一种梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法

摘要

本发明公开了一种梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，包括如下步骤：(1)提取梨种苗基因组DNA；(2)以SEQ ID NO：1～2所示的核苷酸序列为引物，步骤(1)得到的梨种苗基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；(3)利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测步骤(2)得到的扩增产物；(4)分析凝胶电泳结果，若凝胶电泳中同时出现大小为60bp和90bp的条带，则判定该种苗为‘苏翠1号’杂交种苗。该方法具有标记稳定，准确性高，不受被测样品生长阶段与环境影响，在整个生长季节都可以进行，成本低廉，并且能够在短时间内准确地鉴定出梨‘苏翠1号’杂交种苗的遗传纯度等优点。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，利用 SRAP分子标记技术进行梨品种‘苏翠1号’种苗遗传纯度的检测。

背景技术

杂交育种在作物育种工作中占据重要的位置，近年来，利用杂交育种在农业上培育 出许多优良品种，在木本植物方面也取得了丰硕成果，随着社会经济的发展，优良新品 种在果树生产中的地位越来越重要，他们所起的作用也越来越大。与此同时，种苗市场 鱼龙混杂，以劣充优，以假乱真的现象时有发生，虚假广告在各种媒体上大量传播，不 仅损害了农民利益，也对果树生产和生态建成构成极大的威胁，在种苗流通领域中，一 些不法经营者利用人们对新品种的渴求心理，随意夸大新品种的特性和适生范围，或将 同一品种冠以不同的、时髦的名称，以假乱真，更有甚者，受经济利益驱使，未经审定 或认定，便跨区域、经营性推广自称所谓的“良种”。品种在推广应用过程中，如误用 了混杂、错误或不当的品种必定会导致生产、销售、观赏等方面的经济价值、实用价值 严重损失，严重者甚至涉及品种知识产权法律纠纷，因此，生产、科研中保证品种真实 性、一致性是非常重要的技术环节，在杂交种苗销售之前，对杂交种苗的遗传纯度进行 快速、准确鉴定是极其重要的，可确保品种在生产上的大力推广。

早期，人们采用形态学方法对品种进行鉴别主要有田间种植鉴定、同工酶鉴定，但 田间鉴定需要播种育苗，移栽入大田中，然后对形态特征进行观察，耗时长，工作量大， 容易受季节和环境的影响，并且随着育种亲本的利用集中化，使得所选育的新品种在更 多的性状上更加相似而难以区分，有时由于梨树真假种苗之间形态学的差异表现不是很 明显，在苗期不易鉴别，尤其当亲本之间遗传基础很近时，更加不易鉴别。同工酶分析 容易受到环境和所取材料部位的影响，且对于一些亲本遗传差异较小的杂交品种，同工 酶有时难以进行纯度检测与鉴定，准确度不高。

随着分子生物学技术的迅猛发展，而使从DNA分子的角度准确可靠的对品种及种 苗进行基因鉴定和纯度分析成为可能，其中SRAP分子标记技术，由于其快速简便，客 观准确、稳定可靠，成本相对较低等优点，成为果树种苗遗传纯度鉴定的首选技术之一， 已开始在多种作物中得到应用。

‘苏翠1号’(苏鉴果201106)是江苏省农科院园艺研究所利用华酥与翠冠杂交选 育而成的优质早熟大果型梨杂交品种(蔺经.早熟砂梨新品种‘苏翠1号’[J].园艺学报， 2013，40(9)：1849～1850)。该品种不仅早熟性好、早期产量高、丰产稳产，而且具有 口感风味佳、成熟整齐、营养丰富等优点，适宜在江苏、浙江、湖北推广应用。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是，提供一种梨杂交种苗遗传纯度的快速鉴定方法，提 高鉴定效率，从而为梨树种苗纯度的快速鉴定建立起高效准确的质量控制方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种梨杂交种苗遗传纯度的鉴定方法，包括如下步骤：

(1)提取梨种苗基因组DNA；

(2)以SEQ ID NO：1～2所示的核苷酸序列为引物，步骤(1)得到的梨种苗基因组 DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；

(3)利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测步骤(2)得到的扩增产物；

(4)分析凝胶电泳结果，若凝胶电泳中同时出现大小为60bp和90bp的条带，则判 定该种苗为‘苏翠1号’杂交种苗。

步骤(1)中，梨种苗基因组DNA的提取方法如下：

(1a)取梨幼嫩叶片约0.1g，用液氮研磨，加入500μl CTAB裂解液与0.2％v/v的β- 巯基乙醇，将得到的混合物在65℃下放置30～50min，

所述的CTAB裂解液的组成如下：0.2g/L CTAB，2mol/L NaCl，20m mol/L EDTA， 100m mol/L Tris-HCl，pH＝8.0；

