一种人源产肠毒素大肠杆菌粘附素EtpA融合蛋白及其应用

摘要

本发明公开了一种人源肠毒素大肠杆菌粘附素EtpA融合蛋白及其应用，本发明提供了一种含有人源肠毒素大肠杆菌的粘附素基因的重组质粒pGEX-etpA，将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，诱导重组表达菌BL21(DE3)/pGEX-etpA表达融合蛋白EtpA。利用表达的重组蛋白主动免疫初产蛋鸡，制备了针对这种蛋白的卵黄抗体，提取的卵黄抗体验证了重组蛋白具有良好的抗原性，并利用小鼠肠道攻毒试验及体外实验，证明提纯的卵黄抗体能够抑制ETEC菌株在小鼠肠道内及体外对上皮细胞的粘附。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种人源产肠毒素大肠杆菌粘附素EtpA融 合蛋白及其应用，通过构建人源产肠毒素大肠杆菌的粘附素基因etpA重组质粒pGEX-etpA， 将其转入大肠杆菌表达融合蛋白，免疫蛋鸡，提纯的卵黄抗体能够抑制ETEC菌株在小鼠肠 道内及体外对上皮细胞的粘附。

背景技术

产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是引起腹泻的主要致病菌 （Black1990;Ericsson2003）。据统计每年ETEC可在5岁以下儿童中引起2.8-4亿次腹泻， 病情轻重不等，可以仅有轻微腹泻，也可呈重症霍乱样，导致每年约30-50万婴幼儿死亡 （WHO2004）。它还与诸多患儿的营养不良以及发育迟缓相关（Qadri et al2007;PGEX-KGri  et al2008）。ETEC腹泻在非洲、亚洲及拉丁美洲的旅行者腹泻中也占到1/3-1/2（WHO2004）。 ETEC腹泻的致病机理是通过粘附素，首先粘附到宿主的小肠粘膜刷状缘上皮细胞的受体上， 抵抗肠道蠕动及内容物的清洗，实现定殖后并释放一种或两种肠毒素（enterotoxin），引起 细胞内水和电解质平衡失调，从而产生水样腹泻（Natro and Kaper1998;Sack1980）。粘附 素和肠毒素是传统ETEC疫苗研究中不可或缺的重要抗原（Svennerholm and Tobias2008）。

过去认为粘附素主要指菌毛粘附素即菌体表面菌毛抗原CFAs或CS。目前人源ETEC 中已鉴定超过22种CFAs，常见的有CFA/I，CS1-CS7，CS14，CS17，CS21（Qadri et al2005）， 但异源菌毛间无交叉保护作用（Qadri et al2006）。另外研究发现粘附过程也需要非菌毛粘附 素的参与。大肠杆菌包括ETEC均会在周身或两端生出鞭毛，数量较菌毛少，但长度是菌体 的若干倍。近年来研究表明除了遍布菌体表面的菌毛外，端生的鞭毛不仅可以作为运动器官， 而且这种运动性（motility）在一些革兰氏阴性菌定植、入侵及促炎反应等致病过程起作用， 如沙门氏菌（Allen-Vercoe et al1999）、鸡致病性大肠杆菌（La Ragione et al2000）。

Roy等（2006）以转座质粒发现了ETEC分泌的一种蛋白EtpA，是双伴侣分泌素（TPS） 的成员之一，为ETEC所特有。分布在59%的CFAI、56%的CFAⅡ、75%的CS14或CS17 的ETEC菌株中，而这几种菌毛类型占据约60%的ETEC（Wolf1997）。研究阐明了EtpA 在细菌粘附中是通过在胞外与鞭毛蛋白（FliC）的保守区互作，介导鞭毛与宿主细胞的桥梁 作用发挥的（Roy et al2009a）。细胞试验通过缺失和重组证实这种互作对于ETEC的有效定 植具有关键作用，即EtpA或fliC缺失菌株粘附细胞能力相比野生型大大降低，或在培养基 中添加二者的抗体也会减少粘附的细菌数，而外源添加重组蛋白或同源重组该基因可使缺失 株重新获得粘附细胞的功能（Roy et al2009a）。

通常鞭毛蛋白的保守区隐藏于鞭毛颈部，但它可以瞬间暴露在鞭毛顶端，捕捉EtpA分 子用于识别真核细胞表面受体。鞭毛介导粘附没有血清型限制，如在flic（H11）突变株中 重组flic（H48）可以重新获得运动及粘附能力。另外用相同的抗EtpA血清可抑制多种H 血清型的ETEC对上皮细胞的粘附。在小鼠模型中，用rEtpA与rFliC鼻饲免疫小鼠，获得 了与体外试验相似的结果，且二者同时使用的抑粘附效果优于单独使用（Roy et al2008, 2009b）。这种新型粘附机制存在于多数ETEC中，并且其他与EtpA同源的蛋白分子在各自 的革兰氏阴性菌中也可能采用这一类似的作用方式，虽然具体的介导过程尚不清楚，但推测 两种蛋白可以作为新型广谱疫苗研制的候选抗原。

大量的试验结果表明，通过给幼龄动物提供外源抗体（包括血液抗体和卵黄抗体）提高 其被动免疫水平，来预防和治疗细菌和病毒的感染（特别是肠道腹泻）是行之有效的途径 （Hatta et al1993b;王劼2007）。卵黄免疫球蛋白（Egg yolk immunoglobulin,IgY）成为一 种颇具潜力的抗生素替代品。美国FDA将其列入“一般公认安全物质”（Coleman1996）。目 前针对各种胃肠道疾病的IgY开发已有广泛研究。研究者以菌毛作为抗原制备IgY治疗ETEC 腹泻（Yokoyama et al1992;Ikemori et al1992;Marquardt et al1999）。最早的报道来源于口 服抗菌毛卵黄抗体可防止K88、K99和987P ETEC感染（Yokoyama et al1992）。仔猪出生后 4h即感染ETEC，治疗组（口服IgY）基本全部存活，且表现出剂量依赖效应，安慰剂和对 照组死亡率大于75%，在体外加入IgY也同样抑制了ETEC对猪肠细胞粘附。Marquardt等 （1999）也用提纯K88菌毛蛋白免疫蛋鸡制备卵黄抗体，对出生3日龄和21日龄断奶仔猪进 行攻毒治疗，其中3日龄组仔猪的腹泻在口服IgY24h后全被治愈，而普通IgY组的腹泻持续 且死亡率达62.5%；断奶仔猪在攻毒后口服IgY出现了短暂腹泻，全部存活且体重增加，而 对照组也出现严重腹泻和脱水，且感染48h后即出现死亡病例。王劼（2007）口服抗ETEC 菌毛亚单位卵黄抗体可以对仔猪提供有效的被动免疫保护，抵抗肠道病菌的感染。

