免标记物近红外检测样品中生物物质含量的方法

摘要

本发明涉及一种免标记物近红外检测样品中生物物质含量的方法。首先制备由可透过近红外电磁波的固体和在其表面固定的生物识别单元构成的待测物的生物传感器，然后将其放入待测液中，使生物识别单元与待测生物物质特异结合，再取出生物传感器进行近红外吸收谱的测量。具体检测时，先检测标准液建立定标模型，再对待测物进行同样的近红外吸收谱测量，并与所述标准液的模型进行对比，从而定量确定待测物在液体样品中的浓度。本发明所述待测物质的近红外吸收谱是在与溶液分离后测定的，可以减少水分子及溶液中其他成分对近红外吸收谱的干扰，提高灵敏度和检测极限；并且，分析过程不需要带有标记物的成分，可以同时定量分析多个被检测生物物质。

说明书

技术领域

本发明涉及近红外检测生物物质含量的方法，具体涉及一种免标记物近红外检测样品中生物物质含量的方法。

背景技术

近红外光是介于可见光和中红外光之间的电磁波, 其谱区的信息主要是分子内部原子间振动的倍频与合频的信息，几乎包括有机物中所有含氢基团(如C—H、O—H、N—H 和C= O 等) 的信息，其信息量极为丰富。这是近红外光谱分析技术能够用来分析有机化合物的基础。

近红外光谱技术是一种快速、高效、无损、绿色的分析检测方法，被广泛应用于食品、农业、化工、生物等领域。在生物物质含量检测中，由生物识别单元结合生物物质后进行检测的方法可以提高检测特异性。常见的例子有免疫分析，核酸杂交分析，分别是通过抗体与样品中抗原结合、单链核酸与样品中对链核酸结合后进行检测。由于在大多数情况下这种结合不产生易于检测的信号，常用的检测方法要依赖于对结合体上加入的标记物（例如：荧光免疫法、化学发光免疫法）检测而间接定量分析被检测物。

基于近红外法可以直接分析被检测物的吸收谱，从而定量分析该物质的含量。然而，由于被检测物在绝大多数情况下存在于溶液中，例如人和动物的体液。溶液中的水分子OH在近红外波段有很强的吸收，对于其他成分的光谱分析及含量测定形成了很强的干扰。虽然后来发展的多元线性回归定标模型技术和化学计量学多元统计变量法定标模型技术大大改进了近红外定量分析方法，但是由于大量水分子的存在使得这一方法对生物样品中的物质检测仍然不理想。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的问题，提出一种免标记物近红外检测样品中生物物质含量的方法，旨在去除检测干扰，提高检测的灵敏度和检测极限。

本发明的技术解决方案如下：

一种免标记物近红外检测样品中生物物质含量的方法，其步骤为：

首先制备待测物质的生物传感器，其由可透过近红外电磁波的固体和在其表面固定的待测生物物质的识别单元构成；将所述生物传感器放入待测生物物质标准液中，使传感器上的生物识别单元与待测生物物质特异结合；然后取出生物传感器进行红外吸收谱的测量，根据化学计量学多元统计变量法对被检测物质的红外吸收谱建立定标模型，或者用多元线性回归算法对被检测物质的红外吸收谱建立定标模型；依据样品中待测生物物质的近红外吸收谱与所述标准液的模型，即可定量确定待测生物物质在液体样品中的浓度。

进一步地，所述的固体是可透过近红外电磁波的材料，该材料可以是石英，单晶硅，光学玻璃，透红外塑料，红外透明陶瓷，各种红外光导纤维及毛细管。所述固体形状可以是片状，块状，杯状，柱状，管状。所述的固体表面可以是光滑面，也可以是大表面积的粗糙面或者多孔表面。

进一步地，所述的生物识别单元是单种或多种能与被检测物质特异结合的物质，包括蛋白质，多肽，核酸，细胞，以及能与生物物质特异结合的其它分子，并且所述多种识别单元可以分别与其相对应的被检测物质进行特异结合。

进一步地，所述的生物识别单元的固定方法可以是化学共价键固定或物理吸附固定。

进一步地，所述生物识别单元与样品中的单种或多种被检测物质要在一段特定的时间内进行结合。

进一步地，所述的待测物质可以是单种或多种离子、分子、细胞或微生物。

进一步地，将结合了所述待测物质的生物传感器取出后，可以干燥去除水分，并在干燥环境下检测红外吸收谱。

更进一步地，所述建立的定标模型包含待测物质红外吸收谱特征和其与样品中的含量之间的关系。

本发明的有益效果主要体现在：

1、本发明利用固定在固体表面的生物识别单元结合样品中的被检测物质，然后将固体上的被检测物质与样品溶液分离，在干燥的环境下测量近红外吸收谱，从而减小水分子和样品中其它物质对红外吸收谱测量的干扰，提高了测量的灵敏度，降低了检测极限。

