一种醇脱氢酶在不对称还原反应中的应用

摘要

本发明公开一种利用醇脱氢酶催化进行不对称还原反应以制备手性醇的酶-化学合成方法，以及进一步利用该手性醇制备单一构型的西汀类药物特别是托莫西汀的方法。该方法反应条件温和，原料成本低，对环境友好，反应收率高，且产物光学纯度高，相比于传统的不对称还原制备方法具有明显优势。

说明书

技术领域

本发明属于生物化学工程领域，具体涉及一种利用醇脱氢酶催化进行不对称还原反应以制备手性醇的酶-化学合成方法，以及进一步利用该手性醇制备单一构型的西汀类药物特别是托莫西汀的方法。

背景技术

选择性血清素再摄取抑制剂和去甲肾上腺素再摄取抑制剂类抗抑郁药多为含有3-芳氧基-3-芳基丙胺结构的西汀类药物，例如氟西汀(Fluoxetine)、尼索西汀(Nisoxetine)、托莫西汀(Tomoxetine)，它们的结构依次如下所示：

托莫西汀是美国食品药品监督管理局批准的第一种非中枢神经兴奋剂药物，主要用于儿童及青少年的多动症(ADHD)治疗。它不属于中枢神经兴奋剂，不具有成瘾性，同时也不属于管制类药品，主要药理作用是透过正肾上腺素的再回收转而增加脑部中控制人类行为的化学物质正肾上腺素和多巴胺的浓度，由此能够改善病患注意力不集中、易冲动及自制力薄弱等症状。

研究表明，对于西汀类药物来说，R-构型具有更高的活性。典型地，托莫西汀的R-构型被称为atomoxetine，其有效性是S-构型的9倍。

现有技术中对该类单一构型药物的合成主要有两类方法。

一种是先合成外消旋体然后拆分的方法。例如中国药学杂志,45(14),1104-1106公开了一种制备托莫西汀的方法，反应过程如下：

首先由3-甲氨基-1-苯基丙-1-酮在还原剂硼氢化钠存在下还原为醇，然后和2-甲基苯酚反应生成外消旋体，接着拆分为单一构型药物—托莫西汀。这种方法产品收率低，生产成本成倍上升，而且造成废弃异构体的排放，污染环境。

另一种方式是将羰基在钌或铑金属催化剂的存在下进行不对称还原得到单一构型的醇，然后单一构型的醇再与芳基化合物反应得到需要的化合物。例如，美国专利US7485754B2公开了一种制备此类单一构型药物的方法，反应式如下所示：

手性羟基化合物是此类合成方法的关键中间体。对于手性的羟基化合物，现有技术中主要利用钌或铑金属催化剂进行不对称还原制备，而该类方法存在反应收率低，需要排出废弃物，对环境不友好，不适合大规模工业化生产等缺点。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用醇脱氢酶催化进行不对称还原反应以制备手性醇的酶-化学合成方法，以及进一步利用该手性醇制备单一构型的西汀类药物特别是托莫西汀的方法。本发明的方法反应条件温和，原料成本低，对环境友好，反应收率高，且产物光学纯度高，相比于传统的不对称还原制备方法具有明显优势。

为了实现本发明的目的，具体采用如下技术方案。

一种酶催化制备如式II所示的手性醇的方法，其特征在于：利用醇脱氢酶催化式III所示的前手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成式II所示的手性醇；反应式如下所示：

其中，Y选自卤素、氨基、单取代或二取代氨基。

上述方法中，使用的醇脱氢酶是申请号为201410317128.0的中国专利申请中公开的醇脱氢酶，在此将该申请的全文引入以作为补充和参考。优选地，所述醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示(即，申请号为201410317128.0的中国专利申请中的SEQ ID NO:2)。