基于以上研究背景，本研究以EtpA为候选抗原，利用基因工程方法克隆表达在细菌粘 附上皮细胞过程中的关键基因EtpA与，获得大量目的蛋白。结合IgY技术，即通过免疫蛋鸡 来生产针对EtpA的特异性卵黄抗体，旨在开发出一种成本低廉的具有广谱性抗腹泻功能的 保健蛋食品。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种含有人源ETEC粘附素基因etpA的重组质粒pGEX-etpA， 其序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了一种含有重组质粒pGEX-etpA的基因工程菌 BL21(DE3)/pGEX-etpA。将重组质粒pGEX-etpA转化入大肠杆菌（Escherichia coli）BL21 （DE3），获得的的基因工程菌能够表达粘附素EtpA融合蛋白。

本发明的还有一个目的在于提供了一种人源产肠毒素大肠杆菌粘附素EtpA融合蛋白， 其序列为SEQ ID NO.2所示。该融合蛋白免疫原性好，生产成本低。将该蛋白免疫蛋鸡后， 可获得具有抗ETEC的鸡蛋。

本发明还有一个目的在于提供了一种利用EtpA融合蛋白制备的卵黄抗体。该卵黄抗体 具有抑制ETEC粘附的作用。

本发明最后一个目的在于提供了一种卵黄抗体在制备抗人源产肠毒素大肠杆菌免疫疫 苗中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种含有人源ETEC粘附素基因etpA的重组质粒pGEX-etpA的制备方法（图1、2）， 其具体步骤如下：

在NCBI的GenBank中查找序列号为AY920525的基因座，其中etpA位于编码区 2718-8021，全长5304bp，目的片段是5'端的1701bp。以人源产肠毒素大肠杆菌标准株H10407 为试验材料，设计引物，将PCR扩增后的目的片段连接至表达载体，成功构建了在细菌粘 附上皮细胞过程中的关键基因etpA基因的重组表达质粒。对重组质粒进行酶切鉴定和测序， 结果显示构建正确，将其命名为pGEX-etpA，其序列为SEQ ID NO.1所示。

一种人源产肠毒素大肠杆菌粘附素EtpA融合蛋白，其制备步骤如下：

将重组质粒pGEX-etpA转化入大肠杆菌BL21（DE3），以诱导物异丙基-β-d-硫代半乳 糖苷（Isopropyl-β-d-Thiogalactoside，IPTG）做诱导表达。以不同的诱导温度和诱导剂浓度 逐步优化原核表达条件，得到最佳诱导表达条件为：37℃摇床培养至OD600达到0.5-1.0，加 入IPTG至适宜浓度（0.1mM），继续培养3-4h，最终表达量均在20%以上，以包涵体的形 式存在。将包涵体经压力破碎、变性和复性浓缩后得到的包涵体蛋白EtpA融合蛋白，其序 列为SEQ ID NO.2所示，以Bradford法测定蛋白质浓度。

一种人源肠毒素大肠杆菌粘附素EtpA融合蛋白的复性方法，其步骤如下：

接种菌株至300mL培养基中，诱导表达，从培养液中收集菌体，再重悬于预冷的30ml 的BufferA中，压力破碎仪破碎3-5次，离心保留沉淀，30ml BufferA重悬沉淀，缓慢加入 10%SKL，不停搅拌至沉淀溶解，溶液澄清，4℃静置2h。继续加入终浓度0.2%的PEG4000、 600μL50m M氧化型谷胱甘肽与100mM还原型谷胱甘肽，4℃静置2h，10000rpm离心 15min弃去未溶解的菌体杂质，即得。

BufferA：Tris6.055g，EDTA0.186g，NaCl2.925g，甘油50mL，加入ddH₂O定容至1L， 使用前现加入DTT至终浓度0.5mmol/L。

一种利用EtpA融合蛋白制备的卵黄抗体，其制备步骤如下：

向复性、浓缩后的EtpA融合蛋白溶液中加入灭菌的tween-80至终浓度4%，再与等体 积白油佐剂在组织匀浆机中混合30min，充分乳化至蛋白浓度为0.5mg/mL。将蛋鸡随机分 2组，空白组50只（生理盐水）和免疫组100只。采用胸部肌肉注射（每侧500μL）。首免 2周后各组分别用相同油乳苗加强免疫一次，间隔2周再次免疫，二免后每周各组随机采集 5枚鸡蛋，提纯收集卵黄抗体，间接ELISA监测抗体效价变化，western-blot鉴定卵黄抗体 的特异性，待卵黄抗体效价达1:2⁹后收集鸡蛋。将收集的鸡蛋去壳，搅拌，喷雾干燥（进气 150℃，出气70℃），冷却后装入密封的样品袋内。

一种卵黄抗体在制备抗人源产肠毒素大肠杆菌免疫疫苗中的应用，其应用过程如下：

建立ETEC在小鼠肠道中的定植模型，以临床常见的ETEC菌株（H10407）攻毒小鼠， 同时将前期制备的卵黄抗体口服后，不同的抗体组对细菌产生了不同程度抑粘附效果。其中 标准菌株H10407的抗体组降低了感染小鼠的数量。通过细胞粘附试验，证实了卵黄抗体在 体外同样发挥了类似的抗粘附作用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本实验中表达的目的蛋白主要在包涵体中存在，为了使后期制备抗体效价更高，抗体效 果更好，我们通过采用SKL，氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽对表达的目的蛋白进行复 性。在后期免疫过程中获得了较高效价的卵黄抗体。

