制备治疗用途的脂质体封装式长春新碱的改进方法

摘要

公开了有效配成用于静脉内注射液(VSLI)的脂质体封装式长春新碱的改进方法，其操作失误和污染的风险减少。

说明书

相关申请

本申请要求2012年11月20日提交的名为“制备治疗用途的脂质体封装式长 春新碱的改进方法(Improved Method for the Preparation of Liposome Encapsulated  Vincristine for Therapeutic Use)”的美国临时申请号61/728378的优先权，其全部内 容被并入本文作为参考。

发明背景

脂质体是确立的可通过相对于非封装形式提高药物的等离子体分布和药代动 力学来增强治疗活性药物效力的纳米颗粒(例如，Weinstein,Liposomes:From  Biophysics to Therapeutics,(Ostro,M.J.,ed.),Marcel Dekker,Inc.,N.Y.,pp.277-338, (1987))。例如，硫酸长春新碱脂质体注射液(VSLI)是封装在鞘磷脂-胆固醇脂质 体中的抗癌治疗硫酸长春新碱的脂质体制剂，其提供的效力大于标准硫酸长春新 碱注射液USP(VSI)。临床试验也已证明VSLI通过与非封装式长春新碱相比显著 延长长春新碱的循环半衰期而促进剂量强化。脂质体提供延迟药物释放机制，并 且脂质体尺寸能使药物通过外渗在癌组织中积累((Webb等,Cancer Chemother. Pharmacol 42:461-470,1998；Shan等,Cancer Chemother.Pharmacol 58:245-255, 2006)。这些特征转化成相对于标准VSI提高的临床效益。

硫酸长春新碱在鞘磷脂-胆固醇脂质体中的封装一般通过利用酸性脂质体内 pH(例如，pH 4)和中性pH(例如，pH 7)的外部介质来实现。这种pH梯度使 弱碱性长春新碱以高效率扩散到脂质体内部中(Cullis等，Trends in Biotech 9: 268-272，1991；Boman等，Bioch Biophys Acta，1152:253-258，1993)。为使长春 新碱在跨膜pH梯度下在脂质体内部中积累，脂质体膜必须对于长春新碱的空间体 积是暂时可渗透的。因此，不同于通常可被动地封装到脂质体中的中性或阴离子 药物，必须增加鞘磷脂-胆固醇脂质体的温度以使跨膜pH梯度关于长春新碱起作 用。脂质体双层，是联锁鞘磷脂和胆固醇分子的取向，需要特殊的瞬态热模式来 产生向热性紊乱过渡态(thermotropic disorder transition states)。这些过渡态显著减 轻膜脂质之间的弱分子间结合，在联锁脂质中产生间隙，并使脂质体生物层变得 暂时可渗透。封装过程利用在冷却回到环境温度时发生的鞘磷脂-胆固醇脂质的自 发性重新自组装，恢复了膜完整性。

这种药物封装加热曲线必须与长春新碱对于热暴露的化学不稳定性平衡 (Vendrig等，Internatl.J.of Pharmaceutics 50:189-196，1989；Sethi等，Cancer Res。 45:5386-5389，1985)。长春新碱是热不稳定的，并且容易在升高的温度下降解成 N-脱甲酰基长春新碱。长春新碱的这种甲酰胺水解是公知的降解途径，并且影响 硫酸长春新碱注射液(VLSI)的稳定保质期。例如，VLSI溶液由于这种热不稳定 性不能被热灭菌，必须在冷藏温度下储存和运送以实现延长的稳定性。

因此，当前硫酸长春新碱脂质体注射液(VSLI)根据FDA批准的标签 (www.accessdata.fda.gov；参考ID:3172211，2012)上提供的指导在药房由单独 的组分制备。这些指导包括加热程序——需要使用水浴以实现长春新碱在鞘磷脂- 胆固醇脂质体中的有效封装和保持长春新碱的化学纯度。水的良好传热性质允许 大于95％的长春新碱封装，而无可观的药物化学降解。

由于VSLI是可注射药物，组分的生产和药房制备被严格控制以保持无菌。因 此，VSLI制备过程中的开放水浴的使用需要另外的物力、规划和设备(例如，浮 动环)，包括保持无菌环境的无菌罩或“洁净”间。在一些药房中，VSLI的配成 由于保持无菌环境的限制而无法完成。

因此，仍需要可有效且可再现地进行而不需当前所需的另外的物力和设备的 制备VSLI的改进方法。

发明概述

本发明至少部分基于避免在封装过程中使用加热水浴的需求的制备VSLI的 方法的建立。因此，本发明提供有效的、可再现的制备VSLI的方法，其可广泛应 用，并具有预料不到的简便性和减少的污染危险。

一方面，本发明描述了制备包括脂质体封装的无显著降解产物的长春新碱的 药学上可接受的液体组合物的方法，该方法包括步骤：(a)在单一瓶中配成(i) 第一溶液，包括硫酸长春新碱，浓度为约1mg/ml至约5mg/ml，其中第一溶液的 pH为约3.5至约5.5；和(ii)第二溶液，包括低pH的鞘磷脂/胆固醇脂质体；(b) 升高单一瓶中的配成溶液的pH至约7.0至7.5的pH；(c)在平衡在约75℃的干热 区块中加热包括配成溶液的单一瓶至少约13至约18分钟，其中所述加热区块包 括一个或多个孔——其大于单一瓶的平均长度或直径约1-5％，以产生包括配成的 脂质体封装式长春新碱的溶液；(d)平衡配成的溶液至室温；(e)用适于静脉内 给予的药物稀释剂稀释一定体积的、包括对于患者约1.5至约2.4mg/m²剂量的脂 质体封装式长春新碱的配成溶液，以产生药学上可接受的液体组合物；和(f)给 予药学上可接受的液体组合物至患者，其中配成的包括脂质体封装式长春新碱的 溶液包括(i)小于约2.5％的游离长春新碱；和(ii)小于约1.5％的N-脱甲酰基长 春新碱。

