一类新的荧光探针及其在偶氮降解中的应用

摘要

本发明公开了一类新的荧光探针及其在偶氮降解中的应用。荧光探针，其结构如式1或式2所示。本发明以偶氮染料为目标化合物，以偶氮染料脱色菌株为实验客体，首次将荧光探针技术应用于示踪微生物降解可视化中，利用荧光标记示踪偶氮染料在细菌细胞内降解的显色过程，阐明微生物细菌细胞对偶氮染料分子的捕获和降解转移特点。该研究的开展将建立一套全新的基于化学荧光标记技术的微生物降解转化研究模式，更生动直观地展示微生物降解转化污染物的动力学过程，揭示化合物结构与微生物细胞捕获降解能力的相关性，为可生物降解性化合物的设计和开发提供科学理论指导，从源头减少难降解有毒污染物的产生。

说明书

技术领域：

本发明属于偶氮染料处理领域，具体涉及一类基于萘酰亚胺与偶氮染料通过柔性碳链相连的新的荧光探针及其在偶氮降解中的应用。

背景技术：

随着工农业生产的发展，减少持久性有机物对环境的污染及带来的危害越来越引起人们的重视。利用生物修复技术减少环境中有毒有害物质，远好于传统的物理、化学修复技术，被认为是目前最有前景的降解手段。长期以来科学家不断地从不同角度开展有机物污染物生物降解研究。一方面，筛选和驯化降解各类有机物的特殊菌种方面进行研究，另一方面，在有机物的生物降解途径机理方面开展了大量的研究工作，探知促使污染物降解的酶或酶系以及编码这些降解酶或酶系的基因，从而利用基因工程技术构建遗传工程菌。

对细菌降解过程研究，结果发现所分离纯化到的酶是决定因素，生物酶对化合物的降解速率是关键，是生物降解能力的评价标准，所以对降解酶的分离纯化和鉴定是现在研究工作的重点。但现存的问题是，虽然微生物中主要降解物—酶，比较清楚，但微生物细胞与降解物之间相互选择性还是比较模糊。微生物对被降解物分子结构选择，被降解物质分子性质和大小等因素对降解过程都有很大的影响。如果通过对被降解物在细菌降解过程的可视化分析，研究被降解物与细菌细胞作用发生的位点—细胞内质降解或者细胞外降解，荧光出现速度的不同，探讨被降解物结构性质与细菌细胞作用规律，这些研究将对生物降解的应用产生重要的影响，并为设计和开发在自然环境中易于被微生物捕获降解的化合物，从源头上降低难降解有毒性化合物对生态环境的破坏具有重要的指导意义。

偶氮染料分子结构中含有偶氮键(-N＝N-)的化合物，是一类难于生物降解的重要的生产染料，直接排放于水体中将对生态环境构成威胁、对人体健康造成危害。对于细菌偶氮还原机理的研究，尤其国内的研究，基本上处于筛选具有偶氮脱色能力的菌株和优化脱色条件的水平上，国际上的研究也仅局限在对个别偶氮还原酶的纯化和特性研究这一层面上，偶氮呼吸本质还不完全清楚，还没有建立起系统完整的厌氧偶氮还原模型，发挥作用的酶系统的特征和生理功能也没有完全阐明，对于厌氧偶氮呼吸模型的建立，还需要做进一步的研究。阐明偶氮染料在细胞内的降解过程，研究不同结构和性质的偶氮染料与微生物降解的关系，对筛选不同有机物污染物降解特定性质的菌株，提高菌株对有机污染物降解的效率都有重要的意义。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种能够应用于示踪微生物降解可视化中，标记示踪偶氮染料在细菌细胞内降解的显色过程，阐明微生物细菌细胞对偶氮染料分子的捕获和降解转移特点的荧光探针。

本发明的荧光探针，其特征在于，其结构如式1或式2所示：

探针N-Red1：

探针N-Red2：

本发明的第二个目的提供上述荧光探针在示踪检测细菌细胞降解偶氮染料中的应用。

本发明设计并合成了一类对偶氮染料的降解作用有专一选择性的荧光探针-探针N-Red1和探针N-Red2。探针N-Red1和探针N-Red2在偶氮染料未被降解时，由于分子内存在着荧光共振能量转移(FRET)，整体是无荧光的；当偶氮染料部分被细菌细胞的酶降解后，偶氮染料结构被破坏，荧光部分将会发射荧光。所设计合成的两个探针，具有不一样的性质，带磺酸基的探针(探针N-Red2)极性大，不带磺酸基的探针(探针N-Red1)极性小，通过两种探针在生物实验中的表现，揭示了微生物降解不同性质偶氮染料的不同特点。