附图说明

图1为一种etpA基因的重组质粒构建路线示意图。

图中pMD18-T是克隆载体，pGEX-KG是表达载体。pGEX-etpA是插入了etpA基因的 重组质粒，BamHI、XhoI为质粒上的限制性内切酶位点。

图2为PCR扩增etpA产物的琼脂糖凝胶电泳示意图。

图中产物etpA分子量大小为1700bp；M为DNA分子量标准DL2000。

图3为重组表达质粒pGEX-etpA的双酶切鉴定电泳示意图。

图中M为DNA分子量标准DL2000；泳道EtpA：pGEX-etpA，插入片段2260bp。

图4为基因工程菌IPTG诱导蛋白表达前后的SDS-PAGE电泳检测示意图。

图中1、2分别代表重组蛋白EtpA诱导前后，所得蛋白分子量为84kDa。

图5为基因工程菌经诱导后重组蛋白的可溶性分析示意图。

图中1、2：pGEX-etpA BL21(DE3)诱导后的上清和沉淀；M为蛋白质分子量标准。

图6为不同温度条件对EtpA融合蛋白表达量的影响示意图。

1、2：37℃诱导后的上清和沉淀；3、4：25℃诱导后的上清和沉淀；5、6：17℃诱导后 的上清和沉淀；箭头：目的蛋白。

图7为诱导剂浓度对EtpA融合蛋白表达量的影响示意图。

1：诱导前；2、3、4、5、6：IPTG浓度分别为0.1、0.3、0.5、1.0、1.2mmol/L；箭头： 目的蛋白。

图8为浓缩复性后的蛋白质SDS-PAGE电泳分析示意图。

图9为Western-Blot检测重组蛋白EtpA的抗原性示意图。

图10为第二次免疫后卵黄抗体效价随时间的变化规律示意图。

图11为卵黄抗体对人源ETEC H10407小鼠肠道的抗粘附效果示意图。

水平线表示几何平均数，*表示差异显著，**表示差异极显著。

图12为卵黄抗体对人源ETEC H10407上皮细胞的抗粘附效果示意图。

水平线表示几何平均数，*表示差异显著，**表示差异极显著。

具体实施方式

下列具体实施例中未经特别说明的方法均参照美J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔（J.萨姆 布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译。分子克隆实验指南（第三版），北京：科学出版社， 2002年）。本发明所用试剂，细胞或菌株，若无特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：肠毒素大肠杆菌EtpA重组质粒的构建

1、本实施例使用的菌株和质粒载体见下表1。

表1菌株和质粒

2、主要试剂和试剂盒

PCR相关试剂：Taq DNA聚合酶、dNTP（2.5mM）、10×Taq buffer、DNA marker （2kb和10kb）：北京全式金生物技术有限公司；

限制性内切酶：大连宝生物工程有限公司；

琼脂糖：Biowest Agarose分装；

胰蛋白胨、酵母提取物：英国OXOID；

胰酶消化大豆肉汤：美国碧迪医疗器械有限公司；

DNA凝胶回收试剂盒：上海生工生物技术有限公司；

质粒提取试剂盒：上海生工生物技术有限公司。

3、溶液配制

3.1细菌DNA提取相关溶液

PBS（0.012M）：称取NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O3.58g，KH₂PO₄0.27g，加 ddH₂O定容至1L，分装121℃灭菌30min。

氯仿/异戊醇（24：1）：氯仿480ml，异戊醇20ml，混匀移入棕色玻璃瓶中4℃保存。

蛋白酶K（20mg/mL）：称取粉末20mg溶于ddH₂O1mL，混匀-20℃保存。

3.2培养基

1）LB培养基:胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl1g，琼脂粉1.5g（LB平板），加 ddH₂O溶解至100mL,搅拌均匀，锡箔纸密封高压蒸汽灭菌30min。

2）TSB：称取0.3g TSB，加ddH₂O溶解至100mL，同1）灭菌。

3）氨苄青霉素储液（100mg/mL）：在无菌操作台将1g粉末加入10mL ddH₂O溶解，无 菌滤器过滤，分装至1.5mL EP管，-20℃保存。

4）卡那霉素储液（50mg/mL）：在无菌操作台将1g粉末加入20mL ddH₂O溶解，其余 同（3）。

3.3DNA凝胶电泳相关溶液

1）50×TAE：Tris242g，EDTA37.2g，冰乙酸57.1mL，加ddH₂O溶解至900mL,调节 pH至8.0，定容至1L。使用时稀释到1×TAE即可。

2）6×DNA上样缓冲液：EDTA7.4g，蔗糖40g，二甲苯腈0.25g，溴酚蓝0.25g,加ddH₂O 溶解至100mL,搅拌均匀，四度保存。

3）EB染液（10mg/mL）：称取1g粉末，小心加入100mLddH₂O，搅拌至完全溶解，锡 纸包裹瓶身室温保存。使用时每200mL ddH₂O加入10μL EB。注意EB为强诱变剂，操作时 注意全身防护。

4、EtpA重组质粒的构建

构建重组质粒过程见图1。

4.1细菌DNA的提取

1）在无菌操作台中，从斜面培养基中挑取ETEC H10407菌液涂TSB平板，次日挑取 单菌落于5mL TSB培养基中，37℃过夜培养。

2）次日10000rpm离心收集菌体，PBS洗涤2次并重悬菌体至500μL。

3）加入100μL10%SDS，10μL20mg/mL蛋白酶K，50℃孵育3h或37℃过夜。

4）上清中加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀5min，10000rpm 离心5min，转移上清。重复一次。

5）加入等体积氯仿/异戊醇，颠倒混匀5min，10000rpm离心5min，转移上清。

6）加入0.6（V/V）异丙醇，颠倒混匀，静置5min，10000rpm离心5min，收集的沉淀 经预冷的75%酒精洗涤，晾干后溶于100μL ddH₂O中，-20℃保存。

4.2引物设计

在NCBI的GenBank中查找序列号为AY920525的基因座，其中EtpA位于编码区 2718-8021，全长5304bp，目的片段是5'端的1701bp。具体引物序列见下表2。

表2PCR扩增引物

注：下划线表示酶切位点。

4.3PCR扩增目的基因

加入ddH₂O先将引物稀释至10μM,基因组DNA稀释至0.05mg/mL。以25μL反应体系 为例（单位：μL）：

反应条件如下（循环数：35）：

程序 预变性 变性 退火 延伸 最后延伸 温度（℃） 95 94 见引物合成单 72 72 时间（min） 3 3 0.5 1kb/min 8

4.4PCR产物检测与回收

1）检测：根据片段大小制备琼脂糖凝胶，取5μL的PCR产物与上样液混匀点样，并在 一侧点入DNAmarker。电泳结束后，将凝胶放入EB染液中，10min后在凝胶成像系统拍照 保存。

