一种水稻组蛋白脱乙酰化酶及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种水稻组蛋白脱乙酰化酶及其编码基因和应用，属于基因工程技术领域。本发明从水稻(Oryza Sativa L.)中克隆得到了组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示第73位到1449位碱基；编码组蛋白脱乙酰化酶OsHDA705，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该基因属于水稻组蛋白脱乙酰化酶家族RPD3/HDA1亚家族，其作为正调控因子参与了水稻对干旱胁迫的应答过程。通过转基因及功能鉴定证实超量表达OsHDA705能提高水稻对干旱的抗性，OsHDA705基因在培育抗旱植物尤其是水稻新品种方面具有非常重要的理论及应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种水稻组蛋白脱乙酰化酶及其编码基因和应 用。

背景技术

植物在生长发育过程中常常会受到干旱、高盐、高温或寒冷等多种不利环境条件的影响， 这些不利因素在很大程度上限制着农作物的产量和种植分布，成了许多地区农业发展的障碍。 尽快培育出抗逆的作物品种并应用于生产已经成为农业科学技术研究攻关的重要方向。

基因工程技术通过改变一个或几个基因的活性来提高植物的抗逆性，它是在基因水平上 进行的，具有精确性和稳定性，提高了育种的效率，极大地加快了育种进度。随着分子生物 学与基因工程技术的日趋成熟和迅猛发展，通过基因工程手段改良作物的抗性已经受到越来 越广泛的关注和重视。

水稻是我国的主要粮食作物之一，提高水稻的抗逆性对保障我国粮食产量稳定具有重要 意义。缺水是水稻种植中最为常见的非生物胁迫之一，在许多地区是水稻种植的瓶颈。利用 基因工程技术，将抗旱基因转入当前广泛应用的优良水稻品种中，从而改良其抗旱性，是培 育出既抗逆又高产优质的农作物新品种的有效途径之一。

真核生物细胞核中，基因组DNA由组蛋白以及其它一些蛋白共同组成了核蛋白复合物， 也就是常说的染色质。染色质的结构是高度动态的，并且能够被与其相关的一些蛋白所调控。 目前已知水稻中含有18个组蛋白脱乙酰化酶成员，可分为3大亚家族：RPD3/HDA1亚家族14 个成员、SIR2亚家族2个成员和HD2亚家族2个成员(Fu,et al.2007)。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种可用于提高植物抗旱的组蛋白脱乙酰化酶OsHDA705及 其编码基因OsHDA705。

所述的组蛋白脱乙酰化酶OsHDA705，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码上述组蛋白脱乙酰化酶OsHDA705的组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705，其特征在 于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第73位到1449位碱基序列所示。

本发明的第二个目的是提供一种含有所述的组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705的重组表 达载体。

所述的表达载体为任意一种可用于农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹攻击的 载体，如pCAMBIA系列载体、pBI系列载体、pBin系列载体或Gateway^TM系列载体。

本发明的第三个目的是提供组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705在增强植物抗旱中的应 用。

所述的应用优选为在培育抗旱植物品种中的应用。

优选，所述的应用是将所述的组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705导入植物细胞、组织或 器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，使所述的组蛋白脱乙酰化酶基因 OsHDA705在植物中表达，得到抗旱的转基因植物。进一步优选，所述组蛋白脱乙酰化酶基 因OsHDA705是通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官的。

所述的植物优选为水稻。

本发明克隆得到了属于水稻组蛋白脱乙酰化酶家族RPD3/HDA1亚家族的OsHDA705基 因，其作为正调控因子参与了水稻对干旱胁迫的应答过程，通过转基因及功能鉴定证实超量 表达OsHDA705基因能提高水稻对干旱的抗性，OsHDA705基因在培育抗旱植物尤其是水稻 新品种方面具有非常重要的理论及应用价值。

附图说明

图1为超表达载体构建过程中，测序所得的cDNA序列与组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705 序列的比对结果。

