混合细菌和真菌的污染(Kan,2009, Journal of Phycology)。然而，现有化学去除杂菌的方法并不是持续有效的，特别是研究环 境中持续使用一种混合抗菌剂，会使细菌真菌产生抗性从而引起失效。

莱茵衣藻为Chlamydomonasreinhardtii，在实验室的条件下，易受到操作不当等因素 导致细菌与真菌的污染，并且造成衣藻污染的情况复杂多变，污染的细菌真菌的种类不定。

发明内容

本发明的目的是要提供一种戊唑醇与萘啶酮酸混合进行莱茵衣藻培养过程中除菌方 法，解决目前在防治衣藻实验与应用过程中出现的杂菌污染的问题。

本发明的目的是这样实现的：该除菌方法如下：杂菌污染的衣藻转接划线至含有混合 抗菌剂的TAP固体培养基平板上，在23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下 进行培养5-8天，实现衣藻的除菌；所述的混合抗菌剂包括10ug/ml抗真菌剂和15ug/ml 抗细菌剂；所述的抗真菌剂为戊唑醇；抗细菌剂为萘啶酮酸。

所述实验藻种为：莱茵衣藻，即Chlamydomonasreinhardtii。

所述的TAP固体培养基平板为：TAP盐溶液25ml/L，磷酸盐溶液0.375ml/L，Hutner 微量元素1ml/L，乙酸1ml/L，Tris 2.42g/L，琼脂粉15g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min， 倒平板备用；所述的TAP盐溶液为：NH₄Cl 15g/L,MgSO₄·7H₂O 4g/L,CaCl₂·2H₂O 2g/L； 所述的磷酸盐溶液为：K₂HPO₄ 288g/L,KH₂PO₄ 144g/L；所述的Hutner微量元素为：EDTA 二钠盐50g/L,ZnSO₄·7H₂O 22g/L,H₃BO₃ 11.4g/L,MnCl₂·4H₂O 5.06g/L,CoCl·6H₂O 1.61g/L,CuSO₄·5H₂O 1.57g/L,(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1.1g/L,FeSO₄·7H₂O 4.99g/L，用KOH 或者HCl调节pH至7.0。

所述含有混合抗菌剂的类型、浓度与使用方法为：抗真菌剂戊唑醇使用终浓度10 ug/ml，在上述TAP固体培养基配制时添加，抗细菌剂萘啶酮酸使用终浓度15ug/ml，在 上述TAP固体培养基配制灭菌以后，冷却至约55℃后添加。

有益效果，由于采用了上述方案，利用抗真菌剂戊唑醇与抗细菌剂萘啶酮酸混合进行 衣藻杂菌去除。抗真菌剂戊唑醇属于三唑类杀菌剂，能够抑制真菌麦角甾醇的合成从而抑 制真菌细胞膜功能，具有广谱杀菌性。抗细菌剂萘啶酮酸能够抑制细菌DNA的合成，具 有宽广的抗菌谱。目前未报道使用戊唑醇与萘啶酮酸混合抗菌剂进行衣藻污染的去除，该 方法具有广谱杀菌特性，适用于各个研究环境下细菌真菌污染的去除，特别是对于多菌灵、 氨苄青霉素、头孢噻肟混合除菌方法无效的衣藻污染藻种的除菌。本方法比多菌灵等混合 除菌法的成本低，效果好，配制方便，应用价值高。该方法具有不抑制衣藻本身生长，并 且除混合菌能力强，操作方法简便，易于推广应用，能够有效防治衣藻实验与应用过程中 出现的杂菌污染问题，达到了本发明的目的。

优点：利用戊唑醇与萘啶酮酸混合抗菌剂有效的进行衣藻细菌与真菌污染的处理，能 有效解决利用衣藻进行科学实验与应用过程中产生的杂菌污染问题，利于珍贵莱茵衣藻藻 种的保存以及科学实验的准确性，具有很好的推广应用价值。

a、本发明所采用的除菌剂戊唑醇与萘啶酮酸未曾报道用于莱茵衣藻 (Chlamydomonasreinhardtii)的除菌。该藻株种质资源丰富，基因组小，功能保守，遗传分 析与生化分析简单，是进行生命科学研究的常用模式生物，本方案应用范围广。

b、本发明所采用的除菌剂戊唑醇与萘啶酮酸混合除菌效果较之前所报道的多菌灵与 氨苄抗生素、头孢抗生素混合除菌效果要好，可以在使用后者混合除菌剂不能得到较好除 菌效果时采用本方案。

c、本发明提供了混合除菌剂的另一方案，为防止杂菌抗性产生，可以将本方案与多 菌灵、氨苄抗生素、头孢抗生素混合除菌方案交替使用，已达到最优效果。

d、本发明能有效解决利用衣藻进行科学实验与应用过程中产生的杂菌污染问题，利 于珍贵莱茵衣藻藻种的保存以及科学实验的准确性，具有很好的推广应用价值。

附图说明：

图1是污染莱茵衣藻在普通TAP固体培养基平板上生长状况图。

图2是污染莱茵衣藻在多菌灵、氨苄抗生素、头孢抗生素混合除菌方案的平板上生长 状况图。

图3是污染莱茵衣藻在本发明的戊唑醇、萘啶酮酸混合除菌方案的平板上生长状况 图。

具体实施方式

该除菌方法如下：杂菌污染的衣藻转接划线至含有混合抗菌剂的TAP固体培养基平板 上，在23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下进行培养5-8天，实现衣藻的 除菌；所述的混合抗菌剂包括10ug/ml抗真菌剂即戊唑醇和15ug/ml抗细菌剂即萘啶酮酸。