2、本发明所述生物传感器可在同一表面固定多种生物识别单元，可以对样品中多种成分同时检测。

3、本发明的方法不需要使用带有标记物的成分，使生物物质的分析更加简便高效。

附图说明

图1为本发明结合了待测物质的生物传感器示意图；

图2为本发明生物传感器在样品中待测生物的示意图；

图3为本发明固体表面为多孔表面的生物传感器。

其中，附图标记的含义为：1，生物传感器的固体；2-1，待测DNA的对应单链；2-2，配体；2-3，抗体；3-1，待测DNA；3-2，受体；3-3，抗原。

具体实施方式

下面结合附图以及实施例对本发明技术方案作进一步地描述，以使其更易于理解和掌握。

本发明免标记物近红外检测样品中生物物质含量的方法的具体步骤为：

（1）制备待测物质的生物传感器：将待测生物物质的识别单元固定在可透过近红外电磁波的固体上。

生物识别单元是单种或多种能与被检测物质特异结合的物质，包括蛋白质，多肽，核酸，细胞，以及能与生物物质特异结合的其他分子，并且一个生物传感器可以放置多种生物识别单元。如图1，生物传感器的固体1上放置了待测DNA 2-1的对应单链、配体2-2、抗体2-3这三种生物识别单元。至于生物识别单元固定方法它可以是化学共价键固定或物理吸附固定，包括共价固定法，聚合物包埋法，化学交联法，电化学聚合固定法，溶胶或凝胶固定法，聚电解质层层组装法，分子自组装固定法，形成离子键或配位键固定法，纳米材料固定法等。其中所述固体1的材料是可透过近红外电磁波的材料，该材料可以是石英，单晶硅，光学玻璃，透红外塑料，红外透明陶瓷，各种红外光导纤维及毛细管，固体形状也可以是片状，块状，杯状，柱状，管状。固体放入表面可以是光滑面，也可以是大表面积的粗糙面或者多孔表面，大表面积的粗糙面或者多孔表面可以装载更多的生物识别单元，如图3多孔表面的生物传感器：孔内的底部和侧面都可以放置生物识别单元。

（2）将所述生物传感器的固体表面清洗干净，在干燥的条件下进行近红外吸收谱测量，将测得的近红外吸收谱作为基准谱；清洗表面是为了去除一些干扰检测的杂质，以提高检测的灵敏度。

（3）将同样的生物传感器等数量放入待测生物物质的多种浓度的标准液中，在一段特定的时间内，所述传感器上的生物识别单元与待测生物物质发生特异结合后，将各种浓度的标准液中的生物传感器分别取出，并用适当的液体对表面进行清洗以去除液体样品中的其它干扰成分，然后干燥以除去水分，减少水分子对所述红外吸收谱测量的干扰。

生物传感器上的生物识别单元与标准样品中的被检测物质在一段特定的时间内进行特异结合，从而可以定量测定在这段时间内结合的待测生物物质。如图2为生物传感器在样品中待测生物的示意图，待测样品中的离子、分子或者细胞与传感器上的生物识别单元发生特异结合。

（4）对干燥后的生物传感器根据所测标准液浓度分别进行近红外吸收谱测量，所得的近红外吸收谱作为构建模型的数据。

（5）应用化学计量学多元统计变量法对待测生物物质红外吸收谱建立定标模型，或者用多元线性回归算法对待测生物物质的红外吸收谱建立定标模型。

（6）将步骤（3）同样的数量相同的生物传感器放入样品中，在与步骤（3）相同的物理条件和同样的一段时间内进行特异结合，将生物传感器取出，并用适当的液体对表面清洗以去除液体样品的其它干扰成分，然后干燥以除去水分，对干燥后的生物传感器进行近红外吸收谱测量得到近红外谱，依据已经建立的模型可以确定被检测物质在溶液中的含量。

（7）本发明所述的生物传感器在某些情况下可“再生”使用。通过一定的物理或化学方法将已经结合在生物识别单元上的被检测物质释放开并洗脱，使生物识别单元恢复结合前的状态而达到所述生物传感器的“再生”，使其可以重复使用。例如，对于带有单链DNA生物检测单元的生物传感器，可以通过对其“加热”使已经结合对链的双链DNA脱开，就能使带有单链DNA检测单元的生物传感器达到“再生”状态。

        实施例         1

应用光学玻璃或石英作为生物传感器的固体材料，其步骤如下：

（1）生物传感器使用固体材料为对近红外吸收较小的光学玻璃或石英；

（2）将所述固体表面清洗干净，在干燥的条件下与带有功能团的硅烷反应，在表面形成共价链接的功能团。选择抗体作为生物识别单元，将多种抗体与表面功能团进行共价结合反应，形成共价固定的表面抗体。将反应过程中遗留在表面的未固定物质清洗清除，也可以进行干燥处理去除水分，构建成所述生物传感器；

