一种基于单克隆抗体的检测食品中沙门氏菌属的特异性双抗体夹心法

摘要

一种基于单克隆抗体的检测食品中沙门氏菌属的特异性双抗体夹心法，属于免疫分析领域。本发明用高碘酸钠法将光滑型鼠伤寒沙门氏菌LPS偶联牛血清白蛋白免疫7周龄的BALB/c小鼠，经免疫、融合、筛选得12株特异性识别沙门氏菌属的LPS单克隆抗体。12株抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP并以甲型副伤寒沙门氏菌菌体进行两两配对。以8G3作为包被抗体，8G3-HRP作为检测抗体，建立检测沙门氏菌属特异性双抗体夹心法，检测甲型副伤寒沙门氏菌LOD为10^6CFU/mL。本方法与沙门氏菌属内的菌均有交叉反应，而与E.coli、E.coli O157:H7、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌无交叉反应，为食品中沙门氏菌属的检测提供了全面、可靠、快速高效的分析手段。

说明书

技术领域

本发明涉及了一种定量检测食品中沙门氏菌属的双抗体夹心法，属于免疫分析领域。

背景技术

沙门氏菌（Salmonella）是一种全球性的食源性致病菌。生物学上沙门氏菌是一类两端钝圆的革兰氏阴性菌，无芽孢，一般无荚膜，主要抗原有O抗原、H抗原、Vi抗原。动物性食品如禽肉、蛋类、乳品容易污染沙门氏菌。人体摄入含菌食物后会引起急性肠胃炎，伤寒，免疫力低下的儿童等人群中甚至出现败血症等症状。

沙门氏菌有2000多种血清型，临床中常见的血清型主要是肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌等。良好规范的生产操作过程和危害分析与关键点控制（HACCP）等管理体系的应用可以很大程度上减少食源性致病菌的发生。然而对原料和生产过程、产品的质量监测也是保障食品生物安全的重要手段。

目前检测沙门氏菌的方法主要有生化培养法、免疫学检测方法、分子检测方法。传统的生化培养法是检测沙门氏菌的国标方法，尽管权威可靠，但一般需要5-10天得到结果，且操作过程繁琐，不能适应快速检测的要求；分子检测方法是基于沙门氏菌脱氧核糖核酸（DNA）聚合酶链式反应（PCR）建立起来的。目前发展为传统PCR、实时荧光定量PCR（RT-PCR）、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)。与传统PCR相比，RT-PCR具有实现定量检测目标DNA、特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。LAMP方法具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方面不亚于常规PCR技术，不依赖专门的仪器设备，可以现场高通量快速检测，而且检测成本远低于实时荧光定量PCR。然而，有文献报道LAMP方法在检测牛乳中的沙门氏菌时，会出现假阴性的问题。这可能是与引物受到样品基质影响所引起的。同样常规PCR和实时荧光PCR也面临着检测成本高、对操作人员技术要求较高的问题。

ELISA凭借其灵敏、快速、特异性好、易于推广的特点成为食源性致病菌的常规检测方法。目前ELISA方法检测沙门氏菌面临的困难就是难以制备在菌属水平上识别沙门氏菌的单克隆抗体，因此建立的方法特异性很强，不能检测沙门氏菌属内的其它沙门氏菌。之前我们实验室的专利申请，申请号201310506513.5、发明名称“一种基于单克隆抗体的检测食品中鼠伤寒沙门氏菌的双抗体夹心法”，用LPS和鼠伤寒沙门氏菌菌体混合作为免疫原，制备了鼠伤寒沙门氏菌特异性的单克隆抗体并建立了检测鼠伤寒沙门氏菌的夹心法ELISA方法，LOD为500cfu/mL。然而，LPS和沙门氏菌菌体混合免疫起免疫作用的主要是菌体LPS的O特异性侧链（LPS是非胸腺依赖抗原，单独一般只引起体液免疫），沙门氏菌的核心多糖由于空间位阻难以引起有效的免疫应答，因此筛选到的单抗和建立的夹心ELISA特异性较强，只特异性针对检测鼠伤寒沙门氏菌，不能满足实际样品需要检测沙门氏菌属特异性的需求。