本发明以偶氮染料为目标化合物，以偶氮染料脱色菌株为实验客体，首次将荧光探针(探针N-Red1和探针N-Red2)技术应用于示踪微生物降解可视化中，利用荧光标记示踪偶氮染料在细菌细胞内降解的显色过程，阐明微生物细菌细胞对偶氮染料分子的捕获和降解转移特点。该研究的开展将建立一套全新的基于化学荧光标记技术的微生物降解转化研究模式，更生动直观地展示微生物降解转化污染物的动力学过程，揭示化合物结构与微生物细胞捕获降解能力的相关性，为可生物降解性化合物的设计和开发提供科学理论指导，从源头减少难降解有毒污染物的产生。

附图说明

图1a是探针N-Red1与菌株随着培养时间的增长，吸收曲线强度变低与溶液颜色的变化，溶液由棕色逐渐变为黄色；图1b是探针N-Red1荧光曲线强度逐渐升高，溶液逐渐呈现黄色荧光。

图2a是探针N-Red2菌株随着培养时间的增长，吸收曲线强度变低与溶液颜色的变化，溶液由棕色逐渐变为浅黄色；图2b是探针N-Red1荧光曲线强度逐渐升高，溶液逐渐呈现黄色荧光。

图3是本发明的荧光探针N-Red 1分别在0小时,3小时,6小时与菌株培养后的降解溶液，高效液相色谱(HPLC)的分析结果。

图4是本发明的荧光探针N-Red 2分别在0小时,3小时,6小时与菌株培养后的降解溶液，高效液相色谱(HPLC)的分析结果。

图5是本发明的荧光探针N-Red 1在4小时与菌株培养后的降解溶液的质谱分析结果。

图6是本发明的荧光探针N-Red 2在4小时与菌株培养后的降解溶液的质谱分析结果。

图7是化合物探针N-Red 1和探针N-Red 2在脱色希瓦氏菌S12细胞中的荧光成像，蔡司激光共聚焦荧光显微镜，激发波长408nm，其中：图7a是探针N-Red 1绿色通道荧光图片；图7b是探针N-Red 1绿色通道与白光图片叠加图；图7c是图7a部分放大图片；图7d是图7c绿色通道与白光图片叠加图；图7e是探针N-Red 2绿色通道荧光图片；图7f是商业化染料DAPI染色；图7g是细胞白光图；图7h是图7f与白光图片叠加图。

图8是化合物探针N-Red 1和探针N-Red 2在希瓦氏菌S12-22细胞中的荧光成像，蔡司激光共聚焦荧光显微镜，激发波长408nm，其中：图8a是探针N-Red 1绿色通道荧光图片；图8b是探针N-Red 1绿色通道与白光图片叠加图；图8c是图8a部分放大图片；图8d是图8c绿色通道与白光图片叠加图；图8e是探针N-Red 2绿色通道荧光图片；图8f是商业化染料DAPI染色；图8g是细胞白光图；图8h是图8f与白光图片叠加图。

图9是探针N-Red 1和探针N-Red 2的合成流程简图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

探针N-Red 1和探针N-Red 2的合成流程简图如图9所示，具体合成过程如下。

化合物N-Red1的合成方法

1)4-哌啶-1,8-萘酐(化合物a)的合成：

将4-溴-1,8-萘酐(2.76g，10mmol)和2.49g(30mmol)哌啶一起加入装有40ml乙二醇单甲醚的100ml单口烧瓶中，氮气保护，在120℃温度下剧烈搅拌，回流反应12h，溶液颜色从黄色变为深棕色。冷却到室温，倒入冰水中，不停搅拌有大量黄色固体析出。过滤，并用15ml水洗涤滤饼3次。真空干燥后，色谱柱分离得到2.13g目标产物化合物a，产率75.8％。