2）回收：将检测时的梳子换成宽梳子，其他电泳步骤一致。凝胶中的条带在紫外灯下 用刀片迅速切除，其余步骤按照回收试剂盒说明操作。

4.5DNA片段的克隆

1）制备感受态DH5α：

A.自保存的甘油管中蘸取菌液划LB平板，挑取单菌落扩大培养16-18h。

B.次日以1%的接种量在三角瓶中扩大培养（37℃，3-4h），具体时间以菌液呈薄雾状 为止。

C.无菌操作台内转移菌液至预冷的离心管内，继续冰上放置30min。然后4℃离心收 集菌体（4000rpm，10min）。

D.弃尽上清，加入10mL预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬菌体，冰上放置25-30min。

E.以上两步重复2次。

F.2mL预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬菌体，加入灭菌甘油至终浓度15-20%，以100μL/ 管分装，-80℃保存备用。

2）连接：5μL连接体系如下，4℃过夜。

PCR产物 2 PMD18-T 0.5 Solution I 2.5

3）转化

A.取10μL连接产物加入刚刚解冻的DH5α感受态内，轻轻敲打混匀，冰上放置30min。 此时打开循环水浴锅预热至42℃。

B.42℃水浴热击90s，快速放置冰上1-2min。

C.加入LB培养基400μL，37℃震荡培养1h。

D.离心（8000rpm，2min）浓缩菌液至100μL，并将其涂布到Amp抗性的LB平板上， 恒温培养箱过夜培养。

E.次日挑取单菌落，菌液PCR检测有无阳性克隆子，并将获得的T克隆分别命名为 pMD-etpA。

4.6构建表达质粒

1）挑取阳性菌落进行扩大培养，按照质粒小量提取试剂盒的说明进行质粒提取，并按 以下20μL体系对含目的片段的T载体和空表达载体做双酶切和连接，其中连接体系中DNA 与载体的比例以摩尔数比在1:1-5:1之间：

2）将pMD-etpA、pGEX-KG经过BamHI和XhoI的双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收片 段etpA和载体pGEX-KG，连接、转化、检测得到pGEX-etpA，此时目的片段5’连接有GST 标签蛋白基因，测序结果显示序列与预期相同，pGEX-etpA构建成功。

3）菌落PCR挑选以上阳性克隆子，经测序正确的菌株扩大培养，小量提取重组质粒做 酶切鉴定，-20℃保存。为书写简便，将重组表达质粒简写为：pGEX-etpA。其含有的etpA 基因序列为SEQ ID NO.3所示，以BamHI和XhoI对重组质粒做双酶切，结果见图3。

本发明获得的pGEX-etpA经双酶切后经琼脂糖凝胶电泳后，在约1700bp观察到目的片 段，所得的阳性克隆子测序结果与NCBI公布的序列比对显示与预期的碱基序列和大小均一 致，重组质粒序列为SEQ ID NO.1所示。

实施例2：

重组蛋白的诱导表达和提取纯化

1、试剂

胰蛋白胨、酵母提取物：英国OXOID；

胰酶消化大豆肉汤：美国碧迪医疗器械有限公司；

Tris碱，甘氨酸，SDS：Amresco分装；

IPTG，Amp，Kan，氧化型谷胱甘肽，还原型谷胱甘肽，PEG4000：BIOSHARP分装；

2、溶液配制

LB培养基如实施例1中所示。

IPTG储液（1mol/L）：在无菌操作台将1g的粉末加入4.2mL灭菌ddH₂O，无菌滤器过 滤后分装至1.5mLEP管中。

SDS-PAGE电泳相关溶液：

1）2×蛋白上样液：Tris-HCl（1M,pH=6.8）10mL，SDS4g，溴酚蓝200mg，甘油20mL， 加ddH₂O定容至100mL，使用时加入2-3%β-巯基乙醇（现配现用）。

2）5×电泳缓冲液：Tris15.10g，Gly72.06g，SDS5g，加ddH₂O定容至1L。使用时稀 释5倍。

3）30%聚丙烯酰胺：依次称取N,N'-甲叉双丙烯酰胺1g，丙烯酰胺29g，加ddH₂O定 容至100mL，转入棕色瓶中四度保存。称量过程注意防护。

4）分离胶缓冲液：Tris18.17g，加ddH₂O90mL，浓HCl调节pH至8.8,定容至100mL， 四度保存。

5）浓缩胶缓冲液：Tris12.11g，加ddH₂O90mL，浓HCl调节pH至6.8,定容至100mL， 四度保存。

6）10%SDS：称取十二烷基硫酸钠10g，加ddH₂O定容至100mL，常温保存。

7）10%过硫酸铵：称取过硫酸铵0.1g至EP管中，加入1mLddH₂O，四度保存，两周 内使用。

8）1%TEMED：吸取N,N,N',N'-四甲基乙二胺1mL，加ddH₂O至100mL，转入棕色瓶 中四度保存。注意环境通风。

9）考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-2501.25g，甲醇450mL，冰乙酸50mL，加 ddH₂O450mL。

10）脱色液：甲醇50mL，冰乙酸75mL，加入ddH₂O875mL混匀。

包涵体纯化相关试剂：

1）BufferA：Tris6.055g，EDTA0.186g，NaCl2.925g，甘油50mL，加入ddH₂O定容至 1L。使用前现加入DTT至终浓度0.5mmol/L。

2）10%SKL：称取十二烷基肌酸钠1g，加入ddH₂O10mL，搅拌至溶解完全。

3）50mM氧化型谷胱甘肽：1g包装的粉末加入ddH₂O32.65mL，吹吸至溶解。

4）100mM还原型谷胱甘肽：1g包装的粉末加入ddH₂O32.54mL，同上。

5）20%PEG4000：称取聚乙二醇400020g，加入ddH₂O定容至100mL。

6）透析袋处理液A（2%碳酸氢钠，1mMEDTA，pH8.0）：称取碳酸氢钠20g，EDTA0.372g， 加ddH₂O至900mL，调节pH至8.0，定容至1L。

7）透析袋处理液B（1mM EDTA，pH8.0）：A液中去除碳酸氢钠即可。

3、重组蛋白的诱导表达和SDS-PAGE检测

将构建成功的表达质粒转化表达菌株BL21（DE3），挑取单菌落过夜培养。次日菌液 按1%接种量加入到5mL含抗性的新鲜培养基中，37℃摇床培养3-4h。当OD600达到0.5-1.0 时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养3-4h。取500μL菌液离心收集菌体，50μLPBS 重悬，等体积加入上样液，沸水浴5min，取10μL上清进行SDS-PAGE电泳检测。对照不 添加诱导剂培养相同时间。

