加快凤阳产气霉生长的方法及所用的预处理后活性炭颗粒

摘要

本发明公开了一种用于加快凤阳产气霉生长的预处理后活性炭颗粒，其制备方法为依次进行以下步骤：1)、加热洗涤：在活性炭颗粒中加入去离子水后煮沸，弃去废液后，得初次洗涤后活性炭颗粒；2)、超声波清洗：在初次洗涤后活性炭颗粒中加入去离子水进行超声波清洗，弃去废液后，得二次洗涤后活性炭颗粒；3)、将二次洗涤后活性炭颗粒用去离子水反复清洗，直至洗涤液中无肉眼可见浑浊；4)、将步骤3)所得的活性炭颗粒沥干水分后烘干。本发明还同时提供了利用上述预处理后活性炭颗粒进行加快凤阳产气霉生长的方法，在凤阳产气霉生长环境中配设预处理后活性炭颗粒，目的是为了吸附凤阳产气霉生长过程中所产生的VOCs。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，尤其是提供一种用活性炭吸附加快凤阳产气霉生长的方法。

背景技术

产气霉(Muscodor spp.)(现在也称麝香霉)是一类属于炭角菌科的内生真菌，最早由 Worapong等(2001)从肉桂树分离所得，其显著特征是能产生挥发性有机化合物(volatile  organic compounds，简称VOCs)，这些VOCs具有广泛的生物活性，能抑制或杀死许多病原 真菌、病原细菌和一些昆虫。而后，人们利用其特有的形态学、生理学、生物化学方面的特 征及核糖体RNA的序列来寻找和鉴定新的产气霉属内生真菌，越来越多的产气霉种被发现。 由于产气霉能产生有广泛抑菌活性的VOCs，科学家们利用GC-MS等化学分析手段分离鉴定 了产气霉产生的VOCs成分，发现不同菌株产生的VOCs成分不尽相同。尽管VOCs具有广 泛的抑菌活性，而产气霉自身生长速度非常缓慢，在工业发酵上成为难以突破的瓶颈。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种加快凤阳产气霉生长的方法及所用的预处理后活性 炭颗粒。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于加快凤阳产气霉生长的预处理后活性炭颗 粒，其制备方法为依次进行以下步骤：

1)、加热洗涤：

在活性炭颗粒中加入去离子水后煮沸，弃去废液后，得初次洗涤后活性炭颗粒；

2)、超声波清洗：

在初次洗涤后活性炭颗粒中加入去离子水进行超声波清洗，弃去废液后，得二次洗涤后 活性炭颗粒；

3)、将二次洗涤后活性炭颗粒用去离子水反复清洗，直至洗涤液中无肉眼可见浑浊；

4)、将步骤3)所得的活性炭颗粒沥干水分后于50～70℃(较佳为60℃)烘干至恒重。

作为本发明的用于加快凤阳产气霉生长的预处理后活性炭颗粒的改进：

所述步骤1)的加热洗涤重复3～5次后，再进行步骤2)。

作为本发明的用于加快凤阳产气霉生长的预处理后活性炭颗粒的进一步改进：

所述步骤1)中：活性炭颗粒与去离子水的用量比为1g：4～6ml，煮沸时间为20～40min；

所述步骤2)中：于53KHZ超声波清洗仪进行清洗，清洗时间为20～40min(例如为 30min)。去离子水与步骤1)中的活性炭颗粒的用量比为8～10ml：1g。

本发明还同时提供了利用上述预处理后活性炭颗粒进行加快凤阳产气霉生长的方法，在 凤阳产气霉生长环境中配设预处理后活性炭颗粒(目的是为了吸附凤阳产气霉生长过程中所 产生的VOCs)。一般而言，每100g培养基配设20～30g预处理后活性炭颗粒。

备注说明：上述预处理后活性炭颗粒实际使用前，需高压(1.05×10⁵Pa、121℃)灭菌锅 中灭菌30min，烘干(60℃烘干至恒重)。然后才能放入凤阳产气霉生长环境中。

作为本发明的加快凤阳产气霉生长的方法的改进：凤阳产气霉的生长方式为平皿生长或 发酵生长。

在本发明中，活性炭颗粒的粒径约为200目。例如可选用沪试牌颗粒活性炭(编号 7440440)。

本发明所述的凤阳产气霉为Muscodor sp.ZJLQ024(亦名：Muscodor.fengyangensis  ZJLQ024)，在专利号为200910153512.0的发明《Muscodorsp.属植物内生真菌ZJLQ024及其 用途和杀菌剂》中有明确告知，保藏号为CGMCC No.2863。

