一种载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料的制备方法

摘要

本发明公开了一种载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料的制备方法，包括：（1）利用木醋杆菌静态发酵获得细菌纤维素；（2）对细菌纤维素进行碱洗处理后打浆制成均相悬浮液；（3）配制海藻酸钠溶液；（4）将磺胺嘧啶银在水中进行超声处理；（5）将海藻酸钠溶液，细菌纤维素均相悬浮液和磺胺嘧啶银悬浮液混合制成均相混合液后；将其倒入模具中，用5%CaCl

说明书

技术领域

本发明涉及物医学材料领域，特别涉及一种载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料的制备方法。

背景技术

当皮肤因高温烫伤或烧伤时，伤口组织暴露，产生脓血，为细菌提供了湿润的生存环境，伤口很难自愈。理想的烧伤创面敷料应具有以下特点：1.具有良好的生物相容性；2.属于半闭合或闭合性质；3.可以在创面上形成良好的透水、透气功能；4.能为创面创造一个微湿、微酸、低氧环境。目前国内已有的敷料材料主要包括普通植物纤维，羧甲基纤维素类，壳聚糖；但普遍存在产品种类和功能单一、没有形成系列产品、功能性缺陷等诸多问题，因此有必要研究开发新型烧伤敷料并赋予其优异的性能和临床功效。

细菌纤维素（Bacterial cellulose，BC）是由一定的微生物（主要为细菌）产生的细胞外纤维素，木醋杆菌（Acetobacter xylinum）是目前生产细菌纤维素的主要用菌。细菌纤维素的微纤维直径只有40-60 nm，是自然界中天然存在的精细纳米材料，具有独特的性质：（1）具有高化学纯度和高结晶度；（2）具有很强的持水能力，未经干燥的细菌纤维素持水能力达1000%以上，冷冻干燥后持水能力仍达600%；（3）具有较高的生物相容性和生物可降解性，自然环境中，在酸性、微生物以及纤维素酶催化等条件下可以最终降解成单糖等小分子物质；（4）纤维直径在0.01-0.1 m之间，弹性模量为一般植物纤维的数倍至十倍以上，并且抗拉强度高；（5）细菌纤维素生物合成时具有可调控性，通过调节培养条件，可得到化学性质有差异的细菌纤维素。目前，细菌纤维素在食品、声音振动膜、造纸、医学材料等方面具有广泛的应用。细菌纤维素虽然具有很多优异的性能，但其自身没有抗菌性，对伤口愈合的促进效果不明显，影响了细菌纤维素的应用和发展。

海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取的一种天然高分子材料，具有促进伤口愈合、保湿、生物相容性好、可被人体吸收等功能。应用在医用辅料上的一般是海藻酸的钙盐，当其与伤口脓血接触后，会形成一层湿润的水凝胶，为伤口提供的潮湿的愈合环境，对创面起到保护作用，并通过刺激伤口巨噬细胞的活化来增强创面抗治病微生物的防御能力，并且避免了传统辅料在更换时与伤口粘连引起二次感染，有效地促进了伤口愈合。此外，研究表明，海藻酸钠可以有效地控制药物的释放，在慢性伤口的治疗领域有很广阔的应用前景。但单独应用时黏附性较差、脆性大、力学性能差，使其应用受到限制。

磺胺嘧啶银（Silver Sulfadiazine）别名烧伤宁，为预防、治疗烧伤创面感染的常用药物，遇液体后可分解为磺胺嘧啶及银离子，磺胺嘧啶通过对脓液中PABA（对氨苯甲酸）竞争性作用抑制细菌蛋白质的合成；银离子能与细菌体内脱氧核糖核酸相结合起到抗菌作用。磺胺嘧啶银抗菌谱广，对多数革兰阳性菌和阴性菌有良好的抗菌活性，并可促进创面干燥、结痂及愈合，用于预防和治疗II度、III度烧伤或者烫伤继发的创面感染。目前临床多将其与医用辅料等结合制成软膏涂抹伤口处，存在着涂抹不均匀、刺激创面、渗透性差、容易污染变质、易粘连等缺点，不利于伤口愈合。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在问题，本发明的目的是提供一种载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料的制备方法，将磺胺嘧啶银，细菌纤维素与海藻酸钠进行复合，原料得到100%利用，制备的复合材料复合抗菌敷料具有良好的渗透性、生物相容性、吸水和保水性、力学性能和抗菌性，既弥补了细菌纤维素、海藻酸钠和磺胺嘧啶银材料单独使用时的不足，又保持了各自独特的优异性质，在医用辅料领域有很大的应用潜力。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料的制备方法，包括以下操作步骤：

1）将活化后的细菌纤维素生产菌接入种子培养基培养，再按照5-10%的接种量接入发酵培养基中，充分混合均匀后，放置在30±2℃恒温培养箱中，静置发酵1-2周，获得细菌纤维素湿膜；