面对这一难点，我们通过高碘酸钠法（NaIO₄）将弱免疫原性的LPS与载体蛋白偶联制备了LPS完全抗原。该完全抗原为胸腺依赖抗原相比LPS免疫原性增强并且可以诱导小鼠产生IgG类抗体，更重要的是制备的血清对沙门氏菌属内的沙门氏菌均有交叉反应。比较光滑型LPS与RaLPS人工抗原免疫的小鼠血清的交叉反应后我们发现普通光滑型LPS制备的人工抗原即可产生与RaLPS人工抗原同样的效果，这可能是因为光滑型LPS与RaLPS均含有沙门氏菌核心多糖（LPS core structure）的原因。光滑型LPS在制备免疫原方面具有成本更低的优势，因此，本发明中采用LPS合成了人工抗原作为免疫原免疫小鼠并进行融合筛选，成功制备了特异性识别沙门氏菌属的单克隆抗体并建立了菌属水平上检测沙门氏菌的双抗体夹心法检测，为快速检测食品中沙门氏菌提供了可靠的手段。

发明内容

（一）要解决的技术问题

本发明的目的在于建立一种在菌属水平上检测沙门氏菌属的酶联免疫吸附检测方法，用于食品中沙门氏菌属的批量、快速检测。

（二）技术方案

为实现上述目的，本发明建立了一种基于单克隆抗体的检测食品中沙门氏菌属的特异性双抗体夹心法，该方法包括对检测方法的优化。

其中，单克隆抗体是采用LPS-BSA人工抗原作为免疫原免疫7周龄的BALB/c小鼠并经杂交瘤技术融合、筛选得到的。

其中，用于配对的抗体是通过优化参数下夹心法配对，并通过多次试验筛选确定的，具有稳定性好、灵敏度高的特点。

其中，建立的夹心法优化了包被抗体的浓度，包被液，封闭液，标准品稀释液，检测抗体稀释液，检测抗体稀释浓度。

本发明方法的检测分析原理是：

酶标板上包被了包被抗体8G3，该抗体可特异性捕获沙门氏菌属内的沙门氏菌；洗板3次，洗去未结合的抗体，加入封闭液220μL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品和对照，37℃孵育1h；洗板3次，加入检测抗体8G3-HRP，37℃孵育1h；洗板4次，加入显色液显色10min。如果样品有足够的沙门氏菌，那么沙门氏菌被包被抗体捕获并与检测抗体8G3-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值（P/N≥2.1），并被判定为阳性；如果样品沙门氏菌浓度太低（P/N＜2.1）那么样品不被捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性。

抗体8G3，即细胞株O，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.9804。

步骤为：

（1）沙门氏菌属交叉型LPS单克隆抗体细胞株的制备

用合成的沙门氏菌LPS-BSA人工抗原为免疫原，免疫8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、融合，筛选采用不同血清群的沙门氏菌和Ra LPS测试细胞株的交叉反应并挑选具有较强交叉反应的细胞进行亚克隆，最终得到了12株交叉型的沙门氏菌属特异性单克隆抗体；

（2）单克隆抗体的配对筛选

12株沙门氏菌属特异性单克隆抗体纯化后分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，配对参数如下：包被抗体8G3 4μg/mL；包被液为pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液；标品浓度5×10^7CFU/mL；标品稀释液pH7.2、0.01M的PBS；检测抗体8G3-HRP稀释1000倍使用，在此条件下，实验成功得到了10对P/N >5的配对；