所述实验藻种为：莱茵衣藻，即Chlamydomonasreinhardtii。

所述的TAP固体培养基平板为：TAP盐溶液25ml/L，磷酸盐溶液0.375ml/L，Hutner 微量元素1ml/L，乙酸1ml/L，Tris 2.42g/L，琼脂粉15g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min， 倒平板备用；所述的TAP盐溶液为：NH₄Cl 15g/L,MgSO₄·7H₂O 4g/L,CaCl₂·2H₂O 2g/L； 所述的磷酸盐溶液为：K₂HPO₄ 288g/L,KH₂PO₄ 144g/L；所述Hutner微量元素为：EDTA 二钠盐50g/L,ZnSO₄·7H₂O 22g/L,H₃BO₃ 11.4g/L,MnCl₂·4H₂O 5.06g/L,CoCl·6H₂O 1.61g/L,CuSO₄·5H₂O 1.57g/L,(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1.1g/L,FeSO₄·7H₂O 4.99g/L，用KOH 或者HCl调节pH至7.0。

所述含有混合抗菌剂的类型、浓度与使用方法为：抗真菌剂戊唑醇使用终浓度10 ug/ml，在上述TAP固体培养基配制时添加，抗细菌剂萘啶酮酸使用终浓度15ug/ml，在 上述TAP固体培养基配制灭菌以后，冷却至约55℃后添加。

实施例1：该除菌方法的工艺如下：A.将含有混合菌污染的衣藻接种到TAP固体培 养基平板上，在23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下进行培养3-5天；B. 配制含有10ug/ml戊唑醇以及15ug/ml萘啶酮酸的TAP固体培养基平板备用；C.将已经 在TAP固体培养基平板长好的衣藻转接划线至含有混合抗菌剂的TAP平板上，在23± 0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下进行培养5-8天；D.将已经除过菌的衣藻 再次转接划线至普通的TAP固体培养基平板上，在23±0.5℃，14/10小时明暗光周期， 8000Lx光强下进行培养3-5天，进行后续实验或者保种备用。

具体步骤如下：

1、污染衣藻活化：将受到污染的衣藻接种至TAP固体培养基平板上，在23±0.5℃， 14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下进行培养3-5天，以便于衣藻处于生长能力较强的 状态；所述的TAP固体培养基平板包括：TAP盐溶液25ml/L，磷酸盐溶液0.375ml/L， Hutner微量元素1ml/L，乙酸1ml/L，Tris 2.42g/L，琼脂粉15g/L，121℃高压蒸汽灭菌 20min，倒平板备用；所述的TAP盐溶液为：NH₄Cl 15g/L,MgSO₄·7H₂O 4g/L,CaCl₂·2H₂O 2g/L；所述的磷酸盐溶液为：K₂HPO₄ 288g/L,KH₂PO₄ 144g/L；所述的Hutner微量元素为： EDTA二钠盐50g/L,ZnSO₄·7H₂O 22g/L,H₃BO₃ 11.4g/L,MnCl₂·4H₂O 5.06g/L,CoCl·6H₂O 1.61g/L,CuSO₄·5H₂O 1.57g/L,(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1.1g/L,FeSO₄·7H₂O 4.99g/L，用KOH 或者HCl调节pH至7.0。

2、污染衣藻除菌：配制含有10ug/ml戊唑醇以及15ug/ml萘啶酮酸的TAP固体培养 基平板。将上述已经在TAP固体培养基平板长好的污染衣藻转接划线至含有上述混合抗 菌剂的TAP固体培养基平板上，在23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下进 行培养5-8天，保证污染杂菌的去除。

3、去除菌后的衣藻转接：将已经去除杂菌的衣藻再次转接划线至普通的TAP固体培 养基平板上，在23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下进行培养3-5天，进 行后续实验或者保种备用。

4、进一步污染衣藻除菌，在步骤2与步骤3之间可选加入步骤：如果衣藻污染杂菌 较为严重，可以经过上述第2步处理后，再次将已经经过第2步处理的衣藻转接划线于含 有上述混合抗菌剂的TAP固体培养基平板上，在23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx 光强下进行培养5-8天，以保证污染杂菌的彻底去除。

本发明的图1、图2和图3中，1未受到污染的衣藻；2-4受到不同种类菌污染的 衣藻。