2）将细菌纤维素湿膜清洗后通过机械方法打浆成均相悬浮液；

3）配制浓度为1-4wt%的海藻酸钠溶液；

4）将细菌纤维素均浆与海藻酸钠溶液混合，磁力搅拌混合均匀后，在避光条件下加入磺胺嘧啶银，继续搅拌至磺胺嘧啶银完全分散，得到混合凝胶；

5）将混合凝胶超声处理3-5min进行脱泡，然后分别取0.1-0.5mL加入到48或24孔细胞培养皿模具中；

6）配制2-5%的CaCl₂溶液，将该溶液置于微孔喷壶中，向模具中凝胶表面喷洒，待凝胶表面交联固化后，将CaCl₂溶液倒入模具中，固化1-5小时；

7）取出复合凝胶，用去离子水反复清洗干净，用滤纸吸掉表面水分，-80 - -40℃冷冻干燥后得载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料。

所述的菌种为醋酸菌属中的木醋杆菌。

所述的细菌纤维素均相悬浮液浓度为50-100g/L。

所述的细菌纤维素均浆与海藻酸钠溶液的质量比为1~4:1。

在混合磺胺嘧啶银过程中采用冰浴和避光的条件，防止磺胺嘧啶银变质。

磺胺嘧啶银的质量比为0.008%-0.1%。

均相混合液的过滤是在-0.08 MPa至-0.1MPa下的减压过滤。

所述的制备方法所获得的载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：

（1）本发明所获得的载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料，克服了细菌纤维素不具有抗菌性，海藻酸钠黏着性差、脆性大等问题，具有良好的生物相容性、抗菌性和力学性能，使敷料完好的贴附在伤口上，具有杀菌、消炎、止血、止痛减少感染和促进伤口加速愈合等功效。

（2）本发明所获得的载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料，是以细菌纤维素和海藻酸钠复合材料作为基底呈超精细网状结构，与其他高分子材料如壳聚糖、明胶等相比较，在力学性能、透气性、亲水性和持水性等方面均具有显著的提高。

（3）为伤口愈合提供了良好的潮湿环境，容易更换，避免了二次创伤。

（4）本发明所获得的载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料，有很好的缓释能力，当敷料与伤口的脓血接触时，其中的Ca²⁺与脓血中的Na⁺发生离子交换，敷料形成一层湿润的水凝胶，使磺胺嘧啶银释放到创面；与其他工艺如喷涂技术等相比较，本发明是以细菌纤维素和海藻酸钠复合材料作为药物磺胺嘧啶银的载体材料，磺胺嘧啶银均匀的分散在载体材料的表面和内部，可使被承载的药物缓慢释放，同时抗菌辅料可根据伤口的大小和创伤程度，有效地控制释放速度和释放量，增强磺胺嘧啶银的效能，促进伤口的愈合，减少病人的疼痛。

（5）本发明的制备过程不涉及有毒化学试剂和高温，过程简单、绿色、易操作，可工业化生产，在医用辅料领域有很大的应用潜力。

附图说明

图1分别为细菌纤维素/海藻酸钠复合材料（a和b）和实施例1载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料（c和d）的SEM图片；图a和c为放大2000倍的SEM照片，图b和d为放大5000倍的SEM照片；

图2是细菌纤维素/海藻酸钠复合材料和载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料的FT-IR图；图中，a为细菌纤维素/海藻酸钠复合材料的FT-IR图，b为载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料的FT-IR图，c为磺胺嘧啶银的FT-IR图；

图3是细菌纤维素/海藻酸钠复合材料（a，c和e）和载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料（b，d和f）抑菌圈的照片；其中，a和d是大肠杆菌（Escherichia coli），b和e是白色念珠菌（Candida albicans），c和f是金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不受这些实施例的限制。

实施例1

将酵母提取物（5g/L）、葡萄糖（5g/L）、磷酸二氢钾（1g/L）、七水合硫酸镁（15g/L）和蛋白胨（5g/L）分别配制成100mL的种子培养基和200mL的发酵培养基，无须调节pH值。将种子培养基和发酵培养基放入灭菌锅中，温度为121℃、压强为0.1MPa，灭菌20分钟，待培养液冷却后加入乙醇（20mL/L）。将活化后的木醋杆菌接种至种子培养基中，在30℃和160rpm/min的摇床中培养24h。按照6%（体积比，5-10%范围内均可）的接种量将种子培养液接种于发酵培养基中充分震荡使其混合均匀，然后30±2℃下静置培养1-2周，得到乳白色细菌纤维素膜。用去离子水冲洗细菌纤维素表面的残留物，浸泡在0.1M的NaOH溶液中，80℃加热搅拌1h，然后用醋酸调节pH至7.0，最后用去离子水冲洗细菌纤维素膜。将细菌纤维素湿膜通过机械方法打浆成均浆，与2%的海藻酸钠溶液以质量比为4:1进行混合生成凝胶。取1.2mg磺胺嘧啶银加入到5g上述混合凝胶中，磺胺嘧啶银的重量比为0.024%，搅拌至磺胺嘧啶银均匀分散，然后超声波处理3min进行脱泡。分别取细菌纤维素/海藻酸钠/磺胺嘧啶银混合凝胶0.25mL加入到48孔细胞模具中。将置于微孔喷壶中的5% CaCl₂溶液，喷洒到凝胶表面，待凝胶表面交联固化后，将CaCl₂溶液倒入模具中，固化3h。取出复合凝胶，用去离子水反复清洗干净，用滤纸吸掉表面水分，-80℃真空冷冻干燥机干燥12h后得载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料。

