桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因及应用

摘要

本发明公开了桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因及应用，所述内参基因为OfACT和OfEF1α；其中，所述内参基因OfACT的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，内参基因OfEF1α的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。本发明桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因OfACT和OfEF1α基因是桂花不同发育时期花序中表达最稳定的两个内参基因，该两个基因表达的稳定性优于现有技术中的其他基因，作为荧光定量内参基因能为桂花不同发育时期花序中获得功能基因表达的精确定量数据提供有力支持。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因及应 用。

背景技术

桂花(Osmanthus fragrans Lour.)是我国十大传统名花之一，也是我国重要的园林植物之 一。根据花期桂花可分为秋桂和四季桂两大类，秋桂又可根据花色分为金桂(Luteus group， 黄色至金黄色系)、银桂(Albus group，黄白色至黄色系)和丹桂(Aurantiacus group，橙色 至橙红色系)品种群。导致秋桂不同品种群花色差异的分子机制一直是科学家们感兴趣的领 域。

对于桂花不同花色品种，类胡萝卜素的种类及其含量是决定其花色呈现的最主要因素。 参与调控类胡萝卜素代谢的相关基因的表达分析试验，是近年来研究秋桂不同品种群花色差 异的分子机制的重要手段，因此研究者常利用实时荧光定量PCR技术研究不同花色品种群桂 花不同发育时期花序中胡萝卜素代谢的相关基因的表达水平。

荧光实时定量PCR(qRT-PCR)由于其敏感性高及特异性好被广泛应用于基因表达研究， 而其结果的准确性在很大程度上取决于内参基因的稳定性。理想的内参基因应该在不同的基 因型、不同发育阶段、不同组织器官和不同胁迫条件下恒定表达，但事实上这样的理想内参 基因根本不会存在。因此，需要根据不同物种及不同试验条件筛选合适的内参基因，这对获 得准确的qRT-PCR实验结果是非常重要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是筛选出桂花不同发育时期花序中表达最稳定的内参基因，能 为桂花不同发育时期花序中获得功能基因表达的精确定量数据提供有力支持。

桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因，所述内参基因为OfACT和OfEF1α；其中，所 述内参基因OfACT的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，内参基因OfEF1α的核苷酸 序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

本发明所述的桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因，其中所述OfACT基因的特异性 引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，所述OfEF1α基因的特异 性引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

OfACT基因的特异性引物为：

OfACT-F：5′-CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT-3′

OfACT-R：5′-ACCCCATCACCAGAATCAAGAA-3′；

OfEF1α基因的特异性引物为：

OfEF1α-F：5′-CGTTTGCCACTTCAGGATGTCTA-3′

OfEF1α-R：5′-GTACCAGGTTTCAGGACTCCAGTTT-3′。

本发明所述的内参基因OfACT和OfEF1α在相对定量法实时荧光定量PCR中的应用，桂 花不同发育时期花序中功能基因表达试验中采用内参基因定量，所述桂花OfACT和OfEF1α 基因在相对定量法实时荧光定量PCR中作为内参基因使用。

本发明内参基因的具体筛选步骤为：

1.候选内参基因序列的获得：选取桂花Actin(OfACT)、Elongation factor-1α(OfEF1α)、 NADP-isocitrate dehydrogenase(OfIDH)、GTP-binding protein RAN1(OfRAN1)、Beta-tubulin (OfTUB)、Ubiquitin-conjugating enzyme E2(OfUBC2)和18S ribosomal RNA(Of18S)共7 个内参基因作为内参基因的候选基因。

2.引物设计：根据获得的候选基因序列设计该基因相应的特异引物(扩增产物单一，具 体为溶解曲线峰单一，2％的琼脂糖胶检测条带单一)。

3.PCR模板的准备：收集样品后，用RNA提取试剂盒(RNAprep pure Plant Kit，天根) 提取样品总RNA，然后用cDNA反转试剂盒(Reverse Transcriptase M-MLV，Takara)按照说 明书反转cDNA的第一链，作为荧光定量PCR的模板。

4.荧光定量PCR反应：以反转的cDNA为模版，用内参基因相应的特异引物在ABI 7300  real-time PCR仪中进行扩增。获得各个基因的表达数据Ct值。

5.根据所得Ct值通过GeNorm v3.4软件计算候选内参基因的稳定性，筛选出表达最稳 定的内参基因并确定最优内参基因数目。

本发明桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因与现有技术不同之处在于：本发明桂花 花序不同发育时期荧光定量内参基因OfACT和OfEF1α基因是桂花不同发育时期花序中表达 最稳定的两个内参基因，该两个基因表达的稳定性优于候选的另外五个内参基因，作为荧光 定量内参基因能为桂花不同发育时期花序中获得功能基因表达的精确定量数据提供有力支 持。