产气霉因其产生的VOCs对多数细菌、真菌及昆虫具有抑制甚至杀死作用，其作为生物 防治制剂具有很大的应用潜力，目前在农业、医药及工业应用上受到越来越多科技工作者的 重视。凤阳产气霉Muscodor.fengyangensis ZJLQ024在培养的过程中生长十分慢，是由于产 生的VOCs成分抑制了自身的生长。本发明采用预处理后活性炭吸附的方法，证明活性炭吸 附对凤阳产气霉为Muscodor sp.ZJLQ024生长有促进作用，为凤阳产气霉快速发酵提供指导 意义。

本发明的优点是：在凤阳产气霉生长过程中，提供活性炭吸附VOCs的方法，使有抑菌活 性的VOCs部分被活性炭吸附，从而减缓VOCs对凤阳产气霉生长的影响而加快凤阳产气霉 的生长。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为不同条件下生长的凤阳产气霉ZJLQ024(培养8天)；

图2为凤阳产气霉ZJLQ024生长曲线；

图3为有无活性炭的凤阳产气霉ZJLQ024对峙病原指示菌效果对比；

对峙病原指示菌从上至下依次为青霉菌(KH8)、灰霉(ZAU10)、立枯丝核菌(ZAU05)、 桃子褐腐菌(TZ01)；

图4为固相微萃取-气质联用测定的凤阳产气霉ZJLQ024挥发性有机化合物的总离子流 图；

图5为固相微萃取-气质联用测定的加活性炭的处理组产气霉ZJLQ024挥发性有机化合 物的GC-MS总离子流图；

图6为加入活性炭(左图)和不加活性炭(CK，右图)的固体发酵产物的生长对比。

具体实施方式

材料：供试菌株为凤阳产气霉Muscodor fengyangensis ZJLQ024。

病原指示菌包括：KH8青霉菌Penicillium expansum；ZAU10灰霉菌Botrytis cinerea； ZAU05立枯丝核菌Rhizoctonia solani；TZ01桃子褐腐菌Monilinia fructicola等；

活性炭来源为沪试牌颗粒活性炭(编号7440440)，该试剂大小约为200目，黑色无定形 粒状物或细微粉末。无臭。无味。无砂性。不溶于任何溶剂。对各种气体有选择性的吸附能 力，对有机色素和含氮碱有高容量吸附能力，每g总表面积可达500～1000m2，相对密度约 1.9～2.1，表观相对密度约0.08～0.45。

本发明所涉及的仪器包括超净工作台、恒温培养箱、电子天平、pH计、烘箱、电磁炉、 微波炉、冰箱、真空干燥箱、GRT-20D型50L固体发酵罐、超声波仪、Agilent 6890N-5975B 型GC-MS仪、MLS3750型高压灭菌锅、BS233S型分析天平、顶空固相微萃取装置等。

本发明涉及五种培养基，分别为PDA培养基、PDB培养基、察氏培养基、冷冻保存培养 基和麦粒固体发酵培养基，其配制方法分别如下：

PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂1.5％(即， 15g琼脂)，自来水1000mL。取定量土豆切成均匀小块，加水煮沸至土豆用玻璃棒一戳击破， 8层纱布过滤，加入20g葡萄糖，冷却，加自来水定容至1000mL，三角瓶装1.5％的琼脂， 加入液体，封装，121℃、15min高压灭菌。

PDB培养基(马铃薯葡萄糖培养基)：土豆200g，葡萄糖20g，自来水1000mL。取定 量土豆切成均匀小块，加水煮沸至土豆用玻璃棒一戳击破，8层纱布过滤，加入20g葡萄糖， 冷却，加自来水定容至1000mL，封装，121℃、15min高压灭菌。

察氏培养基：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫 酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。将离子化合物硝酸钠、磷酸氢二钾、硫 酸镁、氯化钾及硫酸亚铁加离子水配成母液，用无菌过滤器过滤液体。其余如蔗糖，琼脂， 蒸馏水按比例装瓶，121℃、15min高压灭菌。将其溶解后倒在培养皿前，将无机离子化合物 混合液按比例与培养基混合。

冷冻保存培养基(液体)：葡萄糖10g，酵母提取物1g，酸水解酪蛋白0.5g，丙三醇(甘 油)180mL。用蒸馏水将葡萄糖、酵母提取物、酸水解酪蛋白溶解后，再加入甘油、最后用 蒸馏水定容至1000mL，121℃、灭菌20min。

麦粒固体发酵培养基：取一定量麦粒加自来水浸泡过夜，浸泡时间7-9h左右。倒掉麦粒 多余的水分，100g麦粒装至1L的三角瓶，121℃、40min连续高压灭菌两次。

实施例1、菌株的保存和活化培养(属于常规技术)