(2a)取出混合物室温下12,000rpm离心10min，上清液转入新灭菌的1.5ml的离心 管中，加入等体积氯仿：异戊醇混合液，混匀，室温12,000rmp条件下离心10min；

(3a)将上清液吸入新的离心管中，重复步骤(2a)1次，向上清液中加入体积为上清 液的0.1倍的醋酸钠和与上清液等体积的预冷的异丙醇并缓慢翻转，放于-20℃冰箱 30min以上；

(4a)4℃，12,000rmp条件下离心10min，倒掉上清液，用体积分数为70％预冷的乙 醇洗涤沉淀物；

(5a)4℃，12,000rmp条件下离心2～4min，倒掉上清液，得到的沉淀物即为梨种苗 基因组DNA，将沉淀物干燥后加入80μL灭菌的TE缓冲液溶解梨种苗基因组DNA，用 琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA质量后保存于4℃或-20℃备用。

步骤(2)中，所述的PCR扩增，其反应体系为20μL，其中，梨种苗基因组DNA10ng， Mg²⁺2.5mmol·L^-1，dNTPs 0.15mmol·L^-1，SEQ ID NO：1～2所示的引物各0.5μmol·L^-1， TaqDNA聚合酶0.75U。

步骤(2)中，所述的PCR扩增，其PCR扩增程序为：90℃3min；94℃1min，35℃1min， 72℃1.5min，5个循环；94℃1min，50℃1min，72℃1.5min，33个循环；72℃7min 延伸，10℃保存。

有益效果：

本发明筛选出能够在杂交种苗中产生具备父母本特异标记条带且不受环境影响的 分子标记，用于鉴定梨‘苏翠1号’杂交种苗的遗传纯度，可以大大的提高杂交种苗遗 传纯度的鉴定效率，从而为杂交种苗遗传纯度的快读鉴定建立起高效、准确的质量控制 方法。该检测方法具有标记稳定，准确性高，不受被测样品生长阶段与环境影响，在整 个生长季节都可以进行，成本低廉，并且能够在短时间内准确地鉴定出梨‘苏翠1号’ 杂交种苗的遗传纯度等优点。

附图说明

图1为梨‘苏翠1号’种苗遗传纯度检测特异性引物JAASSRMe3/JAASSREm11的 SRAP-PCR电泳图谱；

泳道F：‘苏翠1号’母本‘华酥’；泳道M：‘苏翠1号’父本‘翠冠’；泳道1-22：‘苏翠 1号’杂交种苗；泳道L：100bp的分子量标准；箭头指示特异性标记条带。

图2为其他品种的梨种苗与其编号对应表。

图3为其他品种的梨种苗的检测电泳图；

其中，泳道F：‘苏翠1号’母本‘华酥’；泳道M：‘苏翠1号’父本‘翠冠’；泳道L： 100bp的分子量标准；泳道a：‘苏翠1号’；泳道b：‘翠绿’；泳道c：‘中梨1号’，泳道 d：‘翠玉，泳道e：‘初夏绿；泳道f：‘黄冠；泳道g：‘红香酥’；泳道h：‘寒红；泳道i： ‘寒香’；泳道j：‘圆黄’；泳道k：‘秋子梨’。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的 本发明。

本发明中的母本‘华酥’、父本‘翠冠’、‘苏翠1号’均由江苏省农业科学院提供。 实施例1：‘苏翠1号’杂交种苗遗传纯度的快速鉴定。

利用SRAP分子标记技术进行梨‘苏翠1号’杂交种苗遗传纯度的快速鉴定，主要 操作程序如下：

1、DNA提取：

(1)取梨‘苏翠1号’幼嫩叶片约0.1g，经液氮研磨，加入500μlCTAB裂解液(2％ CTAB，2mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl(pH＝8.0)与0.2％的β-巯基 乙醇，体积比)转入1.5ml离心管中，65℃水浴30-50min；

(2)取出在16℃，12,000rpm条件下离心10min，上清液转入新灭菌的1.5ml的离 心管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1，体积比)混合液，轻轻摇晃，室温12,000rmp 条件下离心10min；