在一些实施方式中，包括硫酸长春新碱的第一溶液的pH为约4.5至约4.7。 在一个实施方式中，第一溶液进一步包括约100-200mg/ml浓度的甘露醇。

在一些实施方式中，包括脂质体的第二溶液的pH为约4.0。在一个实施方式 中，第二溶液进一步包括柠檬酸盐缓冲液。

在一些实施方式中，通过添加第三溶液升高配成溶液的pH，该第三溶液包括 pH约9.0的缓冲液。在一个实施方式中，第三溶液包括磷酸钠缓冲液。

在一些实施方式中，配成溶液包括约0.1/1.0至约0.2/2.0的硫酸长春新碱与脂 质的浓度比。

在一些实施方式中，配成溶液中的硫酸长春新碱的浓度为约0.1mg/mL至约 0.5mg/mL。在一些实施方式中，配成溶液中的硫酸长春新碱的浓度为约0.15 mg/mL至约0.2mg/mL。在一个实施方式中，配成溶液中的硫酸长春新碱的浓度为 约0.16mg/mL。

在一个实施方式中，第一溶液包括硫酸长春新碱USP(5mg/5mL)——等同 于4.5mg/5mL长春新碱游离碱、和500mg/5mL甘露醇，第二溶液包括鞘磷脂/ 胆固醇脂质体——由73.5mg/mL鞘磷脂、29.5mg/mL胆固醇、33.6mg/mL柠檬酸、 35.4mg/mL柠檬酸钠组成，和第三溶液包括355mg/25mL磷酸氢二钠和225mg/25 mL氯化钠。

在一些实施方式中，脂质体中鞘磷脂与胆固醇的比在约75/25mol％/mol％鞘磷 脂/胆固醇至30/50mol％/mol％鞘磷脂/胆固醇之间。在一些实施方式中，脂质体包 括约70/30mol％/mol％鞘磷脂/胆固醇至40/45mol％/mol％鞘磷脂/胆固醇。在一个 实施方式中，脂质体包括大约55/45mol％/mol％鞘磷脂/胆固醇。在另一实施方式 中，脂质体包括约60/40mol％/mol％鞘磷脂/胆固醇。

在一些实施方式中，脂质体的尺寸范围为约0.05-0.5微米。在一些实施方式中， 脂质体的平均直径为约50-200nm。在一个实施方式中，脂质体的平均直径为约 90-125nm。

在一些实施方式中，配成溶液的体积在约20-50mL之间。在一些实施方式中， 配成溶液的体积在30-35mL之间。

在一些实施方式中，在插入包含配成溶液的小瓶前，使加热区块平衡至75±2℃ 约15分钟。在一些实施方式中，将配成溶液在平衡在75±2℃的dri-block的口径 孔内加热约13-15分钟。在一个实施方式中，将配成溶液在平衡在75±2℃的 dri-block的口径孔内加热14分钟±30秒。

在一些实施方式中，加热区块中的孔比包含配成溶液的单一瓶的平均长度或 直径大小于(不到，less than)约3％。在一些实施方式中，包含配成溶液的单一 瓶的直径在约35.8至约37.3mm之间，并且加热区块中的口径孔呈圆柱形，其直 径为37.2至37.8mm之间的直径。

在一些实施方式中，配成的溶液平衡至室温至少约30分钟。

在一些实施方式中，将一定体积的、包括对于患者约1.5至约2.4mg/m²剂量 的脂质体封装式长春新碱的配成溶液用适于静脉内给予的标准药物稀释剂稀释， 以产生药学上可接受的液体组合物。在一些实施方式中，将患者计算剂量的体积 从灌注容器移除，并用计算体积的配成的VSLI溶液代替。

在一些实施方式中，将包括脂质体封装式长春新碱的药学上可接受的液体组 合物在配成后不多于24小时之内给予患者。

根据本发明的方法生成的VSLI一般给予患有癌症的患者。在一些实施方式 中，癌症是淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、脑癌或神经母细胞瘤。

在一些实施方式中，包括脂质体封装式长春新碱的药学上可接受的液体组合 物通过经约30至60分钟的时间静脉内灌注来给予。在一些实施方式中，包括脂 质体封装式长春新碱的药学上可接受的液体组合物通过每7-28日一次静脉内灌注 来给予。在一个实施方式中，包括脂质体封装式长春新碱的药学上可接受的液体 组合物通过每7日一次静脉内灌注来给予。

附图简述

图1是显示配成的包含硫酸长春新碱和鞘磷脂/胆固醇脂质体的溶液的、利用 干燥区块和水浴的内部加热曲线的图。

发明详述

本发明克服了与当前采用的制备VLSI的方法过程中的水浴使用相关的缺陷。 惊奇地发现，加热区块联合适应用于配成VSLI的容器而设计的定制设计插入物的 应用提供了实现均匀封装长春新碱而无显著降解所需的热曲线。

另外，本文描述的制备VSLI的方法证明参数释放的提高能力显著。由于VSLI 的稳定性保证了“适时”制备，配成过程一定是高效的和药剂师可再现的。药剂 师需要知道(即，参数方面)封装已经通过热诱导过程实现，因为其提供“基于 配成过程中收集的信息的复查和参数释放相关具体GMP要求的顺从性确认产物具 有预期质量的释放系统”(Annex 17EU指南)。

本发明的加热区块程序提供了便于和适于实现以大于95％的封装效率配成 VSLI的工艺。由于其涉及较少的步骤，操作失误的可能性减少。该工艺总体上更 直接，用时更少，耗用较少物力，并且便于常规制药操作。另外，制备VSLI的个 体无需处理水浴中生长的微生物的潜在微生物污染或加热水浴的水蒸气。

定义

除非另外特别注明，本文使用的所有技术和科学术语均具有治疗和药物科学 领域技术人员普遍理解的标准定义。

单数形式“a(一)”、“an(一)”和“the(所述)”包括复数参考，除非上下 文另外明确指示。

术语“包括”和“包含”按包括式、开放式意义使用，表示可包括另外的成 员。

术语“约”，具体地引出给定数量或数目，意为覆盖加减5％的偏差。

“无菌”组合物或容器，如本文使用，是利用USP无菌测试确定不含活的微 生物。(参见，"The United States Pharmacopeial Convention:2008)。