（3）沙门氏菌属特异性ELISA方法的建立

选择检测限稳定、灵敏的配对，用包被抗体8G3和检测抗体8G3-HRP建立了沙门氏菌属特异性的夹心ELISA分析方法；具体参数如下：

包被抗体8G3包被浓度：4μg/mL，

包被液：pH9.6、0.01M碳酸盐缓冲液，

标品稀释液：含3.3mM EDTA 的pH7.2、0.01M的Tris-HCl溶液，

检测抗体浓度：2μg/mL，

反应时间：包被、封闭：37℃，2h；标准品：37℃，1h；检测抗体37℃，1h；显色10min；

该ELISA对沙门氏菌属内的甲型副伤寒沙门氏菌（A群）、鼠伤寒沙门氏菌（B群）、阿贡那沙门氏菌（B群）、乙型副伤寒沙门氏菌（B群）、汤普逊沙门氏菌（C1群）、布洛克利沙门氏菌（C2群）、肯塔基沙门氏菌（C3群）、肠炎沙门氏菌（D群）、都柏林沙门氏菌（D群）、伤寒沙门氏菌（D群）、鸭沙门氏菌（E群）、亚利桑那沙门氏菌（Arizona亚属）均有交叉反应，对应的检测限（P/N≥2.1）分别为：1.5×10^6CFU/mL、1.5×10^6CFU/mL、6.3×10^6CFU/mL、1.3×10^7CFU/mL、3.1×10^6CFU/mL、3.1×10^6CFU/mL、6.3×10^6CFU/mL、6.3×10^6CFU/mL、2.5×10^7CFU/mL、2.5×10^7CFU/mL、6.3×10^6CFU/mL、2.5×10^7CFU/mL；与E.coli、E.coli O157:H7、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌无交叉反应。

（三）有益效果

本发明提供的沙门氏菌双抗体夹心检测方法基于沙门氏菌属特异性的LPS单克隆抗体，建立的夹心法可以在菌属水平上检测沙门氏菌。同时稳定性好、成本低，能同时检测大量样品，适合食品行业大规模、高通量、快速、灵敏的检测要求，具有推广和应用价值。

生物材料样品保藏：单克隆细胞株O，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，筒称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.9804，保藏日期2014年10月15日。

附图说明

图1  沙门氏菌属特异性单克隆抗体8G3的交叉反应。

图2  沙门氏菌属特异性双抗体夹心法的标准曲线。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明。

一、仪器：

TGL－40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂

KFLOW纯水机，凯佛隆公司                                                    

ZD–9556水平摇床，太仓科教器材厂                                         

96孔8×12可拆酶标板，厦门怡佳美实验器材有限公司

MuLtiska Mks酶标仪，Thermo Labsystems公司

可调试移液器，Thermo Labsystems公司

涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂

二、试剂：

四甲基联苯胺(TMB)，上海晶纯实业有限公司

其他试剂均为分析纯试剂

三、步骤

1、单克隆抗体的制备

1)实验动物：选5只7周龄的BALB/c小鼠进行免疫；

2)抗原配置：用高碘酸钠法（NaIO₄）将光滑型的鼠伤寒沙门氏菌LPS（购于Sigma公司）与牛血清白蛋白（BSA）进行偶联，获得LPS- BSA人工抗原；具体操作方法如下：取光滑型鼠伤寒沙门氏菌脂多糖LPS 10mg用超纯水溶解，按照反应摩尔比NaIO₄: LPS=9:1滴加不同体积的200mM/L NaIO₄溶液到光滑型鼠伤寒沙门氏菌脂多糖LPS溶液中，25℃反应2h；然后取10μL 1M/L的乙二醇溶液到反应液中，25℃反应2h。按照反应摩尔比LPS︰BSA=5︰1的比例将活化后的光滑型鼠伤寒沙门氏菌脂多糖LPS反应液滴加到BSA溶液中，用0.01M、pH9.6的碳酸盐缓冲液（CB）调节反应液pH至偏碱性。室温反应过夜，即得沙门氏菌交叉型抗体的免疫原；

将LPS-BSA人工抗原作为免疫原用生理盐水稀释，配成2mg/mL的溶液；

3) 乳化：将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法进行乳化，乳化完全后皮下多点注射小鼠；

4) 免疫：按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用间接竞争法测定效价，效价达到要求后，进行冲刺免疫；冲免3天后眼眶采血后进行融合；

5) 采血：第三次免疫后1周进行断尾采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价；

6) 融合、筛选：采用杂交瘤技术进行融合，采用间接Elisa筛选阳性细胞孔，采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆；