2)4-哌啶-氨乙基萘酰亚胺(化合物b)的合成：

将化合物a称量2.13g(7.5mmol)加入装有50ml乙醇的100ml单口烧瓶中，并且加入5ml过量的乙二胺，在常温搅拌1h后，加热回流5h。反应完毕后，将母液倒入大量的冰水中，有黄色固体析出，过滤。通过色谱柱分离，二氯甲烷与甲醇的比例为10:1，得到1.9g目标产品化合物b，收率73％。

3)偶氮染料C的合成：

在干净的250ml的三角锥瓶中，加入对氨基磺酸钠(M＝195)4g(20mmol)，40ml水，加热直至完全溶解。在冷却冰浴的温度下加入亚硝酸钠(M＝69)1.6g(24mmol)，冰浴，完全溶解后。另取以三角瓶，加入20g冰水和3.6ml浓盐酸。将混和盐酸慢慢加入到上一瓶中，慢慢搅拌静置，应该会生成白色静置液C。取另一个干净的150ml烧瓶，加入中间体N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOPS)5.8g(21mmol)，并且加入冰水20ml。加入少量碳酸钠，调节PH为中性,加入7g氯化钠，溶于母体溶液中，加热至沉淀溶解，然后放入冰水中沉淀出染料，加热到室温，过滤，得到偶氮染料C。¹H NMR(600MHz,D₂O)δ7.78(d,J＝8.4Hz,2H),δ7.55(d,J＝8.4Hz,2H),δ7.35(d,J＝4.8Hz,1H),δ6.47(s,2H),3.33(d,J＝7.2Hz,2H),3.28(t,2H),2.81(d,J＝8.4Hz,2H),2.40(s,3H),1.91(p,2H),0.99(t,3H).HRMS-ESI:m/zcalcd.M^-for C₁₉H₂₂N₃O₅S^-,404.128；found,404.1278.

4)化合物N-Red 1的合成方法

称量1.75g(5mmol)化合物b与偶氮染料C 1.35g(5mmol)加入到100ml单口圆底烧瓶中，再加入30ml除过水的DMF，冰浴。保持体系在干燥的氮气保护下进行，然后再将5.2gPyBOP(10mmol)和催化剂量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.1g一起加入圆底烧瓶中。反应1h后，撤掉冰浴，室温搅拌24h。反应完毕后减压蒸馏除掉溶剂氯仿，通过硅胶色谱柱分离，洗脱剂为二氯甲烷与甲醇的比例为20：1，得到产品(N-Red 1)1.8g(3mmol)，收率60％。N-Red 1的核磁数据：¹H NMR(600MHz,DMSO)δ8.86(t,J＝6.0Hz,1H),8.39(d,J＝6.6Hz,1H),8.32(d,J＝8.4Hz,1H),8.29(d,J＝8.4Hz,1H),7.81(d,J＝7.2Hz,1H),7.76(t,J＝8.4Hz,1H),7.58(d,J＝7.2Hz,1H),7.52(p,4H),7.24(d,J＝8.4Hz,1H),6.46(d,J＝9.6Hz,2H),4.30(t,J＝6.0Hz,2H),3.69(p,2H),3.16(s,4H),2.95(s,6H),1.82(p,4H),1.66(p,2H).¹³C NMR(151MHz,DMSO)δ167.08,164.36,163.81,157.01,152.88,149.93,142.85,133.13,132.59,131.14,130.87,129.91,129.78,129.46,126.11,125.88,125.39,116.22,115.65,115.28,111.58,54.42,38.18,26.21,24.32.HRMS-ESI:m/z calcd.M⁺for C₃₄H₃₄N₆O₃,574.2695；found,574.2691.

探针N-Red1的结构如式1所示：

5)化合物N-Red 2的合成：

称量1.75g(5mmol)化合物b与偶氮染料甲基红1.35g(5mmol)加入到装有除过水的30ml氯仿的100ml单口圆底烧瓶中，冰浴。保持体系在干燥的氮气保护下进行，然后再将N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)2.1g(10mmol)和催化剂量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.1g一起加入圆底烧瓶中。反应1h后，撤掉冰浴，室温搅拌24h。反应完毕后减压蒸馏除掉溶剂氯仿，通过硅胶色谱柱分离，洗脱剂为二氯甲烷与甲醇的比例为20：1，得到产品(化合物N-Red2)1.8g(3mmol)，收率60％。