“脂质体”、“囊”和“脂质体囊”将被理解为表示具有封装水性内部的含脂 质膜的结构。除非另外指明，该结构可具有一层或多层脂质膜，虽然一般脂质体 仅具有一层膜。这种单层脂质体在本文中被称为“单层的”。多层脂质体在本文中 被称为“多层的”。

“标准”治疗剂或“游离”治疗剂指代不是脂质体封装的治疗剂。通常，药 物被认为是“标准的”或“游离的”，除非另外指定。但是，游离形式的标准长春 花生物碱仍可与其他试剂如其他化疗化合物、药物载体、或复合剂组合存在，即， 如本文所用，该术语仅具体地排除长春花生物碱的脂质制剂。

短语“适时”指代在给予患者前不久(例如，24小时或更少之内)组合药物 产物(例如，VSLI)的单独组分，以保持药物产物的质量(例如，最小化降解)。

“全身递送”，如本文所用，指代导致化合物在生物体内广泛生物分布的递送。 全身递送意为有用量，优选地治疗量的化合物暴露于身体的大部分。为获得广泛 生物分布，通常需要使得化合物在到达疾病位点前不被快速降解或清除(如通过 先经过器官(肝，肺，等)或通过快速非特定细胞结合)的引入途径。优选通过 静脉内递送实现脂质体封装式长春花生物碱的全身递送。

短语“治疗有效量”指代有效治疗哺乳动物的疾病或紊乱(例如，癌症)，例 如，导致疾病稳定、癌状态部分缓解或完全缓解的药物(例如，VSLI)量。

“疾病稳定”，如本文所用，指代这样的状态：其中药物(例如，VSLI)的给 予导致，通过标准临床、放射学和/或生物化学手段测定，肿瘤或癌症的生长或流 行停止，虽然癌的尺寸或流行性没有消退或减少。

“部分响应”或“部分缓解”指代通过标准临床、放射学和/或生物化学手段 测量的响应治疗的癌状态改善。一般，“部分响应”意为肿瘤尺寸或癌症指示血液 标记物的水平自基线水平响应治疗减少(例如，20％、30％、40％或50％)。例如， 基于国际工作组标准(国际工作组(International Working Group，IWS)标准；BD  Cheson等，J Clin Oncol 15:4642-4649)评估血癌治疗的响应。

“完全响应”或“完全缓解”意为测量的癌状态，例如，肿瘤尺寸和/或癌症 标记物水平，在治疗后检测不到。

“神经毒性”包括治疗前和治疗期间的神经病的症状，如感觉减退、感觉过 敏、感觉异常、反射减退、反射消失、神经痛、颌疼痛、振动感减少、颅神经病、 肠梗阻、灼热感、关节痛、肌痛、肌肉痉挛、虚弱和/或直立性低血压。直立性低 血压可能发生。神经毒性基于国家癌症研究所(National Cancer Institute NCI)不 良事件常见术语标准(Common Terminology Criteria for Adverse Events，CTCAE) 4.03版(http://ctep.cancer.gov/reporting/etc.html)被评估为1级至3级。

硫酸长春新碱

硫酸长春新碱是从长春花植物(Catharanthus roseus)原始分离的长春花生物 碱家族成员。硫酸长春新碱具有细胞周期特异性抗癌活性。长春花生物碱结合于 微管蛋白，改变微管蛋白聚合，导致中期停顿、细胞有丝分裂抑制和细胞死亡。 作为细胞周期特异性试剂，其治疗响应被脂质体封装促进，脂质体封装保持了延 长的药物水平。细胞至长春新碱(以及其他细胞周期特异性药物)的延长暴露已 显示增强药物的体外细胞毒性(Bfurris等，JNCI 84；1816-1826，1992；Georgiadis 等，Clin Cancer Res 3:449-454，1997；Jackson和Bender，Cancer Res 39:4346-4349， 1979)。

硫酸长春新碱通常分离成1:1硫酸盐。其是可溶于水的吸湿性白色至淡黄色晶 体粉末。其分子量为923.04(盐形式)/824.98(碱形式)，并且分子式为 C₄₆H₅₆N₄O₁₀·H₂SO₄。硫酸长春新碱的化学名称为22-氧代长春碱 (vincaleukoblastine)，并且其具有下列化学结构：

硫酸长春新碱规定为硫酸长春新碱注射USP(例如，为1mg/mL溶液)，也被 称为leurocristine sulfate、Kyocristine、vincosid、vincrex、Oncovin、Vincasar可购自很多来源中的任一个。

脂质体

本发明的脂质体载体组分由鞘磷脂和胆固醇脂质体注射液(SCLI)组成。脂 质体中存在的鞘磷脂与胆固醇的比可不同，但通常在75/25mol％/mol％鞘磷脂/胆 固醇至30/50mol％/mol％鞘磷脂/胆固醇的范围内。在一个实施方式中，脂质体组 合物包括约70/30mol％/mol％鞘磷脂/胆固醇至40/45mol％/mol％鞘磷脂/胆固醇。 在另一实施方式中，脂质体组合物包括大约55/45mol％/mol％鞘磷脂/胆固醇。在 再一实施方式中，脂质体组合物包括约60/40mol％/mol％鞘磷脂/胆固醇。

在某些实施方式中，制剂中可存在另外的脂质，例如，以防止脂质氧化或使 配体附接到脂质体表面上。通常，包含其他脂质会导致鞘磷脂/胆固醇比减少。

用于本发明的鞘磷脂/胆固醇脂质体可以是多层的或单层的。适于制备脂质体 的方法包括但不限于，声处理、挤出、高压/同质化、微流化、洗涤剂透析、钙诱 导的小脂质体囊融合、薄膜蒸发和醚灌注法，其全部在本领域公知。例如，多种 方法可用于制备脂质体，如下列所述：例如，Szoka等,Ann.Rev.Biophys.Bioeng., 9:467(1980)、美国专利号4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、 4,501,728、4,774,085、4,837,028、4,946,787、5,543,152、6,723,338、WO 91/17424、 Deamer and Bangham,Biochim.Biophys.Acta,443:629634(1976)；Fraley等,Proc. Natl.Acad.Sci.USA,76:33483352(1979)；Hope等,Biochim.Biophys.Acta,812:55 65(1985)；Mayer等,Biochim.Biophys.Acta,858:161168(1986)；Williams等,Proc. Natl.Acad.Sci.,85:242246(1988),the text Liposomes,Marc J.Ostro,ed.,Marcel  Dekker,Inc.,New York,1983,第1章,和Hope等,Chem.Phys.Lip.,40:89(1986)，其 全部被引入本文作为参考。

