一种快速定量检测猪流行性腹泻病毒的免疫荧光试纸条及其制备方法

摘要

本发明公开了一种快速定量检测猪流行性腹泻病毒的免疫荧光检测试纸条及其制备方法，本发明试纸条含有样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，结合垫上含有荧光微球标记的抗PEDV单域抗体，该单域抗体对抗原PEDV具有高特异性和高灵敏性。本发明基于新发现的特异性单域抗体与抗原的免疫学原理检测养殖猪粪便中的PEDV病毒或饲料血浆蛋白中PEDV的污染，可用于进行现场快速检测或实验室检测，只需5-10min；若与荧光定量检测仪连用，可实现定量检测；操作简单方便，操作人员不需要专业培训，且不需要专门实验室，克服了现有检测方法的局限性，具有良好的市场前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速定量检测猪流行性腹泻病毒的免疫荧光试纸条及其制备方法。

背景技术

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea, PED）是由冠状病毒科猪流行性腹泻病毒引起的一种侵害猪肠道的急性传染病。能够引起各年龄的猪发生呕吐、腹泻和脱水。各年龄猪均易感，尤其是对1周龄内的新生仔猪危害最大。新生仔猪的发病率可达60%-100%，死亡率高达100%。导致仔猪的大批死亡，生猪出栏率下降，造成市场猪肉供应不足，影响猪肉价格稳定。本病在欧洲和亚洲传播非常广泛，每年都会给一些国家和地区造成严重的经济损失，给养猪业带来了巨大的危害。2013年和2014年PEDV分别席卷了美国和加拿大的养猪业。加拿大食品检验局（CFIA）于2014年3月份发布公告认为血浆蛋白粉有可能是猪流行性腹泻的罪魁祸首。因为仔猪饲料生产中会添加血浆蛋白粉，所以为PEDV的大规模传播提供了潜在的机会。为了降低饲料中携带PEDV病原的风险，我们急需一种简单快速的方法对原料中的PEDV病原进行检测，降低饲料携带病原的风险；同时对疾病做出早期诊断，提前采取防控措施，也是降低养殖户因疾病带来的损失的最好途径。

目前常用的检测PEDV的方法有病毒分离鉴定、RT-PCR、ELISA法、免疫荧光法（IF）和胶体金。其中病毒分离鉴定、RT-PCR、ELISA法、免疫荧光法（IF）必须结合实验室方法进行确诊，操作繁琐费时，需要专门的试验技术人员和仪器设备，只能用于实验室检测。不适合于现场检测和基层兽医工作人员的使用。另外，由于PEDV可造成持续感染，这给PEDV的临床检测带来了巨大的困难。

关于PEDV的快速诊断试纸条我国目前还没有同类产品上市，市场上有韩国进口的PEDV胶体金检测试纸条在销售，但其只能进行PEDV的定性不能定量，且成本过于昂贵，普通养殖户使用不起；且其灵敏度不是很高。因此建立PEDV的快速检测方法，用于PEDV的感染早期和现场快速检测，有利于对感染PEDV的母猪进行及时免疫，防止疾病的扩散，有利于养猪业的健康发展；同时对饲料原料血浆蛋白的污染源进行质量控制，降低从饲料途径造成PEDV流行的风险。以抗PEDV的纳米抗体研制PEDV病原的快速检测方法，在国内外尚未见报道。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明通过研究，制备了一种特异性高、灵敏度高的纳米抗体（抗PEDV单域抗体），并基于此抗体制备了一种能够快速定量检测猪流行性腹泻病毒的免疫荧光检测试纸条。

本发明的目的在于提供一种快速定量检测猪流行性腹泻病毒的免疫荧光试纸条。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于检测猪流行性腹泻病毒的单域抗体，其氨基酸序列为如SEQ ID NO：6所示。

一种用于检测猪流行性腹泻病毒的单域抗体，编码该单域抗体氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

一种快速定量检测猪流行性腹泻病毒的免疫荧光试纸条，包含附着于底板上且依次紧密相连的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫；所述结合垫上含有荧光微球标记的抗PEDV单域抗体；所述层析膜上设置有一条检测线和一条质控线，检测线靠近结合垫，质控线靠近吸水垫，检测线上包被有抗PEDV的多克隆抗体，质控线上包被有能与荧光微球标记的抗PEDV单域抗体结合的蛋白；