产品(N-Red 2)的核磁数据：¹H NMR(600MHz,DMSO)δ8.64(t,J＝6.0Hz,1H),8.47(d,1H),8.43(d,1H),8.39(d,1H),7.82(p,3H),7.73(d,2H),7.65(d,J＝8.4Hz,1H),7.32(d,J＝8.4Hz,1H),6.69(p,2H),4.28(t,2H),3.63(p,2H),3.47(p,4H),3.20(p,4H),2.62(s,3H),,2.51(p,2H),1.88(p,2H),1.82(p,2H),1.65(p,2H),1.15(t,J＝7.2Hz,3H).¹³C NMR(151MHz,DMSO)166.96,164.38,163.88,157.08,154.98,151.48,142.11,141.12,135.03,132.63,130.94,129.86,128.65,126.03,125.96,123.35,121.82,117.480,115.89,115.46,112.38,110.34,54.45,49.26,49.06,44.8,37.93,26.19,24.32,24.04,18.38,12.87.HRMS-ESI:m/z calcd.M^-for C₃₈H₄₁N₆O₆S^-,709.2814；found,709.2811.

探针N-Red2的结构如式2所示：

实施例2

探针N-Red 1脱色实验

乳酸培养基培养脱色希瓦氏菌S12菌株，培养基成分为：2.0g/l乳酸钠,2.0g/l酵母提取物,12.8g/l Na₂HPO₄·7H₂O,3g/l KH₂PO₄,0.5g/l NaCl,和1.0g/l NH₄Cl。将探针N-Red 1与脱色希瓦氏菌S12菌株培养液密封在10ml棕色小瓶中，起始加入探针N-Red 1的浓度为0.05微摩尔每升，放置于在33℃的氮气培养箱中，开始计时，分别每两个小时取出样品，在离心机中离去菌体，测试溶液中的吸收和荧光。

图1是本发明探针N-Red1在菌株溶液中，菌株对探针降解谱图分析。在培养基中，分别隔2个小时取样的测试结果。图1a为随着菌株降解时间的增长，吸收曲线降低，颜色也由深黄色慢慢转变为浅黄色。图1b为荧光波普随着时间的变化曲线，由于偶氮键的断裂，荧光逐渐出现，在6个小时的时候达到最大的荧光强度。

实施例3

探针N-Red 2

在厌氧条件下，采用LM乳酸培养基培养脱色希瓦氏菌S12菌株，培养基成分为：2.0g/l乳酸钠,2.0g/l酵母提取物,12.8g/l Na₂HPO₄·7H₂O,3g/l KH₂PO₄,0.5g/l NaCl,和1.0g/lNH₄Cl。将探针N-Red 2与脱色希瓦氏菌S12菌株培养液密封在10ml棕色小瓶中，起始加入探针N-Red 2的浓度为0.05微摩尔每升，放置于在33℃的氮气培养箱中，开始计时，分别每两个小时取出样品，在离心机中离去菌体，测试溶液中的吸收和荧光。

图2是本发明探针N-Red2在菌株溶液中，菌株对探针降解谱图分析。图2a为探针与菌株培养时间的增长，吸收曲线降低，颜色也由深黄色慢慢转变为浅黄色。图2b为荧光波普与时间的变化曲线，由于偶氮键的断裂，荧光逐渐出现，在6个小时的时候达到最大的荧光强度。

实施例4

对探针N-Red 1的降解产物也进行高效液相分析，如图3所示。首先分别将实施例2的培养3、4和6小时后的培养基离心分离取上层液，再将上层液通过0.22μm孔径的水相纤维滤膜过滤。将初始体系的溶液通过HPLC测试，也就是实施例2的0小时的条件下溶液的成分。在第5.7分钟时候出现了一个很强的单峰，也就是探针N-Red 1对应峰。经过3小时的培养后，在保留时间2.2分钟出现一个明显的单峰，对应为降解产物N-D-1(图3中6h图中箭头所示部分)。培育6小时候后探针N-Red 1大部分已经降解完全，只留下很少一部分，主要已经转化为中间体N-D，这也说明N-Red 1降解速率低于N-Red 2的降解速率。在对探针的分析过程中并没有发现，除了主要降解产物N-D，并没有发现分子降解产物的其他部分。我们认为分子的另一部分很可能被微生物作为碳源所利用掉。图5是分别对探针在加入菌株中前和培养6小时后的正模式质谱测试结果，图5a中，探针N-Red 1所对应的分子量575.2，当经过6小时培育后，探针中偶氮键断裂，只剩下降解产物存在，对应分子量为443.2。(质谱的正负模式根据分子结构而定)