本发明桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因的有益效果：

1.本发明首次从七种候选内参基因中筛选出桂花不同发育时期花序中表达最稳定的内 参基因，数据真实可靠。

2.筛选出的内参基因适用于桂花不同发育时期花序中类胡萝卜素代谢相关基因或其他 功能基因的表达分析，能显著提高所得数据的准确性。其应用较为普遍，操作相对简单，成 本较低，灵敏度高，精确度高。

3.本研究筛选出的内参基因是经过严格的内参筛选程序选出的，是桂花不同发育时期花 芽中表达最稳定的内参基因。

下面结合附图对本发明的桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因作进一步说明。

附图说明

图1为本发明中GeNorm软件计算出的各内参管家基因表达稳定值；

图2为本发明中GeNorm软件通过成对变异系数(Vn/Vn+1)确定最适合的内参基因的数目。

具体实施方式

实施例1

桂花不同发育时期花序中表达最稳定的内参基因的筛选，包括如下步骤：

1.实验材料取样：浙江农林大学平山苗圃十年生地栽桂花‘堰虹桂’为实验材料，分别 于2014年8月9日、8月15日、8月22日、8月29日、9月4日、9月10日、9月17日、 9月23日、9月24日和9月25日对不同发育状态花序进行取样，其中9月17日花序状态为 圆珠期，9月23日花序状态为铃梗期，9月24日花序状态为半开期，9月25日花序状态为 盛开期。花芽样品离体后速冻于液氮中，然后至于-80℃保存。

2.花序材料总RNA提取：采用RNAprep pure Plant Kit(天根)按照说明书步骤提取花 序样品总RNA。

3.cDNA的第一链的合成：

采用Reverse Transcriptase M-MLV(Takara)按照说明书将步骤2获得的总RNA反转成 cDNA，作为荧光定量PCR模板。

(1)在0.2ml的PCR管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量6μl：

(2)70℃孵育10min后迅速在冰上急冷2min；

(3)离心数秒钟使上述模板RNA/引物变性溶液聚集于PCR管底部；

(4)在上述PCR管中配制下列反转录反应液：

(5)42℃孵育1h后，70℃孵育15min后冰上冷却，储存于-20℃备用。

4.以获得七个内参基因序列为基础，利用DNAMAN和Primer5.0软件，遵循实时荧光 定量PCR引物设计的原则设计实时荧光定量PCR引物，其扩增片段为100bp，实时荧光定 量PCR特异引物序列如表1所示。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(PAGE纯化 法)。

表1本发明中七个内参基因的基因名、功能注释、引物序列、扩增长度、PCR扩增效率和回归系数

5.利用两步法来进行实时荧光定量PCR，在7300real time PCR仪(Applied Biosystems) 运行。基于SYBR Green染料的qPCR来检测内参基因的Ct值，所用反应体系和程序参考 Takara公司的Premix Ex Taq^TMII(Tli RNaseH Plus)试剂盒的说明书。PCR反应体系为 20μl，其中2×SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)10μl，上下游定量引物10μM各0.8μl， 模板cDNA 2μl，50×ROX Reference Dye 0.4μl，用灭菌双蒸水补齐至20μl。荧光定量PCR 扩增采用两步法，即在95℃预变性30s之后，先运行40个循环的95℃ 5s，60℃ 31s，再 运行溶解曲线阶段的95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 30s，60℃ 15s。通过观察ABI 7300  real-time PCR仪在PCR反应后生成的溶解曲线为单一峰判定所用引物无非特异扩增；实验得 到定量Ct值(表2)用于后期内参基因稳定性分析。

表2桂花不同发育时期花序中的内参基因Ct值

6.用GeNorm软件分析七个内参基因表达的稳定性：利用步骤5中获得的Ct值(表2)， 用GeNorm软件计算选出七个内参基因表达的稳定性(图1)，其中稳定值最小的两个内参基 因为OfACT和OfEF1α。

7.根据PV值确定n的值：PV值以0.15为筛选标准，图2的柱状图里第一个小于0.15 的值是第一条柱图，已用星号标出，对应的横坐标是V₂/V₃(V_n/V_n+1)，所以桂花不同发育时 期花序中进行基因表达分析所需的最小内参基因数目n＝2，即OfACT和OfEF1α这两个基因 组合作为桂花不同发育时期花序中进行功能基因表达分析的荧光定量内参基因。同时使用 OfACT和OfEF1α这两个稳定表达的内参基因作为内参：两个基因内参的表达量Ct值为OfACT 和OfEF1α基因在桂花不同发育时期花序中的表达量Ct值的算术平均数，通过以上两个基 因内参校正实验误差，能够提高实验的准确性。

本发明的内参基因不局限于桂花‘堰虹桂’品种，经研究发现，在桂花的其他品种中也 适用，得到了相似的试验结果。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行 限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的 各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。