其中所述的抗PEDV单域抗体为上述所述的单域抗体。

进一步的，上述质控线上包被的能与荧光微球标记的抗PEDV单域抗体结合的蛋白为兔抗双峰驼IgG。

进一步的，上述样品垫为玻璃纤维膜。

进一步的，上述层析膜为硝酸纤维素膜。

进一步的，上述吸水垫为吸水纸。

进一步的，上述质控线和检测线之间的距离为4.5~5.5mm。

进一步的，上述质控线用0.5～1.5mg/mL兔抗双峰驼IgG进行包被，用量为1 μL/cm。

进一步的，上述检测线用0.8～1.2 mg/mL抗PEDV多克隆抗体包被，用量为2μL/cm。

本发明的有益效果是：

1）本发明制备的免疫荧光快速试纸技术是应用纳米荧光颗粒（荧光微球标记的PEDV单域抗体）构建出一种可定性同时定量的快速检测试纸。操作者无需培训和专业知识，操作简单，5~10分钟即可获得结果，若与荧光定量仪连用，可实现定量检测，同时该技术灵敏度明显优于传统的胶体金检测试纸技术，具有广阔的市场前景。

2）抗体作为免疫试纸条检测技术的核心部分，其特异性及亲和力决定了测定结果的准确性和灵敏度。本发明采用了特定制备的高灵敏的、PEDV特异性的单域重链（VHH）抗体，研制成检测PEDV病原的快速检测试纸，目前在国内外均未见报道。

附图说明

图1为实施例1中RT-PCR扩增VHH基因片段的结果图；

图2为SDS-PAGE检测PEDV单域抗体的结果；

图3为PEDV免疫荧光快速检测试纸条的结构示意图，其中1 为塑料底板，2 为样品垫，3 为结合垫，4 为硝酸纤维素膜，5 为吸水纸，6 为检测线T，7为质控线C。

具体实施方式

实施例1 猪流行性腹泻病毒重链单域抗体的制备

1）动物免疫

在双峰驼颈背部皮下和双侧后腿皮下进行多点接种PEDV灭活疫苗。首次免疫剂量为1mL/头，共2头；7天后二免，2 mL/头；之后间隔14天免疫一次，每次免疫4 mL，共免疫3次，全程共免疫5次。最后一次免疫后7天采血500 mL分离淋巴细胞，提取总RNA进行下一步实验。

2）单域抗体库的构建

设计引物扩增VHH基因片段，通过前期大量实验研究筛选出效果最好的引物，其序列如下：

VHH-F：5’- CCTTTCTATGCAGGCCCAGCCGGCCGCA-3’（SEQ ID NO：1）；

VHH-R：5’- GTTATTATTATTCAGATTATTATGCGGCC-3’ （SEQ ID NO：2）。

利用引物VHH-F 和VHH-R对所提取的总RNA进行RT-PCR扩增，获得大小约500bp的条带（如图1所示），将该目的条带和载体pCANTAB-5E（购自广州创伟生物技术有限公司）分别经Sfi I和Not I双酶切后，再连接并转化大肠杆菌TG1，涂布Amp^rLB平板进行筛选，过夜培养后洗下所有菌落用含20%甘油的LB培养基保存，冻于-70℃备用，获得抗PEDV的单域抗体基因库。

取上述单域抗体基因库与辅助噬菌体M13K07进行混合培养12小时后，4000rpm离心10min，取上清于灭菌离心管中，冰浴1h后，9000rpm离心15min，弃上清，沉淀用PBS悬浮，然后12000g离心10min确保细菌充分分离，收集上清，即为噬菌体单域抗体库。

3）特异性单域抗体的筛选

以PEDV抗原包被ELISA板，对上述噬菌体单域抗体库进行淘洗筛选，经3轮筛选后，筛选到2个阳性克隆与PEDV特异性反应、且与抗原结合灵敏度较高，分别命名为Clone1和Clone2，对获得的阳性克隆分别进行DNA测序分析，测序结果显示Clone1、Clone2中目的基因片段大小分别为477bp（SEQ ID NO：3）、474bp，经氨基酸比对，Clone1和Clone2中单域抗体的氨基酸序列均为VHH重链抗体序列。

4）单域抗体的诱导表达及验证

1. SDS-PAGE实验

将上述实施例1中获得的2个阳性克隆利用含有EcoR I和BamH I位点的引物进行PCR扩增（分别以Clone1、Clone2噬菌体DNA为模板），其中引物序列为：

VHH-F1：5’- AGAATTCCCTTTCTATGCAGGCCCAGCCGGCCGCA-3’ （SEQ ID NO：4），

VHH-R1：5’- ACGGATCCGTTATTATTATTCAGATTATTATGCGGCC-3’ （SEQ ID NO：5）；

将PCR扩增片段凝胶回收后经双酶切，酶切片段与表达载体pSMK连接，构建单域抗体重组表达载体，并转化大肠杆菌BL21分别获得重组菌BL21-1、BL21-2，经IPTG诱导表达，分别提取、纯化目的蛋白（即为PEDV单域抗体）。利用SDS-PAGE对表达产物进行鉴定，结果显示，特异性蛋白带出现在14.3KD左右，与预期大小相符（如图2所示）。