7) 抗体的纯化和保存：采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水，透析后得到单克隆抗体，采用微量紫外方法测定其浓度后分装后放入-20℃保存。

2、ELISA反应过程：

抗体效价测定步骤：

1) 将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100 μL/孔，于37℃温育箱内温育2 h。取出酶标板后将板甩干，每孔注入200 μL PBST溶液，摇床上振荡3 min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同；

2) 充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200 μL/孔，于37℃温育箱内温育2 h后取出烘干待用；

3) 将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h后洗涤、拍干；

4) 每孔加入100 μL，1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h后洗涤、拍干；

5) 每孔加入100 μL显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37℃反应15 min，取出后每孔加入100 μL终止液(2 mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A₄₅₀；

沙门氏菌属特异性双抗体夹心法测定步骤：

a、 包被：用4μg/mL的8G3包被酶标板，100μL /孔，37℃温育箱内温育2 h；

b、 洗涤：用PBST洗涤反应板三次，每次3min，200μL/孔，然后甩干反应板；

c、封闭：含0.2%明胶的CBS，200μL /孔， 37℃封闭2h；

d、洗涤：同b；

e、样品：用PBST将沙门氏菌稀释成1*10^8、5*10^7、2.5*10^7、1.25 *10^7、6.25*10^6、3.13 *10^6、1.6 *10^6 CFU/mL系列浓度，另设一个PBST空白对照。每孔加入100μL样品，于37℃温育lh；

f、洗涤：同b；

g、加检测抗体(8G3-HRP，2μg/mL)，100μL /孔，37℃反应1h；

h、洗涤：同b；

i、显色：加底物TMB 100μL /孔，显色10min；

j、终止：加终止液50μL /孔；

k、测定：用酶标仪检测OD₄₅₀nm。

交叉率的测定

将甲型副伤寒沙门氏菌（A群）、鼠伤寒沙门氏菌（B群）、阿贡那沙门氏菌（B群）、乙型副伤寒沙门氏菌（B群）、汤普逊沙门氏菌（C1群）、布洛克利沙门氏菌（C2群）、肯塔基沙门氏菌（C3群）、肠炎沙门氏菌（D群）、都柏林沙门氏菌（D群）、伤寒沙门氏菌（D群）、鸭沙门氏菌（E群）、亚利桑那沙门氏菌（Arizona亚属）稀释成1*10^8、5*10^7、2.5*10^7、1.25 *10^7、6.25*10^6、3.13 *10^6、1.6 *10^6 CFU/mL系列浓度并检测。将E.coli、E.coli O157:H7、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌稀释到10^8 CFU/mL在建立的沙门氏菌双抗体夹心法体系中检测吸光值，并设空白孔，每个浓度做6次测定平均值，做3次重复实验。

试验结果如下：

1、标准曲线：本发明所获得的抗原检测的检测范围是为10^6～10^8 CFU/mL，R²=0.98，具体请见说明书附图。

2、LOD：LOD是空白的平均吸收值加3倍的空白吸收值的标准偏差对应的抗原浓度，沙门氏菌双抗体夹心法对甲型副伤寒沙门氏菌的LOD为10^6  CFU/mL。

3、交叉反应

结果：沙门氏菌菌属的均显色，对甲型副伤寒沙门氏菌（A群）、鼠伤寒沙门氏菌（B群）、阿贡那沙门氏菌（B群）、乙型副伤寒沙门氏菌（B群）、汤普逊沙门氏菌（C1群）、布洛克利沙门氏菌（C2群）、肯塔基沙门氏菌（C3群）、肠炎沙门氏菌（D群）、都柏林沙门氏菌（D群）、伤寒沙门氏菌（D群）、鸭沙门氏菌（E群）、亚利桑那沙门氏菌（Arizona亚属）。而10^8 CFU/mL浓度的其它测试菌株E.coli、E.coli O157:H7、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌均不显色（OD< 0.15）。说明建立的沙门氏菌夹心ELISA方法具有沙门氏菌属特异性，与E.coli、E.coli O157:H7、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌无交叉反应，特异性良好。