在脂质体制备后，脂质体可利用本领域公知的标准方法(例如，参见US 6,723,338)被设定尺寸以实现期望的颗粒尺寸范围。一般地，可用于本文描述的 VSLI制备的脂质体的尺寸范围为约0.05-0.5微米(50-500nm)、0.2-0.4微米 (200-400nm)、约0.1-0.4微米(100-400nm)、约0.05-0.2(50-200nm)或约0.5 (500nm)至约0.15微米(150nm)。在某些实施方式中，脂质体的颗粒尺寸的平 均颗粒直径为约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm、约100nm、 约105nm、约110nm、约115nm、约120nm、约130nm、约140nm、约150nm、 约160nm、170nm、约180nm、约190nm、或约200nm。在一个实施方式中， 平均颗粒尺寸在90和125nm之间，而优选平均颗粒尺寸为约107.5nm，其中25％ 的颗粒尺寸分布不小于70nm并且其中90％的分布的颗粒尺寸不大于170nm。

鞘磷脂/胆固醇脂质体充当用于本文描述的VSLI制备物的脂质体组分，并且 被制成脂质体内部具有低pH。在配成过程中，将具有低pH的VSI和具有低pH 的SPLI在较高pH的缓冲液中稀释，从而外部VSLI溶液的最终pH为大约生理中 性。结果是产生跨脂质膜的pH梯度，其中脂质体内核的pH低于外部周围溶液。 这种梯度按照已知的方法(例如，US 6,723,338)来实现。例如，梯度可通过如下 实现：在存在具有约2和约6之间的pH、约3和约5之间的pH的缓冲液的情况 下配制脂质体，和随后将脂质体转移至较高pH，例如，约7.0至约7.5。在一个实 施方式中，脂质体的内部pH为约4.0。可使用任何数量的稀释缓冲液，如磷酸钠。 在一个实施方式中，缓冲液的pH为8-10，优选9.0，使得最终稀释的外部脂质体 溶液在与VSI和SPLI混合时具有生理中性的pH。

在根据本文描述的方法用于制备VSLI前，可将SPLI脂质体长期储存在冷藏 条件下，然后进行药物封装和VSLI配成，以给予患者。可选地，可将脂质体脱水， 储存，然后重新水化，然后再按照公知的方法使用(参见，例如，美国专利5,077,056 或5,736,155)。

VSLI制备

利用严格的无菌技术制备VSLI，例如，在生物安全柜中或通过已建立的制备 无菌可注射制剂和危险药物的制药安全程序。必须严格遵守处理和处置抗癌药物 的程序(NIOSH Alert:Preventing occupational exposure to antineoplastic and other  hazardous drugs in healthcare settings.2004.U.S.Department of Health and Human  Services,Public Health Service,Centers for Disease Control and Prevention,National  Institute for Occupational Safety and Health,DHHS(NIOSH)公开号2004-16；OSHA  Technical Manual,TED 1-0.15A,第VI节：第2章.Controlling Occupational Exposure  to Hazardous Drugs.OSHA,1999；American Society of Health-System Pharmacists. ASHP guidelines on handling hazardous drugs.Am J Health-Syst Pharm.(2006)63: 1172-1193；Polovich M,White JM,Kelleher LO(eds.)2005.Chemotherapy and  biotherapy guidelines and recommendations for practice(第二版)Pittsburgh，PA: Oncology Nursing Society)。

制备配成的VSLI的过程包括下列主要步骤：

·通过如下制备配成溶液：在无菌容器中混合硫酸长春新碱第一溶液，该硫酸 长春新碱在缓冲液中包含约1mg/mL、约2mg/mL或约5mg/mL之间，该缓冲液 包含约100至约200mg/mL甘露醇(也可使用硫酸长春新碱在其中保持稳定的其 他药学上可接受的赋形剂)，pH为约3.5至约5.5、或约4.5至约4.7，与脂质体第 二溶液，该脂质体在低pH(例如，约4.0)下悬浮于缓冲液中，以适当浓度比， 例如，0.1/1.0至0.2/1.0(硫酸长春新碱重量/脂质重量)。

·然后将包含硫酸长春新碱和脂质体的配成溶液的pH升高至约7.0至约7.5， 以产生pH梯度。这可通过如下实现：例如，添加较高pH(例如，约9.0)的缓冲 液(例如，磷酸钠)。

·然后将配成溶液在平衡至约75℃的干热区块中加热至少约13至约18分钟， 该干热区块包含比包含配成溶液的容器的平均长度或直径大小于约5％的口径孔， 以产生配成的产物VSLI。

·然后将加热后的、包括配成产物的配成溶液平衡至少约30分钟、至少约45 分钟或至少约60分钟至室温(15℃至30℃)。

·然后将对应于给予患者的配成的VSLI的剂量的一定体积的配成溶液与适于 静脉内给予的溶液混合至最终体积约100mL。

在一些实施方式中，在三个单独的容器中提供硫酸长春新碱溶液、脂质体溶 液和高pH缓冲溶液。在某些实施方式中，将这三种溶液组合到一个无菌容器，该 无菌容器具有包容溶液组合体积的容量，例如，约20-50mL、约25-40mL、或约 30-35mL。

在一个实施方式中，以试剂盒提供单独的组分，该试剂盒包括3个或更多个 小瓶。其中至少一个小瓶包含长春新碱溶液，包含处于缓冲液中的例如1mg/mL、 2mg/mL、或5mg/mL硫酸长春新碱，该缓冲液包含例如，100或200mg/mL甘露 醇(也可使用药学上可接受并且其中长春新碱长期保持稳定的其他赋形剂)；并且 被调节至pH 3.5至5.5、或优选pH 4.5至pH 4.7。其中一个小瓶包含包括鞘磷脂和 胆固醇脂质体的溶液，该鞘磷脂和胆固醇脂质体悬浮于例如pH 4.0的300mM柠 檬酸盐缓冲液。另外的一个或多个小瓶包含碱性磷酸盐缓冲液(例如，pH 9.0)， 如磷酸氢二钠，14.2mg/ml(20ml/瓶)。