4、重组蛋白的可溶性分析

如上将重组表达菌株接种至50mL的LB中扩大培养，收集诱导表达的菌体，5mLbufferA 充分重悬菌体，置于冰上。待压力破碎仪温度降至4℃，开始破碎菌体，重复3遍。离心分 离上清，5mL bufferA充分重悬沉淀，各取50μL以进行SDS-PAGE电泳分析。

5、重组蛋白的诱导条件优化

在蛋白表达过程中，诱导剂的浓度和诱导温度是影响表达量的重要因素。因此通过设计 不同温度（37、25、17℃）和IPTG浓度梯度（0.1、0.3、0.5、1.0、1.2mM），研究其对蛋 白表达的影响。如上接种培养5mL菌液，在不同条件下均在OD值达到0.5-1.0时加入诱导 剂，除25℃和17℃需继续过夜培养，其余均培养3-4h后收集菌体，如3进行SDS-PAGE 电泳检测。

6、重组蛋白的提取纯化

接种重组表达菌至300mL培养基中，以优化后的条件诱导表达。从培养液中收集菌体， 再重悬于预冷的1/10体积的BufferA中，压力破碎仪破碎3-5次，注意整个过程保持低温。 离心保留沉淀，以同等上述体积的BufferA充分重悬沉淀，缓慢加入10%SKL，不停搅拌至 沉淀溶解，溶液澄清，4℃静置2h。继续加入终浓度0.2%的PEG4000、600μL氧化型谷胱 甘肽与还原型谷胱甘肽，4℃静置2h，10000rpm离心15min弃去未溶解的菌体杂质。透析 袋处理方法：将透析袋按20-30cm的长度剪裁。在A液中沸水浴10min，蒸馏水清洗。在B 液中沸水浴10min，蒸馏水清洗，4℃保存。取用时注意带手套。复性的蛋白液装入处理好 的透析袋，共2天，期间换液数次，PEG包埋透析袋浓缩至所需浓度。SDS-PAGE电泳检 测蛋白纯度，Bradford法测定蛋白浓度。

7、试验结果

IPTG诱导重组大肠杆菌BL21(DE3)/pGEX-etpA表达，结果见图4。相应位置有预期大 小的蛋白出现，EtpA分子量分别约为89KD，表达量约20%。可溶性分析显示（见图5）蛋 白均大部分以包涵体的形式存在于沉淀中，上清中极少。图5显示确定重组蛋白诱导条件为 37℃摇床培养至OD600达到0.5-1.0，加入IPTG至适宜浓度0.1mM，继续培养3-4h，收集 菌体。纯化后，蛋白浓度是0.19g/L。

本发明构建的EtpA融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

实施例3：

以重组蛋白免疫蛋鸡制备卵黄抗体

1、试剂

白油，硬质酸铝，司本-80，吐温-80：武汉科前生物制品有限责任公司馈赠。

HRP兔抗鸡IgG：sigma

显色液Supersignal west pico试验试剂盒：Thermo

2、溶液配制

ELISA相关试剂：

PBS（0.012M）：称取NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O3.58g，KH₂PO₄0.27g，加 ddH₂O定容至1L，分装121℃灭菌30min。

包被液（0.05M碳酸盐缓冲液）：NaHCO₃2.93g，Na₂CO₃1.59g，加入ddH₂O900mL 溶解完全后调节pH至9.6，定容至1L，常温放置。

洗涤液：PBS中加入终浓度为0.05%的吐温-20。

封闭液：3%的牛血清白蛋白（BSA）溶于洗涤液中。

OPD显色液：邻苯二胺80mg，0.1mol/L柠檬酸4.86mL，0.2mol/L Na₂HPO₄5.14mL， ddH₂O10mL，最后加入30%H₂O₂30μL。现配现用。

终止液（2M H₂SO₄）：浓硫酸22.2mL，蒸馏水182mL，酸沿着杯壁慢慢加入水中，并 不停搅匀。

western-blot相关试剂：

膜转移缓冲液：Tris5.8g，甘氨酸2.9g，SDS0.37g，甲醇200mL，ddH₂O定容至1L。

TBS：Tris2.42g，NaCl8.78g，ddH₂O900mL，盐酸调节pH至8.0，定容1L。

TBST：TBS中加入终浓度为0.05%的吐温-20。

封闭液：含1%BSA的TBST。

显色液：将A液、B液以1:1的比例混合，现配现用。

3、重组蛋白油乳苗的制备

白油94mL，硬脂酸铝2g，搅拌均匀，加热至80度左右，并持续搅拌至溶液澄清。缓 慢加入6mL的司班-80，继续搅拌20min，冷却后即为白油佐剂，4℃保存。向复性、浓缩后 的蛋白溶液中加入灭菌的tween-80至终浓度4%，再与等体积白油佐剂在组织匀浆机中混合 30min，充分乳化至蛋白浓度为0.5mg/mL。

4、蛋鸡的免疫

选择20周龄笼养罗曼蛋鸡150只，将蛋鸡随机分2组，空白组50只（生理盐水）和免 疫组100只。采用胸部肌肉注射（每侧500μL）。首免2周后各组分别用相同油乳苗加强免 疫一次，间隔2周再次免疫，二免后每周各组随机采集鸡蛋ELISA监测看抗体效价变化， 待卵黄抗体效价达1:2⁹后收集鸡蛋，低温保存。

5、喷雾干燥全蛋粉

将收集的鸡蛋去壳，搅拌，喷雾干燥（进气150℃，出气70℃），冷却后装入密封的样 品袋内。采集喷雾干燥中不同时间段的全蛋粉，抗体提纯方法同新鲜鸡蛋，间接ELISA检 测抗体效价。

6、卵黄抗体的纯化

水稀释法，具体步骤如下：

分离蛋黄，即在蛋壳一端打破一个小孔，将蛋清流尽，扩大破壳范围，蛋黄放置于滤纸 上来回滚动，直至蛋清吸干。扎破蛋黄膜，收集蛋黄液于离心管中。蛋黄液用8倍体积的蒸 馏水稀释，搅拌均匀，盐酸调节pH至5.0-5.2，4℃放置6h或过夜。10000rpm离心20min， 收集上清得到水溶性组分WSF（water-solve fract）。上清加入硫酸铵至50%饱和度，搅拌 均匀，4℃放置2h或过夜，充分沉淀，10000rpm离心10min，弃上清，沉淀溶于PBS至原 蛋黄液体积。加入硫酸铵至33%饱和度，重复以上步骤。4℃透析24h，-20℃保存备用。