作为一种具体实施方案，上述不对称还原反应在pH为5.0-8.0的异丙醇水溶液中进行。任选地，所述异丙醇溶液中可添加0-1.0mM的NADP+。

作为另一种具体实施方案，所述不对称还原反应在含有葡萄糖脱氢酶和葡萄糖的pH为5.0-8.0的水溶液中进行。优选地，所述葡萄糖在反应液中的含量为5-200g/L，葡萄糖脱氢酶的含量为0.01-1g/L。任选地，所述水溶液中可添加0-1.0mM的NADP+或NAD+。

优选地，在反应体系中式III所示的前手性羰基化合物的浓度为1-200g/L，醇脱氢酶的用量为0.01-10g/L，反应在振荡或搅拌条件下进行，反应温度为20-35℃。不对称还原反应的反应时间以反应过程中产物浓度不再持续提高的时间为准，这对于本领域技术人员而言是容易确定的。

反应结束后，可采用本领域的常规提取方法从反应液中提取式II所示的手性醇产物。例如可以是：在反应溶液中加入酸(比如稀盐酸等)调节pH至2左右使蛋白沉淀，然后利用硅藻土过滤，滤液利用碱(比如氢氧化钠溶液等)调节pH至12左右，接着用有机溶剂(比如正丁醇、乙酸乙酯等)进行萃取，合并有机相，干燥旋干，得到式II所示的手性醇产物。

作为本发明中使用的催化剂，可采用含有所述醇脱氢酶的粗酶液。任选地，可配以辅酶使用，例如NADP+和/或NAD+。如果用静息细胞做催化剂则不需要加辅酶，只需利用细胞内含有的辅酶即可。

在上述方法的基础上，本发明的另一个目的在于提供一种制备式I化合物的方法，包括如下步骤：

a)利用醇脱氢酶催化式III所示的前手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成式II所示的手性醇；

b)式II所示的手性醇与试剂G-X反应，生成式I化合物；

反应式如下所示：

其中，

Y选自卤素、氨基、单取代或二取代的氨基；

G选自苯基、甲苯基、三卤代甲基苯基、烷氧基甲苯基或萘基，优选1-萘基、2-甲基苯基、2-甲氧基苯基、4-三氟甲基苯基；

X选自卤素，如氟、氯、溴、碘。

优选地，步骤b)中式II手性醇与试剂G-X的反应是在含有碱的醚类溶剂中进行。所述的醚类溶剂优选为极性醚类溶剂，更优选四氢呋喃。所述的碱选自氢氧化钠和/或氢氧化钾。

步骤b)中，试剂G-X与式II手性醇的摩尔比为1-5：1，优选2-4：1；所述的碱与式II手性醇的摩尔比为1-5：1，优选1-3：1；反应温度为10-65℃，优选20-40℃；反应时间为5-20小时，优选10-12小时。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：针对现有合成技术反应收率低、原料成本昂贵、反应不完全、对应选择性不高或者需要添加价格昂贵的辅酶等问题，本发明提供了一种利用中国专利申请201410317128.0中公开的醇脱氢酶进行不对称还原反应以制备手性醇的酶-化学合成方法，以及进一步利用该手性醇制备单一构型的西汀类药物特别是托莫西汀的方法。该方法不必额外添加昂贵的辅酶NAD+，所得的产物浓度高，并且产物光学纯度高，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，具有很好的工业应用前景。

具体实施方式

下面结合实施例来进一步详细说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验步骤，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例中使用的全菌裂解液是参照申请号为201410317128.0的中国专利申请中说明书实施例2记载的方法制备得到的，所述醇脱氢酶的氨基酸序列如本申请SEQ ID NO:1所示，并且其中醇脱氢酶的蛋白浓度为15g/L。