图2是20％PEG处理水稻中花11植株0h、1h、3h和6h后OsHDA705基因的表达模式。

图3是用OsHDA705基因引物对OsHDA705基因超表达转基因植株基因组DNA PCR的电泳 图。

图4是野生型植株CK和OsHDA705基因超表达转基因株系OX3、OX7、OX18、OX21、OX33、 OX35和OX44中OsHDA705基因的表达水平检测，HDA705OX3、HDA705OX7、 HDA705OX18、HDA705OX21、HDA705OX33、HDA705OX35和HDA705OX44分别代表 OsHDA705基因超表达转基因株系OX3、OX7、OX18、OX21、OX33、OX35和OX44。

图5是苗龄两周野生型植株CK和OsHDA705基因超表达转基因植株OX3-8-4、OX7-6-1和 OX33-2在标准营养液培养下的表型。

图6是苗龄两周野生型植株CK和OsHDA705基因超表达转基因植株OX3-8-4、OX7-6-1和 OX33-2在含15％PEG标准营养液中生长4天的表型。

图7是苗龄两周野生型植株CK和OsHDA705基因超表达转基因植株OX3-8-4、OX7-6-1和 OX33-2在含15％PEG标准营养液生长4天后在标准营养液中恢复生长7天的表型。

图8是苗龄两周野生型植株CK和OsHDA705基因超表达转基因植株OX3-8-4、OX7-6-1和 OX33-2在含15％PEG标准营养液生长4天后在标准营养液中恢复生长7天的存活率统计。

图9是pCUbiO l301植物双元表达载体图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克等《分子 克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件，或按照所用产品生产 厂商的使用说明。

实施例中所用水稻中花11(Oryza Sativa L.)种子购于广东省农科院；TriZol Reagent购 自Invitrogen公司，其货号为：15596026；逆转录酶M-MLV购自Promega公司，其货号为： M1701；pGEMT载体购自Promega公司，其货号为：A1360；标准营养液为国际水稻所标准 营养液；LB、YM、AAM培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克 隆实验指南》。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

实施例1：OsHDA705基因的克隆

取水稻中花11的幼苗叶片部位，用TriZol Reagent提取叶片总RNA，采用琼脂糖凝胶电 泳和紫外分光光度计检测总RNA的纯度及量，取2μg的总RNA做起始逆转录反应，所采 用的逆转录酶为M-MLV，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以逆转录产物为模 板，采用引物：F：ATGGCGGCGTCCGGCGAGGG，R：CTAGGAATCATCATTCGATT进行 常规PCR扩增，PCR反应条件为：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，45sec；72℃，90sec； 30个循环；72℃，10min。采用琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，连接于pGEMT载体上，连 接反应：PCR产物7μl，pGEM T载体1μl，3U T4ligase 1μl，10×buffer 1μl，共10μl体积， 16℃连接3h。取5μl连接产物，转到大肠杆菌DH5α中，加800μl LB，复苏1h，涂于含100 mg/L氨苄抗生素(Amp)的LB平板上(已经涂布X-gal/IPTG)，37℃过夜。挑取白色克隆， 在LB+Amp(100mg/L)液体培养基中扩增培养，送交测序。逆转录获得的产物cDNA的核苷 酸序列如SEQ ID NO.1所示，开放阅读框从第73位到1449位碱基，长1377bp，如图1所示； 将此开放阅读框命名为组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705，其编码458个氨基酸，其氨基酸 序列如SEQ ID NO.2所示，将该蛋白命名为组蛋白脱乙酰化酶OsHDA705。

实施例2：组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705在逆境胁迫下的表达模式分析

1.胁迫处理：将水稻中花11种子浸泡催芽后，在发芽盒内用标准营养液水培生长，在 25℃，16h光照/8h黑暗光周期条件下的光照培养室中培养两周，光照强度为10000 lux。模拟干旱处理：20％PEG处理0h、1h、3h和6h。将处理的植株用液氮速冻 后于-80℃低温保存。

2.RNA提取：用Trizol reagent进行试验材料的总RNA提取，整个操作过程严格按照 Trizol reagent的RNA提取流程说明进行。

3.逆转录：采用M-MLV逆转录酶逆转录mRNA成cDNA第一链，方法按照试剂说明 书进行。

4.实时定量RT-PCR：根据组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705的核苷酸序列，设计以下 引物对：qHDA705-F：CATGACAGACCATCAGATCCTG；qHDA705-R：CCACTCC ATAACCTACTGCG。将所得cDNA稀释5倍后作为模板，进行实时定量RT-PCR反 应。反应体系及程序参照Premix Ex Taq^TM II(TaKaRa)说明书，在ABI 7 500Real-time PCR仪上进行反应。每个反应设置3个重复，所得数据使用ABI 750 0Real-time PCR system软件进行处理。