7、间接ELISA测定卵黄抗体效价

二免后一周开始采集鸡蛋，每周随机从100只蛋鸡中收集5枚鸡蛋，提取抗体后，以重 组蛋白包被抗原，间接ELISA测定二免后1-7周的抗体效价。喷雾干燥过程前、中、后段 样品，提取抗体后以同样方法检测效价。

方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度。将抗原分别用包被液做倍比稀释（1:400，1:800， 1:1600，1:3200，1:6400），每孔100μL包被聚苯乙烯反应板，每个稀释度两个平行孔，4℃ 过夜。测定样品时将样品按需要倍比稀释，酶标兔抗鸡IgG用PBST作1：10000稀释，进 行ELISA检测，具体样品测定步骤如下：

1）将抗原按每孔100μL包被聚苯乙烯反应板，4℃过夜；

2）弃去液体，PBST洗涤3次拍干，加封闭液每孔100μL，37℃孵育2小时；

3）如上洗涤，加入待测抗体每孔100μL（用PBST稀释），37℃孵育1小时；

4）如上洗涤，加入酶标二抗（PBST稀释）每孔100μL，37℃孵育1小时；

5）如上洗涤，加入现配的OPD显色液100μL，37℃避光孵育15min；

6）每孔加终止液50μL，在450nm波长下测量各孔的OD值，以空白孔调零。待测抗 体OD值与阴性对照的比值大于2.1时判为阳性，抗体效价即为出现阳性反应时的最高稀释 度。

8、western-blot检测重组蛋白免疫原性

1）SDS-PAGE电泳：将蛋白样品按实例2方法电泳。

2）转膜：采用湿法转移，电转液冰上预冷

3）拆去玻璃板，取出凝胶，根据marker和分子量大小将目的条带附近1cm宽度的胶 切下来浸泡在电转液中。

4）根据胶的尺寸裁剪出相同大小的滤纸和PVDF膜。滤纸浸泡在电转液中，膜先在甲 醇中浸润约30s，转移至ddH2O漂洗1-2min，之后浸泡在电转液中。

5）依次将塑料板黑面、海绵、2层滤纸、凝胶、PVDF膜、2层滤纸、海绵对齐放好， 注意赶走膜与胶之间的气泡，塑料板白面与黑面夹紧，放入电转槽中。

6）开启电源，100V恒压电泳1-1.5h（根据蛋白分子量）。

7）封闭：取出PVDF膜用TBST稍加漂洗，浸没在含封闭液的平皿中缓慢摇荡2h。

8）一抗孵育：将一抗用封闭液以1:1000稀释，PVDF膜浸没其中，4℃过夜。

9）二抗孵育：TBST漂洗膜三次，每次5-10min。二抗用封闭液以1:10000稀释，PVDF 膜室温摇床孵育1h。

10）ECL显色：TBST漂洗膜3次，TBS漂洗膜2次，每次5-10min。打开成像系统， 预冷30min。将混合好的显色液均匀覆盖到PVDF膜上，及时拍照保存图片。

9、试验结果

表3最佳抗原包被浓度

蛋鸡免疫后，通过抗体效价的检测证明重组蛋白具有良好的免疫原性，能够引起蛋鸡的 免疫应答反应，并可产生相应的特异性抗体。抗原的最佳包被浓度为1:3200，即0.15微克/ 孔。在二免后一周EtpA的抗体效价达到了12800，二免后第二周出现效价升高，至第七周 抗体效价维持在64000，未出现效价下降的趋势。

SDS-PAGE电泳显示提纯的卵黄抗体分子量在180左右，纯度达70-80%。western-blot 检测结果显示了重组蛋白良好的免疫原性，再次佐证了蛋鸡免疫取得成功。

实施例4：

卵黄抗体在制备抗人源肠毒素大肠杆菌免疫疫苗中的应用，其应用过程如下：

1、试验对象

6-8周龄昆明种SPF雌性小鼠；

2、试验材料

表4菌株

注：CFA，colonization factor antigen;CS，coli surface antigen

卵黄抗体为实施例3制备得到，EtpA组的卵黄抗体由EtpA蛋白免疫蛋鸡所得（浓度为 10mg/mL，效价为64000）。

3、小鼠攻毒试验

1）小鼠到达后适应期2-3天，随机分组，每组8只，自由饮水采食。

2）攻毒前24-48h小鼠饮水更改为含链霉素（5g/L）的无菌水，以消除肠道正常菌群。

3）准备细菌：挑取ETEC单菌落于新鲜TBS培养基中，37℃摇床培养过夜。次日攻毒 当天再以1/100量接种新鲜培养基，待OD600达到1.0（约5×108CFU/mL），菌液离心得 到菌体沉淀，重悬于1/10菌液体积的无菌PBS中，待用。

4）攻毒前12h禁食，饮水更改为蒸馏水。

5）攻毒前1-3h腹腔注射西咪替丁（50mg/kg体重），降低胃酸对菌体的影响。

6）每只小鼠经灌胃针灌喂200μL新鲜菌液，隔1h后各处理组相应灌胃50μL卵黄抗体 溶液，之后正常给食和饮水。

7）麻醉前12h禁食，正常饮水。

8）攻毒后48-72h后麻醉处死并解剖小鼠，截取3cm回肠（回盲结合处向上6cm），纵 向剖开肠道，2mL PBS稀释内容物，涡旋5秒后室温孵育10min，再次涡旋5秒。所得上清 以10-1与10-2稀释后取100μL涂布麦康凯琼脂平板计数(Allen et al2006)。

9）每个平板挑取20个菌落，设计ETEC特有的耐热肠毒素LT的引物（正向:5'- CTAGTTTTCCATACTGAT-3'和反向:5'-CCCCAGTCTATTACAGAA-3'）进行PCR检测， 以鉴定菌落是否为ETEC，计算阳性菌落比例。