在一个实施方式中，用于配成VSLI的成分被分别提供在三个小瓶中，该小瓶 包含(i)硫酸长春新碱USP(5mg/5mL)，等同于4.5mg/5mL长春新碱游离碱， 和500mg/5mL甘露醇；(ii)鞘磷脂/胆固醇脂质体注射液(SPLI)，由73.5mg/mL 鞘磷脂、29.5mg/mL胆固醇、33.6mg/mL柠檬酸、35.4mg/mL柠檬酸钠和不多于 0.1％乙醇组成；和(iii)磷酸钠注射液(SPI)，包含355mg/25mL磷酸氢二钠和 225mg/25mL氯化钠，其全部用水制备，用于注射。

用于本发明方法的容器是无菌的，并且由任何药学上可接受的物质(例如， 玻璃或塑料)组成。存在多种不同的小瓶类型，并且其被设定尺寸，由很多不同 的生产商(例如，Wheaton Products，Thomas Scientific)销售。在一个实施方式中， 在无菌小瓶中配成组分，其平均直径为约36.5mm，和平均范围为约35.8至约37.3 mm。

适当的干燥区块加热器，其提供安全、干燥的恒温来源，可购自很多来源(例 如，Bibby Scientific Ltd、V&P Scientific，Inc.、Fisher Scientific Inc.、VWR Scientific， Thermolyne Inc.)。具有一个或多个适于接收配成溶液的容器的校准孔导热插入物 可以是金属(例如，阳极化铝、铜)或其他适当的导热材料。包含适当尺寸的开 口的孔的插入物可容易获得(例如，V&P Scientific，Inc.)、或利用标准方法制成。 在某些实施方式中，加热区块包含比包含配成溶液的容器的平均长度或直径大约 1-5％之间、或约4.5％、4.2％、4.0％、3.8％、3.5％、3.3％、3.0％、2.8％、2.5％、 2.2％、2.0％、1.8％、1.5％、1.2％或1.0％的开口。在一些实施方式中，加热区块包 含圆柱形开口。在一个实施方式中，开口直径在37.2至37.8mm之间、或在约37.4 至37.6mm之间。

在一些实施方式中，将配成溶液在约75℃下加热约13分钟、约14分钟、约 15分钟、约16分钟、约17分钟。在一个实施方式中，将配成溶液在平衡在75℃ 的加热区块处加热约14分钟。

可将配成的VSLI与药学上可接受的适于静脉内给予患者的稀释剂(例如，葡 萄糖、氯化钠)混合，该稀释剂可被提供在例如预填充的无菌容器(玻璃瓶、塑 料瓶或塑料袋)中。在一些实施方式中，将患者计算剂量的体积从灌注袋移除， 并用计算体积的配成的VSLI溶液代替进入灌注袋，例如，其中灌注容器的最终体 积为100mL。在一个实施方式中，药学上可接受的稀释剂为5％葡萄糖注射液或 0.9％氯化钠注射液。

VSLI

根据本文描述的方法生成的VSLI呈现为白色至米白色、半透明悬浮液，基本 上不含可见异物和聚集物。一般，大于约95％、约96％、约97％、约98％或更多 的硫酸长春新碱被封装在脂质体中。

根据本文描述的方法生成的VSLI包含的杂质总量小于约4.0％、3.5％、3.4％、 3.2％、3.1％或3.0％。在一些实施方式中，VSLI包含小于约2.0％、1.8％、1.7％、 1.6％、1.5％、1.4％或1.3％的N-脱甲酰基长春新碱。

根据本文描述的方法生成的VSLI的平均体外释放速率(IVR)或体内释放速 率为在72小时内至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、 84％或约85％。

确定长春新碱封装水平、杂质水平和长春新碱自脂质体的释放速率的试验在 本领域已知。参见，例如，美国专利5543152和5837282；Zhigalstev等，J.Controlled  Release 104:103-111，2005)；Puscalau等,Am.J.Health-Syst.Pharm.62:1606-1612， 2005)。

总体而言，根据本文描述的方法生成的VSLI包含约0.1mg/mL至约0.5mg/mL 的硫酸长春新碱。在某些实施方式中，硫酸长春新碱以约0.15mg/mL至约0.2 mg/mL存在。在一个实施方式中，硫酸长春新碱以约0.16mg/mL存在。在一个实 施方式中，VSLI包含5mg硫酸长春新碱、500mg甘露醇、73.5mg鞘磷脂、29.5 mg胆固醇、36mg柠檬酸钠、38mg柠檬酸、355mg磷酸钠、和225mg氯化钠。

剂量和给药

根据本文描述的方法制备的VSLI可用于治疗任何类型的癌症，包括原发性、 复发性和顽固性癌症。用VLSI治疗的患者或对象可以是多种动物，包括人、非人 灵长类、鸟类、马类、犬类、猫类、牛类、猪、兔类、啮齿类及类似物。在某些 实施方式中，VSLI用于治疗血液和淋巴系统的癌症，包括但不限于，淋巴瘤、白 血病和骨髓瘤。在某些实施方式中，VSLI用于治疗肿瘤，包括但不限于，神经母 细胞瘤和脑癌。

VSLI可作为单剂使用，或组合其他化疗剂使用，如环磷酰胺、阿霉素和/或泼 尼松。在一个实施方式中，VSLI与环磷酰胺、阿霉素和泼尼松一起作为脂质体 CHOP制剂(“lipo-CHOP)给予。在另一实施方式中，VSLI与至少一种另外的抗 肿瘤剂被共同给予。在另一实施方式中，另外的抗肿瘤剂是抗肿瘤单克隆抗体， 如Oncoly^TM、Rituxan^TM、或Bexxar^TM。在另一实施方式中，另外的抗肿瘤剂是反 义药物或抗肿瘤疫苗。在另一实施方式中，VSLI与神经毒性的预防性或治疗性治 疗，如加巴喷丁(gabapentin)(Neurontin^TM)，被共同给予。