TLC条件：二氯甲烷:甲醇:氨水＝7:0.55:2滴，碘缸显色。

ee值测定条件是：ChiralpakAD-H柱，正己烷:乙醇(0.1％DEA)＝90:10，0.8mL/min，220nm，Agilent1260。

实施例1

将163g 3-(甲基氨基)-1-苯基丙-1-酮溶于150mL异丙醇中，加入400mL磷酸钠缓冲液并用20％(w/v)的NaOH溶液调pH至7.0，加入全菌裂解液450mL，30℃搅拌反应，采用TLC检测反应进程。反应结束后，加入稀盐酸调节pH至2使蛋白沉淀，然后利用硅藻土过滤，滤液用20％(w/v)的氢氧化钠溶液调pH为12，等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，干燥旋干，得到产物。产物重量为150.1g，摩尔收率91.0％。

通过核磁共振氢谱和ee值测定对产物结构进行确认：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ7.19(5H,s,Ar-H),4.50(1H,t,-CHOH),2.55(2H,t,-CH₂NHCH₃),2.47(3H,s,-CH₃),2.0(1H,s,-OH),1.89(2H,m,-CH₂-).

ee值>99％。

实施例2-5

参照实施例1的方法，结合表1中的参数，进行实施例2-5的化合物的制备。其中，当反应体系中使用NADP+时，NADP+与全菌裂解液同时加入反应体系中。

表1

产物的检测和结构表征结果如下。

实施例2：

产物重量为92.0g，摩尔收率91.0％。

¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.19(5H,s,Ar-H),4.50(1H,t,-CH(OH)),2.36(2H,t,-CH₂NMe₂),2.27(6H,s,-N(CH₃)₂),2.0(1H,s,-OH).1.87(2H,m,-C(OH)CH₂-),

ee值>99％。

实施例3：

产物重量为111.3g，摩尔收率87.3％。

¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.19(5H,s,Ar-H),4.50(1H,t,-CH(OH)),3.38(2H,t,-CH₂Cl),2.05(2H,m,-C(OH)CH₂-),2.0(1H,s,-OH).

ee值>99％。

实施例4：

产物重量为86.1g，摩尔收率85.2％。

¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.19(5H,s,Ar-H),4.50(1H,t,-CHOH),2.55(2H,t,-CH₂NHCH₃),2.47(3H,s,-CH₃),2.0(1H,s,-OH),1.89(2H,m,-CH₂-).

ee值>99％。

实施例5：

产物重量为120.4g，摩尔收率90.9％。

¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.19(5H,s,Ar-H),4.50(1H,t,-CH(OH)),2.96(2H,t,-CH₂N(CH₃)),2.90(3H,s,-N(CH₃)),2.03(2H,m,-CH₂C(OH)),2.0(1H,s,-OH),1.10(9H,s,-C(CH₃)₃).

ee值>99％。

实施例6

将81.5g 3-(甲基氨基)-1-苯基丙-1-酮溶于200mL水，加入全菌裂解液245mL，然后加入磷酸钠缓冲液并用20％(w/v)的NaOH溶液调pH至7.0，控制反应液体积为1L，接着加入葡萄糖70g、葡萄糖脱氢酶5000U，30℃搅拌反应，TLC检测反应进程。反应结束后，加入稀盐酸调节pH至2使蛋白沉淀，然后利用硅藻土过滤，滤液用20％(w/v)的氢氧化钠溶液调pH为12，等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，干燥旋干，得到产物。产物重量为72.8g，摩尔收率88.3％。

产物的检测和表征结果如下。

¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.19(5H,s,Ar-H),4.50(1H,t,-CHOH),2.55(2H,t,-CH₂NHCH₃),2.47(3H,s,-CH₃),2.0(1H,s,-OH),1.89(2H,m,-CH₂-).

ee值>99％。

实施例7-10

参照实施例6的方法，结合表2中的参数，进行实施例7-10的化合物的制备。其中，当反应体系中使用NADP+时，NADP+与全菌裂解液同时加入反应体系中。

表2

产物的检测和结构表征结果如下。

实施例7：

产物重量为87.5g，摩尔收率86.5％。

¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.19(5H,s,Ar-H),4.50(1H,t,-CHOH),2.55(2H,t,-CH₂NHCH₃),2.47(3H,s,-CH₃),2.0(1H,s,-OH),1.89(2H,m,-CH₂-).