2.抗原结合能力实验

用ELISA方法检测上述筛选出的单域抗体（即上述重组菌BL21-1和BL21-2表达的目的蛋白）与抗原结合的能力，结果显示，重组菌BL21-1表达的目的蛋白（即Clone1体内目的基因编码的蛋白）与PEDV抗原结合的能力较高，灵敏度更高，而重组菌BL21-2表达的目的蛋白与PEDV抗原的结合能力相对较弱（如表1所示）。所以选用组菌BL21-1表达的目的抗体蛋白（即Clone1体内目的基因编码的抗体）进行后续试纸条的研制。

表1 2个阳性克隆中表达的单域抗体与抗原PEDV的结合能力检测

实施例2  PEDV多克隆抗体的制备

使用PEDV灭活疫苗免疫昆明小鼠，0.5mL/只，共5只，首免后7天进行二免，1mL/只；之后每隔14天进行免疫1次，1mL/只，共免疫3次。最后1次免疫结束后7天采血检测血清效价，结果为阳性的收集全部血液分离血清作为PEDV多克隆抗体备用。

实施例3  PEDV免疫荧光快速检测试纸条的制备

1）PEDV单域抗体的制备

将上述实验例1中获得的重组菌BL21-1进行IPTG诱导表达、提取、纯化目的蛋白，即得PEDV单域抗体；

2）PEDV单域抗体-荧光微球探针的制备

荧光微球羧基化：将100uL荧光微球（购自广州美津泰生物技术有限公司）溶于500 μL纯净水中，然后分别加入终浓度为10 mg的EDC和6 mg的NHS，27℃孵育30min，反应液4℃，10000 rpm/min，离心1min，弃去上清，重复3次，去除多余的EDC和NHS。沉淀用500μL PBS重悬，超声5min，即可。

PEDV单域抗体-荧光微球探针的制备：将500μL上述已羧基化的荧光微球溶液与100 μL浓度为0.2~1.0mg/mL步骤1）制备的PEDV单域抗体混合，室温反应3h；然后加入5μL 10%BSA来封闭微球的剩余羧基，孵育1.5h，4℃ 8000rpm/min离心5min，弃去上清未结合的抗体。用200 μL 含有1%BSA、2%Tween-20和25%海藻糖的pH7.2 PBS（盐离子浓度为10mM）重悬，即为制备好的PEDV单域抗体-荧光微球探针，4℃保存备用。

3）抗PEDV单域抗体-荧光微球探针结合垫的制备

将聚酯纤维膜用0.1% Tween-20处理10min，60℃抽风烘干，将上述制备的抗PEDV单域抗体-荧光微球探针按1.5 μL/cm喷于聚酯纤维膜结合垫上，37℃抽风烘干，室温干燥环境下保存备用。

4）硝酸纤维素膜的包被

使用自动喷膜仪在硝酸纤维素膜（NC膜）上喷C、T线（如图3所示）。C线为质控线，包被兔抗双峰驼IgG，浓度为0.5～1.5mg/mL，优选1 mg/mL，喷量为1 μL/cm；T线为检测线，包被实施例2制备的PEDV多克隆抗体，浓度为0.8～1.2 mg/mL，喷量为2 μL/cm；C、T线之间的距离为5mm。将喷好的NC膜在37℃温箱中烘干，得到包被后的NC膜。

5）样品垫的制备

将玻璃纤维膜用含2%（w/v）PVP、3% Tween-20和2%（w/v）PEG的10mmol/L pH7.2 PBS饱和处理，37℃抽风烘干，室温干燥条件保存备用。

6）PEDV免疫荧光快速检测试纸条的组装

如图3所示，将上述制备好的样品垫2、PEDV单域抗体-荧光微球探针结合垫3、包被后的硝酸纤维素膜4、吸水纸5由一端依次粘贴在塑料底板1上，样品垫2与结合垫3重叠部分的宽度为2mm、结合垫3与包被后的硝酸纤维素膜4重叠部分的宽度为2mm。

首先，在塑料底板1的中心黏贴上包被后的硝酸纤维素膜4；在硝酸纤维素膜4靠近质控线 7的一端搭接黏贴上吸水纸5；在硝酸纤维素膜4的另一端搭接黏贴上结合垫3；在结合垫3的另一端搭接黏贴上样品垫2，得到PEDV免疫荧光快速检测试纸条。

上述试纸条检测结果的判断：

①    若检测线T和质控线C 在紫外激发光照射下同时显现绿色荧光印迹，表示检测结果为阴性，说明被检测样本中不含PEDV，或其的浓度小于10⁴TCID₅₀/mL；