实施例2

方法同实施例1，不同之处在于，细菌纤维素均相悬浮液与海藻酸钠溶液以质量比为1:1进行混合生成凝胶，再与磺胺嘧啶银搅拌均匀后超声脱泡处理，固化，最后-80℃真空冷冻干燥，得到载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料。

实施例3

方法同实施例1，不同之处仅在于，将0.8mg磺胺嘧啶银加入到5g细菌纤维素和海藻酸钠的混合凝胶，磺胺嘧啶银的重量比为0.016%，搅拌均匀后后超声脱泡处理，固化，最后-80℃真空冷冻干燥，得到载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料。

实施例4

方法同实施例1，不同之处仅在于，细菌纤维素均相悬浮液与海藻酸钠溶液以质量比为2:1进行混合生成凝胶，将3mg磺胺嘧啶银加入到5g细菌纤维素和海藻酸钠的混合凝胶，磺胺嘧啶银的重量比为0.06%，搅拌均匀后超声脱泡处理，固化，最后-80℃真空冷冻干燥，得到载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料。

性能测试：

（1）扫描电子显微镜（SEM）测试

图1分别为细菌纤维素/海藻酸钠复合材料（a和b）和实施例1载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料（c和d）的SEM照。图a和c为放大2000倍的SEM照片，图b和d为放大5000倍的SEM照片。从图1中可以观察到磺胺嘧啶银均匀地分布在细菌纤维素/海藻酸钠复合材料的表面和内部。

（2）红外光谱（FT-IR）测试

载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料的FT-IR图，如图2所示。图中，曲线a为细菌纤维素/海藻酸钠复合材料的FT-IR图，曲线b为载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料的FT-IR图，曲线c为磺胺嘧啶银的FT-IR图。从曲线a可以看出细菌纤维素/海藻酸钠复合材料中-OH的伸缩振动峰出现3700-3100cm^?1的范围中。从曲线c可以看出3343和3393cm^?1处的吸收峰归属于磺胺嘧啶银中-NH₂的对称和不对称伸缩振动，1654cm^?1是氨基的剪切振动峰, 1552和1598 cm^?1属于苯环和嘧啶环中-C=N-的吸收峰。载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料（曲线b）可以看出磺胺嘧啶银的各官能团出现在复合材料之中，证实了磺胺嘧啶银成功地载入复合抗菌敷料之中。

（3）抗菌实验：

实验采用液态培养体系，以纯细菌纤维素/海藻酸钠复合膜作对照样，通过测量抑菌圈的大小和直径进行表征。

具体步骤为：

a.菌液制备

采用的固体培养基为胰酪胨大豆琼脂培养基Tryptose Soya Agar（TSA），培养基组成为：酪蛋白胰酶消化物15.0g/L，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂15.0g/L，pH值7.2，高压蒸汽121℃灭菌20分钟后，倒平板。用灭菌接种环取冷冻保存的大肠杆菌（Escherichia coli），白色念珠菌（Candida albicans）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌种分别接种到TSA培养板上，置于培养箱37℃恒温培养24h，用灭菌接种环挑取菌落分别加入盛有100mL灭菌的胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）的无菌锥形瓶中，培养4-6h，采用比浊法测量使其细菌浓度在1×10⁶CFU/mL左右。

b.抑菌圈实验

将取0.1mL培养好的细菌菌液用无菌涂布器涂在TSA板上，将待测试样品（直径1cm）放到菌液上方，将培养皿分别置于37℃培养24h。

载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料对大肠杆菌的抗菌结果，如图3d所示。载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料具有非常良好的抗大肠杆菌的效果。

载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料对大肠杆菌的抗菌结果，如图3e所示。载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料具有非常良好的抗大肠杆菌的效果。

载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料对金黄色葡萄球菌的抗菌结果，如图3f所示。载磺胺嘧啶银复合抗菌敷料具有非常良好的抗金黄色葡萄球菌的效果。