ee值>99％。

实施例8：

产物重量为105.6g，摩尔收率84.2％。

¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.19(5H,s,Ar-H),4.50(1H,t,-CH(OH)),3.38(2H,t,-CH₂Cl),2.05(2H,m,-C(OH)CH₂-),2.0(1H,s,-OH).

ee值>99％。

实施例9：

产物重量为68.7g，摩尔收率87.9％。

¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.19(5H,s,Ar-H),7.06-7.14(5H,s,Ar-H),4.50(1H,t,-CH(OH)),3.62(2H,s,-CH₂-Ar),2.36(2H,t,-CH₂N(CH3)),2.27(3H,s,-N(CH₃)),2.0(1H,s,-OH),1.87(2H,m,-C(OH)CH₂-).

ee值：92％。

实施例10：

产物重量为120.4g，摩尔收率90.9％。

¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.19(5H,s,Ar-H),4.50(1H,t,-CH(OH)),2.96(2H,t,-CH₂N(CH₃)),2.90(3H,s,-N(CH₃)),2.03(2H,m,-CH₂C(OH)),2.0(1H,s,-OH),1.10(9H,s,-C(CH₃)₃).

ee值>95％。

实施例11

a)按照实施例5或10所述的方法制备如式3所示的N-((R)-3-羟基-3-苯基)丙基-N-甲基-氨基甲酸叔丁酯26.3g；

b)将式3所示的N-((R)-3-羟基-3-苯基)丙基-N-甲基-氨基甲酸叔丁酯26.3g溶于150mL四氢呋喃中，然后加入四三苯基膦钯11.5g和氢氧化钾6.72g，搅拌下加入邻甲基溴苯34.3g，加完后室温搅拌反应10小时。反应结束后过滤，滤液用饱和食盐水洗涤2次，减压浓缩得到固体31.6g。

c)将步骤b)得到的产物31.6g溶于300mL二氯甲烷中，加入三氟乙酸75mL，室温搅拌反应3小时，反应完毕滴加氢氧化钠水溶液50mL，然后混合物依次用水和饱和食盐水洗涤，减压浓缩得到托莫西汀15.3g，总收率为60％。

分别通过核磁共振氢谱和电喷雾电离质谱对产物托莫西汀的产物结构及其分子量进行确认。表征结果如下所示。

¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.19(5H,s),6.65-6.96(4H,s),4.97(1H,t),2.55(2H,t),2.47(3H,s),2.35(3H,s),2.12(2H,td),2.0(1H,NH).

MS(ESI)m/z：(M+H)＝256.1.

ee值>99％。

实施例12

a)按照实施例1或6所述的方法制备(R)-3-(甲基氨基)-1-苯基丙-1-醇41.25g；

b)将步骤a)中制得的(R)-3-(甲基氨基)-1-苯基丙-1-醇41.25g溶于300mL四氢呋喃中，然后加入四三苯基膦钯20.3g和氢氧化钠12.0g，搅拌下加入邻甲基溴苯85.5g，加完后室温搅拌反应12小时。反应结束后过滤，滤液用饱和食盐水洗涤2次，减压浓缩得到固体52.6g，收率为82.6％。

产物的表征结果如下所示。

¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.19(5H,s),6.65-6.96(4H,s),4.97(1H,t),2.55(2H,t),2.47(3H,s),2.35(3H,s),2.12(2H,td),2.0(1H,NH).

MS(ESI)m/z：(M+H)＝256.1.

ee值>99％。

综上可见，本发明的合成方法反应条件温和，原料成本低，对环境友好，反应收率高，且产物光学纯度高，相比于传统的不对称还原制备方法具有明显优势，适合于工业规模化生产。