1、菌株的常温或低温保存

在超净工作台，于2ml无菌冷冻保存管加入不超过1.5ml融化的PDA培养基，盖盖，倾 斜放置。待凝固后，将保存的菌株接种到斜面培养基，数天后，菌丝成功定殖于斜面，可见 新鲜的菌丝长出，加入经3次高压灭菌的石蜡将菌丝淹没，盖盖，于常温下或10℃冰箱保存。 使用时，用无菌牙签挑取菌组织，接种于平板PDA培养基上进行活化。

2、菌株的冷冻保存

于超净工作台，在PDA上的菌落挖取4-5块菌块，置于2ml无菌冷冻保存管，加入高压 灭菌的冷冻保存液，将菌块淹没。盖盖，将冷冻保存管依次于4℃和-20℃下放置1h后，转移 至-80℃超低温冰箱中进行长期保存。使用时，于室温中自然解冻，挑取其中的菌块接种于平 板PDA培养基上进行活化。

3、菌株的活化

用牙签从保存菌株的冷冻保存管中取得菌块，将其接种到PDA培养基，封口膜封口于 25℃，黑暗培养箱培养。

实施例2、活性炭的预处理

为保证活性炭的高吸附活性，活性炭进行如下预处理，依次进行以下步骤：

1)、加热洗涤：

称取100g刚开封的沪试牌颗粒活性炭，置于1000ml大烧杯中，加入500ml去离子水， 于电热锅煮沸30min，弃去废液，再重复4次(即，共进行5次)；得初次洗涤后活性炭颗粒；

2)、超声波清洗：

用干净的手套挤压初次洗涤后活性炭颗粒，将水分沥干后，转移到1000ml大烧杯中， 加800ml去离子水，置于53KHZ超声波清洗仪中清洗30min，弃废液，得二次洗涤后活性 炭颗粒；

3)、用去离子水反复清洗二次洗涤后活性炭颗粒，直至洗涤液中无肉眼可见浑浊。

4)、将步骤3)所得的活性炭颗粒沥干水分后置于平皿中，放入烘箱(60℃)中烘干2 天至恒重；得预处理后活性炭颗粒。

将预处理后活性炭颗粒置于干燥洁净的200ml广口瓶中，加盖密封备用。在实际使用之 前，迅速用分析天平称取1.5g或1.0g活性炭于洁净的9ml塑料试管中，密封并置于高压(1.05 ×10⁵Pa、121℃)灭菌锅中灭菌30min，烘干(60℃烘干至恒重)。

实施例3、

从保存菌株的冷冻保存管中将产气霉ZJLQ024菌株接种在平皿PDA培养基上进行活 化，待菌落直径达到6-7cm时使用。在无菌三格培养皿的1格中倒入融化的PDA培养基， 待培养基冷却凝固后备用。取培养好的产气霉ZJLQ024菌落，用5mm打孔器于菌落边缘打 孔得到直径为5mm的菌饼，将菌饼接种于平皿培养基的装有PDA培养基的这1格中，另一 格中加入1.0g高压灭菌后活性炭(实施例2所得)，用双层Parafilm封口膜封住培养皿。以 不加活性炭，仅加产气霉ZJLQ024为对照组(即，用不加入活性炭的产气霉ZJLQ024培养 基作为对照组)，于25℃黑暗培养。进行3次重复。每天定时拍照，并记录菌落直径。

加活性炭的处理组凤阳产气霉ZJLQ024生长速度大于对照组的凤阳产气霉ZJLQ024，处 理组菌落直径大于对照组(图1和图2)。因此我们可以看到由于活性炭吸附了VOCs，凤阳 产气霉生长速度加快，实验结果表明VOCs一定程度上抑制了凤阳产气霉ZJLQ024的生长。

实施例4、被活性炭吸附的凤阳产气霉ZJLQ024活性对峙实验

从保存菌株的冷冻保存管中将凤阳产气霉ZJLQ024菌株接种在平皿PDA培养基上进行 活化，待菌落直径达到6-7cm时使用。在无菌三格培养皿的两格中倒入融化的PDA培养基， 待培养基冷却凝固后备用。取培养好的凤阳产气霉ZJLQ024菌落，用5mm打孔器于菌落边 缘打孔得到直径为5mm的菌饼，将菌饼接种于上述三格平皿培养基的装有PDA培养基的其 中1格中，在空格中加入1.0g高压灭菌后活性炭(实施例2所得)；用双层Parafilm封口膜 封住培养皿，于25℃黑暗培养。10d后，于无菌环境中，打开双层Parafilm封口膜，将病 原指示菌---青霉菌(KH8)，灰霉(ZAU10)，立枯丝核菌(ZAU05)、桃子褐腐菌(TZ01) 中的任意一种接种于装有PDA培养基的另1格中；然后再次用双层Parafilm封口膜封住培 养皿，于25℃黑暗培养，以此作为实验组。以不加活性炭(仅有病原指示菌和凤阳产气霉 ZJLQ024)为对照组。进行3次重复。实验组和对照组均继续于25℃黑暗培养，然后分别于 青霉菌(KH8)接种生长2天后，灰霉(ZAU10)接种生长1天后，立枯丝核菌(ZAU05) 接种生长7天后，桃子褐腐菌(TZ01)接种生长7天后进行测定，测定结果如图3所示。