一般，在给予患者约24小时之内制备VSLI，并储存在室温下(15℃至30℃) 或冷藏(2-8℃)。

将VSLI通过静脉内递送全身地给予患者。在一个实施方式中，经例如约30 分钟、约45分钟、约60分钟、约90分钟或更长的时间通过静脉内灌注给予VSLI。

一般周期性给予VSLI，例如，每7-28日一次。在某些实施方式中，VSLI每 3、5、7、10、14、21或28日给予一次。在一个实施方式中，每14日通过静脉内 灌注给予VSLI。在另一实施方式中，每7日通过静脉内灌注给予VSLI。如本文 所用，每次给予VSLI都被认为是治疗的一个“疗程”。

每剂量给予的VSLI量取决于多个因素，如患者医疗史、其他治疗手段的应用、 和疾病性质(例如，原发性(first line)、复发性或顽固性癌症)。一般，根据本文 描述的方法制备的VSLI以约1.4至约2.4mg/m的剂量给予。在某些实施方式中， VSLI以约1.5mg/m²、约1.8mg/m²、约2.0mg/m²、2.1mg/m²、2.2mg/m²、2.3mg/m²或2.4mg/m²(即，mg长春新碱/m²身体表面积)的剂量给予。在一个实施方式中， VSLI每7日一次通过静脉内灌注经约60分钟以2.25mg/m²的剂量给予。

在其他实施方式中，VSLI的剂量可在治疗过程中被暂时中断和/或减少。例如， 在一个实施方式中，给予表现为3级外周神经病或持续性2级外周神经病的患者 的VSLI剂量可中断上至约7日，然后在恢复至1级或2级后减少至约2mg/m²的 剂量。在另一实施方式中，给予甚至在接受减少剂量后还表现为持续性2级外周 神经病的患者的剂量可中断上至7日，然后减少至1.825mg/m²的剂量、或1.5mg/m²的剂量。

VSLI的剂量通过根据公知的方法计算对象的身体表面积(BSA)来确定。例 如，根据Mosteller公式，其中BSA等于以kg表示的对象重量乘以以cm表示的 身高的乘积除以3600的平方根。人的“标准”BSA通常取为1.7m²，但也取决于 其他因素，包括个体年龄和性别。例如：

·成年男性的平均BSA：1.9m²

·成年女性的平均BSA：1.6m²

·儿童(9岁)的平均BSA：1.07m²

·儿童(10岁)的平均BSA：1.14m²

·儿童(12-13岁)的平均BSA：1.33m²

(Mosteller RD.Simplified calculation of body-surface area。N Engl J Med 1987； 317:1098)

实施例

实施例1

考察在干燥区块法加热的过程中的VSLI小瓶溶液的温度曲线，并与按照 的获批标签指导(FDA/cder参考ID:3172211，2012年8月)水浴加热 时观察到的温度曲线进行比较。

设备和材料

·试剂盒，配成的VSLI，lot NT 268035(部分使用小瓶的内含物组合 到一个小瓶中)

·TechneDB-3加热器，配备有1.480”直径孔和温度计套(Bibby  Scientific Limited)。

·数字温度计；在0℃-100℃的范围内精确到±1℃

·Isotemp 202#00947水浴(Fisher Scientific)

·Fluke 726#914002热电偶温度校准器(Fluke Corporation)

程序

通过记录置于加热设备(即，干燥区块或水浴)后小瓶内部的溶液温度生成 温度曲线测量结果。零时是小瓶置于加热设备的时间点。采用下列程序：

1.将组分VSI和SCLI组合到单个SPI小瓶(Swiss Precision Instruments，Inc.) 中。将数字热电偶插入小瓶的隔垫，并保持在距小瓶底面大约5mm且定位在液体 溶液中央。

2.使用干燥区块加热器，其具有包含1.480英寸小瓶容器孔的区块。通过将 温度计置于区块的温度计孔中来监测区块温度，该温度计孔的位置接近小瓶容器 孔。将区块加热器设定至75℃温度，并允许其升温直到区块温度计读数为75±2℃。 使加热区块在75±2℃平衡最少15分钟。然后将小瓶插入75±2℃平衡区块的孔中 14分钟±15秒，然后取出。通过置于环境条件中约60分钟使配成的小瓶达到环境 温度。利用同一小瓶，程序重复两次。

3.以1分钟间隔(或按照说明)记录小瓶内部液体温度和区块温度，并列表 于表1。

4.作为比较，允许加热水浴直到水温为65±5℃。使水浴平衡最少15分钟。 然后将包含配成的VSLI的小瓶插入水浴10分钟±1分钟，然后取出。使配成的小 瓶达到环境温度。

5.记录小瓶内部液体温度、时间和水温度，并列表于表1。

结果和讨论

用平衡在75℃±2℃的干燥区块加热配成的VSLI小瓶的液体内含物的温度曲 线证明：加热速率均匀且渐进至65℃±5℃。表1和图1列出的结果显示，干燥区 块以平均速率3.26℃/分钟加热液体小瓶内含物，与之相比，水浴以平均速率4.21℃/ 分钟加热小瓶内含物。65℃±5℃的期望温度在干燥区块中在14分钟内实现，与之 相比水浴耗费10分钟。关于这两种加热设备，在将小瓶从加热源取出后，存在逐 渐冷却。从干燥区块中取出后，温度保持在59-65℃内3-4分钟，而从水浴取出后， 保持1-2分钟。关于这两种设备，利用干燥区块，小瓶暴露于50-65℃至少20分钟， 而利用水浴，小瓶暴露15分钟。在任一设备中加热后，溶液保持视觉一致：白色 至米白色、半透明悬浮液，基本上不含可见异物和聚集物。