（3）对干燥后的生物传感器进行近红外吸收谱测量，将测得的近红外吸收谱作为基准谱保存；

（4）在合适的液相环境中使生物传感器表面上固定的抗体与液体样品中已知浓度的待测抗原结合。将生物传感器及其表面结合的抗原从溶液中取出，用适当的液体对表面清洗以去除液体样品的其它干扰成分，然后让清洗液体干燥以除去水分；

（5）对干燥后的生物传感器进行近红外吸收谱测量，所得的近红外吸收谱作为构建模型的数据；

（6）所述步骤（3）至（5）的测量包含了多种抗原抗体结合的信息，所得的近红外吸收谱作为构建模型的数据；

（7）应用化学计量学多元统计变量法对被检测物质红外吸收谱定标模型，或者用多元线性回归算法对被检测物质红外吸收谱定标模型；

（8）在合适的物理条件下使生物传感器表面上固定的抗体与液体样品中的被检测抗原结合。将生物传感器及其表面结合的抗原从溶液中取出，用适当的液体对表面清洗以去除液体样品的其它干扰成分，然后让清洗液体干燥以除去水分；

（9）对干燥后的生物传感器进行近红外吸收谱测量，所得近红外谱与已经建立的模型共同使用可以确定被检测物质在溶液中的含量。

        实施例         2 

使用单晶硅作为生物传感器的固体材料。其步骤如下：

（1）生物传感器使用固体材料为对近红外吸收较小的单晶硅或参杂的单晶硅，将单晶硅表面清洗干净。

（2）用物理或化学方法使单晶硅表面生成硅羟基。

（3）将所述固体表面清洗干净，在干燥的条件下与带有功能团的硅烷反应，在表面形成共价链接的功能团。选择抗体作为生物识别单元，将多种抗体与表面功能团进行共价结合反应，形成共价固定的表面抗体。将反应过程中遗留在表面的未固定物质清洗清除，也可以进行干燥处理去除水分，构建成所述生物传感器。

（4）对干燥后的生物传感器进行近红外吸收谱测量，将测得的近红外吸收谱作为基准谱保存。

（5）对干燥后的生物传感器进行近红外吸收谱测量，所得的近红外吸收谱作为构建模型的数据。

（6）用所述步骤（3）至（5）的测量所得的近红外吸收谱作为构建模型的数据。

（7）应用化学计量学多元统计变量法对被检测物质红外吸收谱定标模型，或者用多元线性回归算法对被检测物质红外吸收谱定标模型。

（8）在合适的物理条件下使生物传感器表面上固定的抗体与液体样品中的被检测抗原结合。将生物传感器及其表面结合的抗原从溶液中取出，用适当的液体对表面清洗以去除液体样品的其它干扰成分，然后让清洗液体干燥以除去水分。

（9）对干燥后的生物传感器进行近红外吸收谱测量，所得近红外谱与已经建立的模型共同使用可以确定被检测物质在溶液中的含量。

        实施例3

为增加生物传感器装载生物识别单元的量，将实施方法1和2中的固体表面粗糙化。其步骤如下：

（1）使氢氟酸溶液与光学玻璃，石英，单晶硅或参杂的单晶硅表面上需要固定生物识别单元的区域进行反应，使其变成粗糙表面以增大其表面积。

（2）用物理或化学方法使得经过表面处理光学玻璃，石英或者单晶硅片使其表面生成硅羟基。

（3）将所述固体表面清洗干净，在干燥的条件下与带有功能团的硅烷反应，在表面形成共价链接的功能团。选择抗体作为生物识别单元，将多种抗体与表面功能团进行共价结合反应，形成共价固定的表面抗体。将反应过程中遗留在表面的未固定物质清洗清除，也可以进行干燥处理去除水分，构建成所述生物传感器。

（4）对干燥后的生物传感器进行近红外吸收谱测量，将测得的近红外吸收谱作为基准谱保存。

（5）在合适的液相环境中使生物传感器表面上固定的抗体与液体样品中已知浓度的待测抗原结合。将生物传感器及其表面结合的抗原从溶液中取出，用适当的液体对表面清洗以去除液体样品的其它干扰成分，然后让清洗液体干燥以除去水分。

（6）对干燥后的生物传感器进行近红外吸收谱测量，所得的近红外吸收谱作为构建模型的数据。

（7）对溶液中多种被检测抗原分别进行所述步骤（3）至（5）的测量，所得的近红外吸收谱作为该抗原构建模型的数据。

（8）应用化学计量学多元统计变量法对被检测物质红外吸收谱定标模型，或者用多元线性回归算法对被检测物质红外吸收谱定标模型。

（9）在合适的液相环境中使生物传感器表面上固定的抗体与液体样品中的被检测抗原结合。将生物传感器及其表面结合的抗原从溶液中取出，用适当的液体对表面清洗以去除液体样品的其它干扰成分，然后让清洗液体干燥以除去水分。

（10）对干燥后的生物传感器进行近红外吸收谱测量，所得近红外谱与已经建立的模型共同使用可以确定被检测物质在溶液中的含量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以作出若干改进和变型，这些改进和变型也应该视为本发明的保护范围。