备注说明：病原指示菌的接种量为5mm菌饼。

通过活性对峙实验(图3)发现，有活性炭存在的处理组ZJLQ024并没有完全失去活性， 甚至可以部分抑制病原指示菌，如灰霉(ZAU10)等，说明VOCs部分被活性炭吸收。

实施例5、测定活性炭吸附的VOCs成分

将凤阳产气霉菌株在PDA培养基中活化培养，用打孔器打出直径0.5cm菌丝块，如同 实施例3，接种在培养皿内的PDA培养基上，以培养皿内加有活性炭的作为实验组(处理组)， 以不加活性炭的作为对照。用双层Parafilm封口膜封住培养皿，24℃培养10d后采样检测。

固相微萃取(Solid Phase Microextraction,SPME)装置(SUPELCO,USA)，用SPME注 射器萃取产气霉菌丝产生的挥发性有机化合物，萃取探头涂层为50/30μm  Divinylbenzene/Carboxen/Polydimethylsiloxane(DVB/CAR/PDMS)。在萃取挥发性有机化合物 前，SPME针头插入气相色谱进样口，推出萃取头，使之在240℃氦气流下老化20min；SPME 针头从培养皿一侧的小孔中插入，推出萃取头，不要碰到菌丝，萃取45分钟。将萃取头缩回 保护针管，立即插入已准备好的GC-MS进样口，推出萃取头，利用气化室的高温解析目标 分析物后，进行色谱测定。

气相色谱仪-质谱仪(Agilent 6890N/5975B)，石英毛细管柱HP-5MS(5％苯甲基硅氧烷: 0.25mm×30m,0.25μm)。色谱条件：载气为氦气，柱流量1.0mL·min-1；汽化室温度：240℃， 色谱柱初始温度30℃，保持3min，以5℃·min-1升温速率升至220℃，最后270℃维持1min。 进样量1.0μL，不分流。质谱条件：EI电离源，电离电压70eV，离子源温度230℃，质谱扫 描速率为：3.35scans/s；质谱范围：20-450amu。通过NIST05数据库(Agilent)比较鉴定挥 发性物质。对照组检测到的峰，将在处理组中获得的峰中进行扣除。

为了确定凤阳产气霉ZJLQ024产生的某些VOCs成分是否被活性炭吸附，将处理组和对 照组的VOCs进行了GC-MS检测。图4是对照组的总离子流图，可以看出色谱峰比较复杂， 通过标准图谱鉴定包括醇类、烯类、脂类等。而相对于对照组，处理组总离子流图十分简单， 仅有两个明显的峰形，VOCs成分大大减少，经鉴定为乙醇和乙酸乙酯(图5)。

实施例6、收集固体发酵过程中产生的VOCs

取灭菌的麦粒培养基100g，接种10ml PDB摇瓶培养6天的凤阳产气霉ZJLQ024均匀菌 丝液(无菌榨汁机处理)，混合均匀，然后用无菌纱布袋装20g高压灭菌后活性炭(实施例2 所得)于三角瓶，纱布系紧绳子悬挂在瓶内的培养基上方，用8层纱布和报纸封口；作为处 理组；以不加高压灭菌后活性炭的作为对照组。重复3次，培养待用。

摇瓶中通过加入活性炭的处理组相比对照组(未加活性炭)固体发酵产物发酵效果更好， 处理组的麦粒可清晰看到定殖在麦粒上的产气霉ZJLQ024，而对照组产气霉ZJLQ024生长非 常缓慢，看不到白色的产气霉菌丝(图6)。

对比例1、取消实施例2中的步骤1)，即，将100g刚开封的沪试牌颗粒活性炭直接进行 后续的步骤2)，其余等同于实施例2。

对比例2、取消实施例2中的步骤2)，即，将初次洗涤后活性炭颗粒直接进行后续的步 骤3)；其余等同于实施例2。

将上述所有对比例所得的预处理后活性炭颗粒实际使用前置于高压(1.05×10⁵Pa、121℃) 灭菌锅中灭菌30min，烘干(60℃烘干至恒重)；然后如同实施例3进行培养，所得结果如表 1所示。

表1、菌落直径(mm)

实验组 1天 2天 4天 6天 7天 8天 实施例3 6 7 12 17 18.5 20 对比例1 6 6 9 14 15 15.5 对比例2 6 6 10 15 16 16.5

根据表1，我们得知：采用本发明方法所得的预处理后活性炭颗粒，凤阳产气霉的生长 速度明显较快。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导 出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。