4、细胞粘附试验

方法：在10mL新鲜LB培养基中，按1/100接种细菌，于37℃225r/min振荡培养至细 菌达到生长对数期。分别加600μL菌液于1.5mL的离心管中，在5000r/min离心5min，去 上清，加入600μL的细胞培养基重悬菌体，对于处理组添加100μL的卵黄抗体。以100:1 的感染复数（MOI）加入到细胞培养板中，将对照组（普通卵黄抗体）和处理组均置于37℃ 孵育1h。温育1h后，用无菌的PBS洗脱3次，除去未粘附的细菌，与细胞粘附的细菌经 200μL0.1%Triton-X-100磷酸盐孵育5-10min，将100μL悬液稀释1000倍后均匀涂布LB平 板，次日生长的菌落数（CFU）即粘附的细菌数。粘附率=1000*菌落数/总细菌数（每个处 理重复三次）。

本试验各组数据采用GraphPad Prism5.0进行统计，小鼠粘附试验的每组菌落数以几何 平均值表示，细胞粘附试验则以平均值±标准差表示，两两比较经非参数Mann-Whitney单 尾检验。P<0.05判定差异显著。

5、试验结果与分析

以ETEC H10407攻毒小鼠，再灌胃不同蛋白制备的卵黄抗体，肠道粘附的细菌在麦康 凯琼脂培养基中复苏，并挑取20个菌落做PCR检测。粘附的菌落数=平板计数平均值*稀释 度*阳性菌落数/20。

分为2组，未添加卵黄抗体组和添加卵黄抗体组，每个处理组8只小鼠，粘附情况采用 稀释平板计数统计并取平均值。在小鼠攻毒试验中，未添加卵黄抗体时，H10407的粘附数 为8.2×10⁴；添加卵黄抗体时H10407的粘附数为1.2×10⁴。在细胞试验中，未添加卵黄抗体 时，H10407的粘附率为0.0022%；添加卵黄抗体时H10407的粘附率为0.0014%。

各组小鼠肠道细菌粘附结果见图11，其中在H10407攻毒后，蛋白EtpA组与对照达到 显著水平差异，表明了蛋白抗体的抑粘附作用。

如图12所示，以ETEC H10407进行细胞粘附，与对照组相比，菌株H10407在添加特异性 卵黄抗体后的细菌粘附数极显著降低。故在细胞水平上也类似验证了卵黄抗体的抗粘附效果。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  华中农业大学

<120>  一种人源产肠毒素大肠杆菌粘附素EtpA融合蛋白及其应用

<130>  一种人源产肠毒素大肠杆菌粘附素EtpA融合蛋白及其应用

<160>  3    

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  6659

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

acgttatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc ggaagctgtg     60

gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt    120

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gatgccattg ctgtggaagc tgcctgcact aatgttccgg cgttatttct tgatgtctct   5460

gaccagacac ccatcaacag tattattttc tcccatgaag acggtacgcg actgggcgtg   5520

gagcatctgg tcgcattggg tcaccagcaa atcgcgctgt tagcgggccc attaagttct   5580

gtctcggcgc gtctgcgtct ggctggctgg cataaatatc tcactcgcaa tcaaattcag   5640

ccgatagcgg aacgggaagg cgactggagt gccatgtccg gttttcaaca aaccatgcaa   5700

atgctgaatg agggcatcgt tcccactgcg atgctggttg ccaacgatca gatggcgctg   5760

ggcgcaatgc gcgccattac cgagtccggg ctgcgcgttg gtgcggatat ctcggtagtg   5820

ggatacgacg ataccgaaga cagctcatgt tatatcccgc cgttaaccac catcaaacag   5880

gattttcgcc tgctggggca aaccagcgtg gaccgcttgc tgcaactctc tcagggccag   5940

gcggtgaagg gcaatcagct gttgcccgtc tcactggtga aaagaaaaac caccctggcg   6000

cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga   6060

caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac   6120

tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt   6180

gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacggat tcactggccg   6240

tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag   6300

cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc   6360

aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gctttgcctg gtttccggca ccagaagcgg   6420