②    检测线T 在紫外激发光照射下不显现绿荧光印迹，只有质控线C 在激发光下显现绿色荧光印迹；或者T线比C线颜色浅；表示检测结果为阳性，说明被检测样品中含PEDV，且浓度大于或等于10⁴TCID₅₀/mL；

若将PEDV免疫荧光检测试纸条与荧光定量检测仪连用，可实现定量检测。

实施例4  PEDV免疫荧光检测试纸条特异性试验

用实施例3制备的试纸条分别检测猪传染性胃肠炎（TGEV）、猪轮状病毒（Prov）的细胞培养液，猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪蓝耳病毒（PRRS）、口蹄疫病毒（FMDV）阳性样品以及PEDV阳性样品。结果显示试纸条检测PEDV阳性样品为阳性反应，其它样品均为阴性。表明试纸条特异性良好。

实施例5 PEDV免疫荧光试纸条敏感性试验

将PEDV的细胞培养液进行倍比稀释，样品浓度分别为10⁷TCID₅₀/mL、10⁶TCID₅₀/mL、10⁵TCID₅₀/mL、10⁴TCID₅₀/mL、10³TCID₅₀/mL，试验结果表明，10⁷TCID₅₀/mL、10⁶TCID₅₀/mL、10⁵TCID₅₀/mL、10⁴TCID₅₀/mL均为阳性，与进口普通胶体金试纸条对比发现，进口试纸条的检测限为10⁵TCID₅₀/mL，本发明的荧光试纸条比其敏感10倍。

实施例6 PEDV免疫荧光检测试纸条临床应用

将猪的粪便用棉签蘸取后放入样品处理液中搅拌混匀，或取少许血浆蛋白加入样品处理液中混匀，1-2分钟后取上清3-5滴滴加于上述PEDV免疫荧光快速检测试纸条的样品垫上，加样后5-10min后，观察T线和C线的颜色的不同，来判断待测样品中是否含有PEDV病毒。若样品中PEDV的浓度小于10⁴ TCID₅₀/mL，则T线显色与C线相同，结果为阴性；若样品中PEDV的浓度大于或等于10 ⁴ TCID₅₀/mL，则T线比C线颜色浅或完全看不到线，颜色越浅则样品中PEDV的浓度越高，结果即为阳性。若将PEDV免疫荧光试纸条与荧光定量检测仪连用，可实现定量检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>  广东海大畜牧兽医研究院有限公司

 

<120>  一种快速定量检测猪流行性腹泻病毒的免疫荧光试纸条及其制备方法

 

<130> 

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

cctttctatg caggcccagc cggccgca                                          28

 

 

<210>  2

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gttattatta ttcagattat tatgcggcc                                         29

 

 

<210>  3

<211>  477

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

agaattccct ttctatgcag gcccagccgg ccgcatctgc aggagtctgg gggaggattg       60

 

gtgcaggctg ggggctctct gagactctcc tgtgcagcct ctggcgacac cgaaagtatc      120

 

gttaccatgg cctggttccg ccaggctcca gggaaggagc gtgagtttgt agcggctatt      180

 

acacggagtg gcgacagccg ggcgagtggt ggtatgacgg actatgcaga ctccgtggta      240

 

gcggctatta cacggagtgg cgacagccgg gcgagtggtg gtatgacgga ctatgcagac      300

 

tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaacgcca agaacacggt gtatctgcaa      360

 

atgaacagcc tgaaacttga ggacacggcc gtttattact gtttagcaga caaaactacg      420

 

tattggaata ttccccggga tgagtatgac tactggggcc aggggaccca ggtcacc         477

 

 

<210>  4

<211>  35

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

agaattccct ttctatgcag gcccagccgg ccgca                                  35

 

 

<210>  5

<211>  37

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

acggatccgt tattattatt cagattatta tgcggcc                                37

 

 

<210>  6

<211>  159

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  6

 

Arg Ile Pro Phe Leu Cys Arg Pro Ser Arg Pro His Leu Gln Glu Ser

1               5                   10                  15     

 

 

Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

            20                  25                  30         

 

 

Ala Ser Gly Asp Thr Glu Ser Ile Val Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln

        35                  40                  45              

 

 

Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly

    50                  55                  60                 

 

 

Asp Ser Arg Ala Ser Gly Gly Met Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Val

65                  70                  75                  80 

 

 

Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Asp Ser Arg Ala Ser Gly Gly Met Thr

                85                  90                  95     

 

 

Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

            100                 105                 110        

 

 

Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Leu Glu Asp

        115                 120                 125            

 

 

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Ala Asp Lys Thr Thr Tyr Trp Asn Ile

    130                 135                 140                

 

 

Pro Arg Asp Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

145                 150                 155