5.结果分析：水稻中花11植株中的组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705的表达量，在20％ PEG处理后呈明显上升然后恢复的趋势，结果如图2所示。结果表明水稻中组蛋白脱 乙酰化酶基因OsHDA705受干旱的诱导后表达量明显上升，参与水稻的抗旱胁迫应 答调节过程。

实施例3：转组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705水稻的获得和鉴定

1.目的基因组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705的超表达载体的构建

根据组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705全长设计引物，以水稻中花11的cDNA为模板， 高保真扩增获得组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705全长，同时在两条引物的5’端加上BglⅡ 酶切位点，扩增引物为HDA705OX-F：GAAGATCTATGGCGGCGTCCGGCGAGGG(下划线 部分为BglⅡ酶切位点)；HDA705OX-R：GAAGATCTCTAGGAATCATCATTCGATT(下划线 部分为BglⅡ酶切位点)。扩增产物经BglⅡ酶切纯化后，回收目的DNA片段(1380bp左右)； 用BglⅡ酶切表达载体pCUbiO1301(含有Ubiquitinl启动子)，用T4连接酶连接目的DNA 片段和BglⅡ酶切的表达载体pCUbiO1301，得到目的质粒，然后鉴定插入正反向后，将正向 插入的阳性克隆质粒进行PCR和测序验证。pCUbiO1301载体(如图9所示)是在 pCAMBIA1301载体的基础上接了一个玉米泛素启动子(组成型高表达启动子，Ubi promoter)。 由此将组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705(如SEQ ID NO.1的第73位到1449位碱基所示) 接在玉米泛素启动子后面，构建成组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705超表达载体，将此重组 载体命名为pCUbiOl301-OsHDA705。

2.重组质粒pCUbiO l301-OsHDA705转化到农杆菌EHA105

取1μl重组质粒表达载体pCUbiOl301-OsHDA705与农杆菌EHA105感受态细胞混匀， 冰上放置30min。然后液氮速冻1min后，迅速转到37℃放置5min。加800μl无抗生素的 YM培养基，在28℃中，100RPM转速中培养2-4h。将培养物涂到25mL YM平板，YM培 养基中含卡那霉素和硫酸链霉素，浓度都为50mg/L。将平板倒置放在28℃的培养箱中培养， 直至菌落长出(约2天)。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，菌落鉴定的PCR引物为 HDA705OX-F和HDA705OX-R。选取转入了超表达载体pCUbiO l301-OsHDA705的农杆菌 EHA105克隆作为阳性克隆。

3.农杆菌介导的水稻遗传转化

(1)水稻成熟胚的诱导

水稻成熟种子去壳后，用70％乙醇浸泡1min，0.1％升汞浸泡15min，再用无菌水清洗 4次，每次4min，种子转到无菌滤纸上晾干后，接种在诱导培养基上，26℃暗培养。约10-15 天后，切去胚根和胚乳，转接到继代培养基上，26℃暗培养。两周后继代培养一次，挑选适 合大小、紧密和色泽淡黄的愈伤组织预培养3天。

(2)EHA105农杆菌的培养

将含有超表达载体pCUbiO l301-OsHDA705的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kan和50 mg/L Str的YM平板上划线，28℃黑暗培养3天，挑取单克隆于加有同样抗生素的5ml液体 YM中培养12～24h，然后以1：30的比例于同样的液体YM(30ml)中进行扩大培养4～5h， 5500rpm离心10min后收集菌液，用液体AAM培养基(内含乙酰丁香酮(As)，浓度为100 微摩尔每升)重新悬浮(OD600约为0.5)，置于28℃摇床轻微振荡培养15min，该农杆菌悬 浮液即可用于转化水稻愈伤。