tgccggaaag ctggctggag tgcgatcttc ctgaggccga tactgtcgtc gtcccctcaa   6480

actggcagat gcacggttac gatgcgccca tctacaccaa cgtaacctat cccattacgg   6540

tcaatccgcc gtttgttccc acggagaatc cgacgggttg ttactcgctc acatttaatg   6600

ttgatgaaag ctggctacag gaaggccaga cgcgaattat ttttgatggc gttggaatt    6659

<210>  2

<211>  567

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  2

Met Asn Arg Ile Tyr Lys Leu Lys Phe Asp Lys Arg Arg Asn Glu Leu

1               5                   10                  15     

Val Val Val Ser Glu Ile Thr Thr Gly Val Gly Asn Ala Lys Ala Thr

            20                  25                  30         

Gly Ser Val Glu Gly Glu Lys Ser Pro Arg Arg Gly Val Arg Ala Met

        35                  40                  45              

Ala Leu Ser Leu Leu Ser Gly Met Met Ile Met Ala His Pro Ala Met

    50                  55                  60                 

Ser Ala Asn Leu Pro Thr Gly Gly Gln Ile Val Ala Gly Ser Gly Ser

65                  70                  75                  80 

Ile Gln Thr Pro Ser Gly Asn Gln Met Asn Ile His Gln Asn Ser Gln

                85                  90                  95     

Asn Met Val Ala Asn Trp Asn Ser Phe Asp Ile Gly Lys Gly Asn Thr

            100                 105                 110        

Val Gln Phe Asp Gln Pro Ser Ser Ser Ala Val Ala Leu Asn Arg Val

        115                 120                 125            

Val Gly Gly Gly Glu Ser Gln Ile Met Gly Asn Leu Lys Ala Asn Gly

    130                 135                 140                 

Gln Val Phe Leu Val Asn Pro Asn Gly Val Leu Phe Gly Glu Gly Ala

145                 150                 155                 160

Ser Val Ser Thr Ser Gly Phe Val Ala Ser Thr Arg Asp Ile Lys Asn

                165                 170                 175    

Asp Asp Phe Met Asn Arg Arg Tyr Thr Phe Ser Gly Gly Gln Lys Ala

            180                 185                 190        

Gly Ala Ala Ile Val Asn Gln Gly Glu Leu Thr Thr Asn Ala Gly Gly

        195                 200                 205            

Tyr Ile Val Leu Ala Ala Asp Arg Val Ser Asn Ser Gly Thr Ile Arg

    210                 215                 220                

Thr Pro Gly Gly Lys Thr Val Leu Ala Ala Ser Glu Arg Ile Thr Leu

225                 230                 235                 240

Gln Leu Asp Asn Gly Gly Leu Met Ser Val Gln Val Thr Gly Asp Val

                245                 250                 255    

Val Asn Ala Leu Val Glu Asn Arg Gly Leu Val Ser Ala Arg Asp Gly

            260                 265                 270        

Gln Val Tyr Leu Thr Ala Leu Gly Arg Gly Met Leu Met Asn Thr Val

        275                 280                 285            

Leu Asn Val Ser Gly Val Val Glu Ala Ser Gly Met His Arg Gln Asp

    290                 295                 300                

Gly Asn Ile Val Leu Asp Gly Gly Asp Ser Gly Val Val His Leu Ser

305                 310                 315                 320

Gly Thr Leu Gln Ala Asp Asn Ala Ser Gly Gln Gly Gly Lys Val Val

                325                 330                 335    

Val Gln Gly Lys Asn Ile Leu Leu Asp Lys Gly Ser Asn Ile Thr Ala

            340                 345                 350        

Thr Gly Gly Gln Gly Gly Gly Glu Val Tyr Val Gly Gly Gly Trp Gln

        355                 360                 365            

Gly Lys Asp Ser Asn Ile Arg Asn Ala Asp Lys Val Val Met Gln Gly

    370                 375                 380                

Gly Ala Arg Ile Asp Val Ser Ala Thr Gln Gln Gly Asn Gly Gly Thr

385                 390                 395                 400

Ala Val Leu Trp Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Phe His Gly Gln Ile Ser

                405                 410                 415    

Ala Lys Gly Gly Glu Thr Gly Gly Asn Gly Gly Arg Val Glu Thr Ser

            420                 425                 430        

Ser His Gly Asn Leu Gln Ala Phe Gly Thr Val Ser Ala Ser Ala Lys

        435                 440                 445             

Lys Gly Lys Ala Gly Asn Trp Leu Leu Asp Ser Ala Asp Ile Thr Ile

    450                 455                 460                

Val Asn Gly Ser Asn Val Ser Lys Thr Glu Thr Thr Gln Ser Pro Pro

465                 470                 475                 480

His Thr Gln Phe Ala Pro Thr Ala Ala Gly Ser Ala Val Ser Asn Thr

                485                 490                 495    

Ser Ile Asn Asn Arg Leu Asn Asn Gly Thr Ser Val Thr Ile Leu Thr

            500                 505                 510        

His Arg Thr Arg Thr Gly Thr Ala Gln Gly Gly Asn Ile Thr Val Asn

        515                 520                 525            

Ala Ala Ile Asn Lys Ser Asn Gly Ser Asp Val Asn Leu Thr Leu Gln

    530                 535                 540                 

Ala Gly Gly Asn Ile Thr Val Asn Asn Ser Ile Thr Ser Thr Glu Gly

545                 550                 555                 560

Lys Leu Asn Val Asn Leu Ser

                565       

<210>  3

<211>  1701

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

atgaaccgta tatataaact gaagtttgac aaacgccgca acgaactggt ggtggtgagt     60

gaaatcacca ccggcgtggg taatgcaaaa gccacgggca gcgtggaggg cgaaaagtcc    120

ccccgtcgtg gcgtgcgcgc catggcgctg agcctgctgt cgggtatgat gataatggcc    180

catccggcga tgtcagcaaa cctgccgacc ggtggccaga ttgtggcagg ttcaggcagt    240

atccagacgc cttccggcaa ccagatgaat attcatcaga acagccagaa catggtggcc    300

aactggaaca gctttgacat tggtaaagga aatacggtgc agtttgacca gcccagcagc    360

agtgcggtgg cgctgaaccg tgttgtgggt ggcggtgaat cgcagattat gggtaacctg    420

aaggcgaatg gtcaggtgtt cctggttaac ccgaacggcg tgctgtttgg tgagggggcc    480

agtgtcagca cgtcaggttt tgtggcatcg acccgcgaca ttaaaaacga cgacttcatg    540

aaccgtcgtt acaccttcag cggcggacag aaagccgggg cagcgattgt gaaccagggg    600

gaactgacca caaatgccgg tggctatatt gtgctggcag cagacagggt cagcaacagt    660

ggcaccatcc gtacgccggg cggcaagacc gtcctggcgg ccagcgagcg catcacgctg    720

cagctggata atggtggcct gatgtccgtg caggtgacag gagatgtggt taatgccctg    780

gtggaaaacc gcggtctggt cagtgcccgg gatggtcagg tgtacctgac cgcacttggc    840

cggggtatgc tgatgaacac ggtactgaac gtgagcgggg tggtggaagc cagcggtatg    900

caccgtcagg acggtaacat tgtactggac ggtggcgaca gtggtgtggt gcacctgagt    960

ggtaccctgc aggcggacaa tgcgtccggt cagggtggta aggttgtcgt gcagggtaag   1020

aatattctgc tggacaaggg cagcaacatc acagcaaccg gtggtcaggg cggcggtgaa   1080

gtgtatgtcg gtggcggctg gcagggtaag gacagcaaca tccgtaatgc ggacaaggtg   1140

gtgatgcagg gcggcgcccg cattgacgtt tctgcaacgc agcagggtaa cggcggtacg   1200

gctgtgctgt ggtcagacag ctacaccaac ttccatggtc agattagcgc gaagggcggt   1260

gagaccggcg gtaacggtgg tcgggtggag acctcttcgc acggtaacct gcaggcattt   1320

ggtacggtca gtgcatccgc gaagaaaggc aaggcgggta actggctgct ggactcggcg   1380

gatatcacca ttgtgaatgg tagcaatgtt agcaaaactg agacgactca atcgccgccg   1440

cacacgcaat ttgcacccac cgctgcgggc tctgcggtca gcaataccag tatcaacaac   1500

aggctgaaca acgggaccag tgtcactatt ctgacccatc gcacaagaac aggcacagct   1560

cagggcggga atattaccgt taatgcggca attaacaaaa gcaacggaag tgatgtcaac   1620

ctgacgctgc aggctggcgg caacatcacg gtaaacaaca gcatcacgtc caccgagggt   1680

aagctgaatg ttaatctgtc g                                             1701