表1.配成温度曲线*

时间 内部温度HB 区块温度 内部温度HB 区块温度2 内部温度WB 水浴 0 20.3 75.3 22.8 75.4 20.9 63.8 1 25.6 74.7 29.9 74.8 35.4 63.8 2 31.6 74.0 36.1 74.0 45.6 63.9 3 37.0 73.5 41.3 73.6 51.7 63.4 4 41.9 73.3 45.5 73.4 56.1 63.7 5 46.2 73.2 49.1 73.4 58.8 63.5 6 49.8 73.2 52.4 73.4 60.3 64.0 7 53.0 73.3 55.2 73.4 61.3 64.4 8 55.6 73.4 57.5 73.5 62.2 64.0 9 57.9 73.6 59.7 73.8 62.7 63.8 10 60.8 73.8 61.4 73.9 63.0 63.8 11 62.1 73.9 62.8 74.1 59.0 NR 12 63.3 74.1 64.4 74.2 56.6 NR 13 64.6 74.1 65.4 74.3 54.8 NR 14 65.8 74.3 66.4 74.4 53.1 NR 15 65.6 NR 66.1 NR 52.0 NR 16 64.1 NR 63.7 NR 51.2 NR 17 62.7 NR NR NR 50.3 NR 18 61.2 NR 60.6 NR 49.3 NR 19 59.8 NR 59.3 NR 48.7 NR 20 58.6 NR 58.0 NR 48.0 NR 21 57.4 NR 56.5 NR NR NR 22 56.1 NR 55.3 NR NR NR 23 55.0 NR 54.2 NR NR NR 24 53.9 NR 53.2 NR NR NR 25 52.8 NR NR NR 44.4 NR 26 51.7 NR NR NR NR NR 27 50.8 NR NR NR NR NR 28 49.8 NR NR NR NR NR   NR NR NR NR NR NR 33 45.6 NR NR NR NR NR 38 42.3 NR NR NR NR NR 43 39.4 NR NR NR NR NR 48 37.3 NR NR NR NR NR 53 35.3 NR NR NR NR NR 58 33.9 NR NR NR NR NR 60 33.3 NR NR NR NR NR

*内部温度HB＝：在干燥区块中加热的小瓶内含物的内部温度

内部温度WB＝：在水浴中加热的小瓶内含物的内部温度

NR＝未记录

结论

本研究证明，干燥区块验证了使VSLI小瓶内部液体温度在14分钟内实现65 ℃±5℃的适当温度加热曲线，并提供了20分钟的50-65℃范围内的加热暴露。与 之相比，在水浴中加热小瓶在10分钟内实现了65℃±5℃的内部液体温度和15分 钟的50-65℃范围内的总体加热暴露。两种方法的加热速率均是渐进的和均匀的。 设定在75℃±2℃的干燥区块产生3.26℃每分钟的加热速率，而设定在65℃±5℃的 水浴产生4.21℃每分钟的速率。利用水浴加热平稳，而干燥区块中的加热速率以 稳定速率持续至75℃±2℃设定点。在将小瓶从任一加热设备取出后，冷却至环境 温度耗费约60分钟。这些加热曲线表明，长春新碱的接近的定量封装是个热力学 过程，其取决于暴露于促进膜封装而非实现那些条件的动力学的温度的总体暴露。

总之，干燥区块和水浴可提供允许将长春新碱封装到鞘磷脂胆固醇脂质体中 以有效制备VSLI的热力学特征。

实施例2

考察利用干热区块配成的VSLI的长春新碱降解物产物水平。

设备和材料：

·Techne DB-3配备有1.480”直径孔和温度计套。

·直径不大于7mm并且在0-100℃范围内精确至±1℃的温度计。

·校准秒表或计时器

·测微器(0-2”)或等同设备。

·30Kits，Lot#TTX0611(Talon Therapeutics，Inc.)

程序

来自30试剂盒(具有最大和最小外径的SPI小瓶)的小瓶用于本研 究。测量SPI小瓶的直径并记录至最接近0.001”。结果显示在表2中。

表2.小瓶鉴定和SPI小瓶直径

小瓶鉴定 SPI小瓶直径(±0.0001in.) 研究分配 1 1.4350   2 1.4360   3 1.4340   4 1.4350   5 1.4490   6 1.4455   7 1.4330   8 1.4370   9 1.4350   10 1.4315   11 1.4405   12 1.4545 试剂盒2 13 1.4335   14 1.4370   15 1.4430   16 1.4380   17 1.4345   18 1.4305 试剂盒1 19 1.4330   20 1.4455   21 1.4360   22 1.4325   23 1.4425   24 1.4465   25 1.4475   26 1.4325   27 1.4420   28 1.4440   29 1.4315   30 1.4330  

选择两个小瓶用于配成。直径最接近或等于1.41英寸的小瓶(“小瓶1”)，允 许的SPI小瓶直径的下端的测量直径为1.4305英寸。直径最接近或等于1.47英寸 的小瓶(“小瓶2”)，允许的SPI小瓶直径的上端经测量直径为1.4545英寸。

如上所述配成选择的试剂盒，并按照适当的硫酸长春新碱注射液USP方法针 对硫酸长春新碱、相关化合物和颗粒尺寸和分布进行测试。

利用上述指导配成两个研究试剂盒，除了用具有包含1.480英寸小瓶容器孔的 区块的Dri-Block加热器代替水浴之外。通过将温度计置于位于小瓶容器孔邻近的 区块温度计孔中来监测区块温度。将区块加热器设定至75℃温度，并使其加热， 直到区块温度计读数为75±2℃。然后使加热区块平衡最少15分钟(记录时间)。 条件在表3中说明。然后将各小瓶插入75±2℃加热区块14分钟±15秒(记录时间)， 然后取出，并通过将小瓶置于环境条件约60分钟使其达到环境温度。