(3)水稻愈伤组织与农杆菌的共培养

挑选状态较好(预培养3天、色泽淡黄)的颗粒状愈伤组织放入50ml无菌三角瓶中， 加入准备好的步骤(2)的农杆菌悬浮液，静置培养20min，每隔5min轻轻摇一下三角瓶。 倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体 共培养基上，22℃黑暗培养3天。

(4)抗性愈伤组织的筛选

将共培养3天后的愈伤组织转到含有500mg/L的头孢霉素(Cef)的灭菌水中清洗，每 次4-5min，共4-5次。然后将愈伤组织置于灭菌过的滤纸上吸干水分。将干燥后的愈伤组织 放在含有50mg/L潮霉素(Hyg)和500mg/L的头孢霉素(Cef)的筛选培养基上，26℃暗培 养2周，转到新配制的筛选培养基上继续筛选2周(大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化， 然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织)。

(5)抗性愈伤组织的分化

从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选一定大小、乳黄色致密的抗性愈伤组织转 至含有50mg/L Hyg和500mg/L Cef的预分化培养基上暗培养7天，然后转至分化培养基上 在16h光/8h黑暗的光周期条件下培养，温度为26℃，光照强度为10000lux，一般经过6-10 天就会有绿点出现，20-30天后进一步分化出小苗。

(6)生根、壮苗和移栽

当抗性愈伤组织分化的芽长至约8cm左右时，将小苗移到生根培养基上，培养两周左右。 选择高约10cm、根系发达的小苗，洗去培养基，在温室内移栽入土。

(7)GUS染色检测转基因阳性植株

将转化得到的幼苗取叶片进行GUS染色。染色后为蓝色的为转基因阳性植株，反之为阴 性植株。

4.转基因植株的分子鉴定

(1)转基因阳性植株的初步分子鉴定：DNA的提取采用CTAB的方法，以转基因植株 的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增引物为HDA705OX-F和HDA705OX-R， 用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。如图3所示：其中M为Marker 2000；所检测的 1到9泳道的转基因植株都为阳性植株。结果表明，pCUbiOl301-OsHDA705重组 质粒已经插入到水稻基因组中，得到转组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705水稻， 即为OsHDA705基因超表达转基因植株。

(2)OsHDA705基因超表达转基因植株目的基因OsHDA705的表达量鉴定：选取7个 (OX3、OX7、OX18、OX21、OX33、OX35和OX44)OsHDA705基因超表达转 基因植株和野生型植株CK，取叶片为材料提取RNA，逆转录成cDNA后用引物 qHDA705-F和qHDA705-R扩增OsHDA705基因。结果如图4所示，在OsHDA705 基因超表达转基因植株中组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705的表达水平都有不同 程度的提高，表明组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705超表达转基因体系成功，转 化所得的OsHDA705基因超表达转基因植株可用于后续的实验。

实施例4：转基因植株抗旱性鉴定

1.组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705超表达转基因株系幼苗干旱胁迫表型鉴定

用标准营养液水培水稻野生型植株CK和OsHDA705基因超表达转基因植株OX3-8-4、 OX7-6-1和OX33-2植株至两周，每个株系取30棵，设置3个生物学重复。将在标准营养液 中生长两周的幼苗(表型如图5所示)在含15％PEG6000的标准营养液中模拟干旱处理4天 (表型如图6所示)，然后移到标准营养液中恢复培养7天(表型如图7所示)。实验表明， 组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705超表达转基因株系的耐旱性明显比野生型高。因此，与野 生型植株相比，超表达组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705后能够显著提高水稻抵御干旱胁迫 的能力。

2.组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705超表达转基因株系幼苗抗旱性测定

用标准营养液水培水稻野生型植株CK和OsHDA705基因超表达转基因植株OX3-8-4、 OX7-6-1和OX33-2植株至两周，每个株系取30棵，设置3个生物学重复。将在标准营养液 中生长两周的幼苗用含15％PEG标准营养液处理4天后，在标准营养液中恢复7天。以植株 叶片全部发生卷曲为标准，统计野生型植株CK和OsHDA705基因超表达转基因植株干旱胁 迫处理后的存活率。结果显示，组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705超表达转基因株系的存活 率明显高于野生型植株，结果如图8所示，说明OsHDA705基因超表达转基因植株保水能力 较好，抗旱能力比野生型强。