(3)将上清液吸入新的离心管中，重复步骤(2)1次，加入0.1体积的醋酸钠和 等体积的预冷的异丙醇并缓慢翻转5-10次，放于-20℃冰箱30min以上；

(4)4℃，12,000rmp条件下离心10min，倒掉上清液，用70％预冷的乙醇洗涤DNA 沉淀物；

(5)4℃，12,000rmp条件下离心2～4min，倒掉上清液，干燥后加入80μL灭菌的 TE缓冲液溶解DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA质量后保存于4℃或-20℃备用。

2、分子标记分析：

利用SRAP引物对梨‘苏翠1号’及其亲本进行PCR扩增，筛选出可以产生目标 条带的特征引物：SRAP引物组合JAASSRMe3/JAASSREm11(其核苷酸序列如SEQ ID  NO：1～2所示)。利用获得的有效特征引物对梨‘苏翠1号’幼苗叶片基因组DNA进 行PCR扩增，SRAP标记扩增反应体系与扩增程序为：

SRAP-PCR反应体系20μl含10ng基因组DNA，2.5mmol·L^-1Mg²⁺， 0.15mmol·L^-1dNTPs，0.5μmol·L^-1SRAP正向引物SRMe3，反向引物SREm11， 0.75UTaqDNA聚合酶；PCR扩增程序90℃3min；94℃1min，35℃1min，72℃1.5min， 5个循环；94℃1min，50℃1min，72℃1.5min，33个循环；72℃7min延伸，10℃保存。

3、扩增产物检测：

SRAP-PCR扩增产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。25ml凝胶中含有： Arc：Bis(29：1，质量比)6.65ml、5×TBE 5ml、TEMED 20μl、10％AP 0.3ml；PCR产 物在6.0％的聚丙烯酰胺凝胶上分离。预电泳50-60V 30min后上样，120V电泳2.5-3.0h； 凝胶采用0.5％冰醋酸、10％的乙醇固定液固定12-20min；0.2％AgNO₃溶液染色15min； 蒸馏水洗涤两次后于显影液(1.5％NaOH，0.4％甲醛，0.002％Na₂S₂O₃)中显影；拍照。

4、杂交种苗遗传纯度的鉴定：

对梨‘苏翠1号’杂交种苗幼苗基因组DNA扩增产物进行电泳分析。根据SRAP 特异性引物产生的目标标记条带来判别真、假杂种种苗。

只有同时具备父、母本特异性标记条带的幼苗单株被判定为真正的杂交种苗，将仅 具备母本特异性条带或父本特异性标记条带的幼苗单株判定为假的杂种种苗。

本试验用90对SRAP引物组合对‘苏翠1号’杂交种苗及其亲本基因组DNA进行 了扩增，经过多次重复，证实引物组合JAASSRMe3/JAASSREm11扩增条带表现为稳定 的共显性，即杂种表现为父母本互补的带型，且条带清晰、重复性好。利用共显性SRAP 引物组合JAASSRMe3/JAASSREm11对200株‘苏翠1号’杂交种苗进行PCR扩增， 在杂交种苗检测中同时产生大小为60bp的母本特异性标记条带 JAASSRMe3/JAASSREm11₆₀与90bp的父本特异性标记条带 JAASSRMe3/JAASSREm11₉₀的幼苗单株判定为真正的杂交种苗，所得纯度为97.5％， 其中3株偏父本型，2株偏母本型(图1)。

根据SRAP分子标记特异性引物的分析结果，计算供检种苗遗传纯度(％)：(供检 种苗数-假杂种种苗数)/供检种苗数*100％。

其中SRAP引物代号为JAASSRMe3/JAASSREm11，其含义为‘JAAS’代表“江 苏省农业科学院”；“SR”代表SRAP引物，“Me3/Em11”代表实验室SRAP引物编号。

实施例2：

本实施例中用到的提取基因组的方法、PCR方法及检测方法与实施例1相同，所不 同的是，本实施例利用共显性SRAP引物组合JAASSRMe3/JAASSREm11对10株其他 品种的梨种苗进行鉴定(图2)，PCR结果(图3)显示其他品种的梨种苗出现明显的多 态性扩增条带，但是与‘苏翠1号’杂交种苗相比，只有‘苏翠1号’在60bp和90bp 处有特异性的条带，其他品种的梨种苗均未能同时出现60bp的母本特异性标记条带和 90bp的父本特异性标记条带(图3)，因此，本实验结果表明，SRAP分子标记方法特异 性与可靠性强，可以用于梨杂交种苗遗传纯度的鉴定。