记录配成期间的时间和区块温度，如表4所示。分析结果记录在表5、6和7 中。

表3.干燥区块温度平衡

  时间 相继读数之间的时间 设定至75℃的干燥区块 8：35AM   第一例温度计读数75±2℃ 8：46AM 73.0℃ 15分钟平衡 9：01AM 75.2℃

表4.干燥区块配成参数

表5.总量&游离长春新碱结果

表6.相关化合物结果

试剂盒ID N-脱甲酰基长春新碱 任何其他化合物 试剂盒1 1.314 0.572 试剂盒2 1.345 0.574

表7.粒径分布

试剂盒ID 平均直径 D₂₅D₉₀试剂盒1 108nm 90nm 139nm 试剂盒2 107nm 91nm 138nm

结果和讨论

利用Dri-Block加热器、利用直径为1.4305和1.4545英寸的配成小瓶来实现 VSLI的配成。这些代表最接近小瓶直径容许的1.41英寸下限和1.47英寸上限的 小瓶。在加热区块中14分钟温育VSLI小瓶的过程中，区块温度由于区块孔直径 和小瓶任一直径之间的间隙之间的温度平衡造成的下降不大于1度。这种传热动 力学不影响VSLI的制备。暴露于平衡在75℃的Dri-Block热14分钟后，从两个 小瓶的所得的配成的VSLI均实现大于97％的长春新碱封装。利用Dri-Block的温 育导致封装效率平均为2.175％游离长春新碱。通过Dri-Block加热曲线没有观察到 新的或增加的杂质。观察到主要降解物，N-脱甲酰基长春新碱，平均为1.33％，无 其他大于0.574％的杂质，并且杂质总量不大于3.10％。颗粒尺寸分布与VSLI规格 一致，平均直径为直径107.5nm，平均D₂₅为90.5nm，和平均D₉₀为138.5nm， 通过IVR分析，通过Dri-Block加热制备的VSLI通过72小时释放大约84％的长 春新碱。

总之，利用平衡在75±2℃的干燥区块加热器、以14分钟±15秒温育期配成的 VSLI使大于99％的长春新碱封装在鞘磷脂-胆固醇脂质体中，并且此实验过程中无 异常记录。数据建立了导致产物有效封装长春新碱并且证明干燥区块加热器在 VSLI配成时可代替水浴的干燥区块配成温度曲线。

实施例3

在本研究中，测量长春新碱降解物产物水平，以提供利用干燥区块程序的配 成时间范围。

设备和材料

·配备有1.476”(±0.004)直径孔和温度计套。

·温度计，直径不大于7mm，并且在0-100℃的范围内精确至±1℃。

·校准秒表或计时器

·试剂盒，Lot#TTX0611(Talon Therapeutics，Inc.)

程序

随机选择三种试剂盒，并通过在干燥区块中在75℃下以三个不同时 间(分别为13、14和15分钟)加热来配成。利用适当的硫酸长春新碱注射液USP 方法测试配成的小瓶的总量和游离硫酸长春新碱、相关化合物、颗粒尺寸和分布。

利用上述指导配成本研究试剂盒，除了用具有包含1.476英寸(±0.004”)小 瓶容器孔的区块的加热器代替水浴之外。通过将温度计置于位于小瓶容 器孔邻近的区块温度计孔中来监测区块温度。将区块设定至75℃温度，并使其加 热，直到区块中的温度计读数为75±2℃。然后使加热区块平衡最少15分钟。条件 记录在表9中。然后将各小瓶插入75±2℃加热区块分别13分钟±15秒、14分钟±15 秒、和15分钟±15秒。然后取出小瓶，并置于环境温度。使配成后的小瓶在环境 温度下冷却至少60分钟，然后测试。

记录配成期间的时间和区块温度，如表9和10所示。分析结果记录在表11、 12和13中。

表9a.干燥区块温度平衡(小瓶1)

  时间 相继读数之间的时间 设定至75℃的干燥区块 8：20AM   第一例温度计读数75±2℃ 8：48AM NA 15分钟平衡^*9：03AM 15mins.

*15分钟平衡期结束时的温度：75.2℃

表9b.干燥区块温度平衡(小瓶2)

  时间 相继读数之间的时间 设定至75℃的干燥区块 9：17AM   第一例温度计读数75±2℃ 9：17AM NA 15分钟平衡^*9：32AM 15mins.

*15分钟平衡期结束时的温度：75.2℃

表9c.干燥区块温度平衡(小瓶3)

  时间 相继读数之间的时间 设定至75℃的干燥区块 9：47AM   第一例温度计读数75±2℃ 9：47AM NA 15分钟平衡^*10：02AM 15mins.

*15分钟平衡期结束时的温度：75.1℃

表10.干燥区块配成参数

表11.总量&游离长春新碱结果

试剂盒ID 长春新碱总量 试剂盒1 100.91 试剂盒2 100.59 试剂盒3 100.43

表12.相关化合物结果

试剂盒ID N-脱甲酰基长春新碱 任何其他化合物 试剂盒1 1.498 0.590 试剂盒2 1.506 0.587 试剂盒3 1.464 0.593

表13.颗粒尺寸分布

试剂盒ID 平均直径 D₂₅D₉₀试剂盒1 107nm 91nm 137nm 试剂盒2 106nm 90nm 137nm 试剂盒3 107nm 90nm 138nm

结果和讨论

各配成的试剂盒分别被置于平衡在75℃的加热区块13、14和15分钟。全部 样本时间均产生封装的长春新碱，并且三个小瓶的测试结果之间不显示显著差异。 利用Dri-Block的三个小瓶均观察到大于97％的长春新碱封装，导致封装效率最大 为2.3％游离长春新碱。关于Dri-Block加热曲线未观察到新的或增加的杂质。观察 到主要降解物N-脱甲酰基长春新碱的最大值为1.51％，无其他大于0.59％的杂质， 杂质总量不大于3.3％。颗粒尺寸分布与VSLI规格一致，其平均直径为直径107nm， 平均D₂₅为90nm，和平均D₉₀为137nm。

总之，用平衡在75±2℃的Dri-Block代替水浴、以13至15分钟(±15秒)的 温育期配成的VSLI有效封装长春新碱，并且实验进行期间无异常记录。数据建立 了导致有效VSLI配成和显示Dri-Block加热器在VSLI配成中可代替水浴的 Dri-Block配成温度曲线。

应该理解，本文描述的实施例和实施方式仅以示例为目的，基于此各种改动 和改变被暗示给本领域技术人员，并且将被包括在本申请的精神和范畴以及所附 权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请其全部内容均被并 入本文作为参考，用于所有目的。