实施例5

探针N-Red 2的降解产物进行高效液相分析，如图4所示。首先分别将实施例3的培养3、4和6小时后的培养基离心分离取上层液，再将上层液通过0.22μm孔径的水相纤维滤膜过滤。将初始体系的溶液通过HPLC测试，也就是实施例3的0小时的条件下培养基的成分。如图4所示，在第1.2分钟时候出现了一个很强的单峰，也就是探针N-Red 2对应峰。经过3小时的培养后，在保留时间2.7分钟出现一个明显的单峰，对应为降解产物N-D(图4中6h图中的箭头所示部分)。在培育6小时候后的分析中发现，初始探针N-Red 2已经降解完全，只是剩下了中间体N-D。图6是分别对探针在加入菌株中前和培养6小时后的正模式质谱测试结果，图6a中，由于分子中含有磺酸盐，质朴中我们用质谱的负模式测试得到探针N-Red 2所对应的分子量709.2。当经过6小时培育后，探针中偶氮键断裂，只剩下降解产物N-D存在，由于不含有磺酸盐，我们用质谱的正模式测得探针对用的分子量为443.2。(质谱的正负模式根据分子结构而定)

实施例6

化合物探针N-Red 1和N-Red 2的细胞实验(脱色希瓦氏菌S12，该菌株是现有技术中的菌株，公开于文献：Meiying Xu,Jun Guo,Guoqu Zeng,Xiaoyan Zhong,Guoping Sun，Decolorization of anthraquinone dye Shewanella decolorationis S12，Appl Microbiol Biotechnol,2006,71:246～251)：

将实施例3和实施例2的培养4小时的培养液分装在10ml离心管中，离心机离心3分钟，分离除去上层溶液，用二次去离子水冲洗下层菌株。用滴管吸取10μl菌液滴到载玻片上，在共聚焦显微镜下观察。

化合物探针N-Red 1和探针N-Red 2的细胞实验(希瓦氏菌S12-22，该菌是现有技术中的菌株，公开于文献：Xingjuan Chen&Meiying Xu&Jinbo Wei&Guoping Sun,Two differentelectron transfer pathways may involve in azoreduction in Shewanella decolorationis S12,ApplMicrobiol Biotechnol,2010,86:743–751)：

在厌氧条件下，采用LM乳酸培养基培养希瓦氏菌S12-22，培养基成分为：2.0g/l乳酸钠,2.0g/l酵母提取物,12.8g/l Na₂HPO₄·7H₂O,3g/l KH₂PO₄,0.5g/l NaCl,and 1.0g/l NH₄Cl。将探针N-Red 1(或探针N-Red 2)与希瓦氏菌S12-22菌株培养液密封在10ml棕色小瓶中，起始加入探针N-Red 1(或探针N-Red 2)的浓度为0.05微摩尔每升，放置于在33℃的氮气培养箱中，开始计时，培养至4小时取出培养液。将培养液分装在10ml离心管中，离心机离心3分钟，分离除去上层溶液，用二次去离子水冲洗下层菌株。用滴管吸取10μl菌液滴到载玻片上，在共聚焦显微镜下观察。

具体结果如图7和图8所示：

从图7和图8中可以看出，探针N-Red2带有大极性基团—磺酸钠，整体分子极性非常大，分子难以自由进入细胞内部被细菌降解。从溶液中测试结果知道，荧光强度是逐渐增加的，也就是说探针N-Red2被菌体降解成为发光的荧光体，偶氮键断开。但通过激光共聚焦显微镜没有看到荧光出现在菌体中，那么可以得出探针N-Red2是在胞外发生的降解(具体如图7和8所示)。如图7e，培养菌体6小时后并没有检测到菌体中有明显的荧光出现。

探针N-Red1不带有大极性基团，极性非常小，分子可以自由进入细胞内部被细菌降解，偶氮双键断掉后产生发光基团荧光。通过激光共聚焦显微镜可以看到明显的荧光菌体成像，染料附着于菌体中，也就是说探针在菌体中内部发生了降解(具体如图7和8所示)。