一种1型鸭甲肝病毒抗体竞争ELISA检测方法

摘要

本发明提供一种1型鸭甲肝病毒抗体竞争ELISA检测方法，解决了目前种鸭和雏鸭体内的DHAV-1抗体效价及商品化DHAV-1卵黄抗体效价难以评估的问题；包括单克隆抗体的制备，检测方法包括以下步骤：抗原包被、洗涤、封闭、洗涤、酶标抗体、洗涤和TMB显色，测定反应各孔OD450nm值；计算血清样品的抑制率，抑制率(％)＝(酶标抗体OD值-样本OD值)×100％/酶标抗体OD值；若PI≥15.21％时，血清为阳性；PI<15.21％时，则判定为阴性。本发明的单抗竞争ELISA检测方法具有单克隆抗体的高度特异性和ELISA试验的高敏感性，结果稳定性好，可以商品化和自动化，可以用肉眼判定。

说明书

技术领域

本发明涉及动物医学技术领域，特别涉及一种1型鸭甲肝病毒抗体竞争 ELISA检测方法。

背景技术

鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis  virus，DHV)引起雏鸭的一种急性、高度致死性传染病，主要侵害1～3周龄的 雏鸭，是严重危害养鸭业的主要传染病之一。目前，该病的已发生于全世界各 个养鸭的国家和地区。

鸭病毒性肝炎由3种不同类型的病毒引起的，分别是1型鸭肝炎病毒 (DHV-1)、2型鸭肝炎病毒(DHV-2)和3型鸭肝炎病毒(DHV-3)，其中2型 和3型鸭肝炎病毒是独立的病原体。近年来，随着鸭病毒性肝炎的发生及新毒 株的出现，关于鸭病毒性肝炎的分类有了新的标准。2007年，台湾学者Tseng 等和韩国学者Kim等分别在台湾和韩国分离鉴定出与DHV-1没有抗原相关性的 DHV新型，并将其命名为台湾新型和韩国新型鸭肝炎病毒。根据最新出版的国 际病毒分类委员会(ICTV)第九次分类报告，将DHV-1、台湾型鸭肝炎病毒、 韩国型鸭肝炎病毒分别定名为鸭甲肝炎病毒(Duck hepatitis A virus 1,DHAV-1)、 DHAV-2和DHAV-3。

目前，我国流行的鸭病毒性肝炎主要是DHAV-1。而实际生产中防制该病的 最常见、最有效的方法之一便是对种鸭进行免疫，利用后代体内的母源抗体来 保护雏鸭渡过最易感的危险期。因此，在生产实践中就迫切需要一种敏感性好 且简单有效的方法来检测免疫后种鸭体内的抗体水平。

目前，DHAV-1抗体的检测方法主要有病毒中和试验、琼脂扩散试验、免疫 荧光技术、间接ELISA方法等。

①中和试验的测定结果准确、可靠，但费时、费力，胚体需采用SPF级别， 试验的成本较高，在生产实践中难以推广应用。

②琼脂扩散试验操作简便、方便，适用于多个血清样品的定性检测，但由 于试验中所采用的抗原是全病毒DHAV-1，DHAV-1的纯化难度较大，杂蛋白较 难除掉，而且试验对检测抗体的要求也较高，抗体的纯度及稀释倍数都要达到 一定的水平才能出现结果，灵敏度不高，故限制了其在实践生产中应用。

③免疫荧光技术对试验设备及实验人员的操作技能都有很高的专业要求， 费用高，因此该方法一般只局限于实验室阶段，难以在生产实践中大范围推广 应用。

④间接ELISA方法是一种敏感性和特异性好的检测方法，能够对多个血清 样品进行检测。已有的与本发明最相近的实现方案是间接ELISA方法。目前建 立的间接ELISA方法有两种类型，一种是采用1型鸭肝炎全病毒作为包被抗原， 但由于鸭肝炎病毒的纯化难度较大，且纯化过程中会受到一些杂蛋白的影响， 故该检测方法虽然已经建立，但目前应用的较少；一种是利用鸭肝炎病毒VP1 基因的原核表达蛋白作为包被抗原，上海兽医研究所已经建立了该检测方法， 并且已经申请了专利，但该方法目前也是处于实验室检测阶段，还没有广泛应 用于临床实践。

间接ELISA的具体实施方法如下：

①包被抗原的制备：若包被抗原为全病毒，一般采用9-12日龄的鸭胚扩增 DHAV-1病毒，尿囊腔接种，0.2ml/只鸭胚，37度孵化，弃掉24小时死亡的胚 体，收集24-96小时内死亡的鸭胚的尿囊液。利用蔗糖密度梯度离心法纯化病毒， 最终获得包被抗原。

若包被抗原为VP1原核表达蛋白，则采用大肠杆菌来表达VP1蛋白，利用离子 交换层析放过滤获得的蛋白，最终获得包被抗原。

②检测步骤：

A.抗原包被：96孔酶标板，每孔包被适量的抗原，抗原用碳酸缓冲液进 行稀释。4度过夜。

B.洗涤：将A中包被的酶标板按照200μL/孔加入PBST洗涤液，震荡洗 涤3-5次，每次5min，甩干。

C.封闭 将A中甩干的酶标板按照200μL/孔加入含5％(体积比)脱脂奶 的PBST封闭液，37℃孵育2h，震荡洗涤3-5次，每次5min，甩干。

D.加样 待检样品按照100μL/孔加入C孵育后的酶标板，置于37℃孵育1 h，震荡洗涤3-5次，每次5min，甩干。

E.酶标二抗 在酶标板中加入用含5％脱脂奶的PBST稀释的酶标二抗(羊 抗鸭或兔抗鸭)，按照100μL/孔加入，37℃孵育1h，震荡洗涤3-5次，每次 5min，甩干。

F.TMB显色 加入新鲜配制的TMB显色液，每孔100μL，37℃避光显色 15min。

G.终止、读数 每孔加入50-100μL 2M H2SO4终止显色反应，在酶标仪 上读取各反应孔的OD450nm值。

目前有的实验室利用VP1蛋白和单克隆抗体建立了用来鉴别诊断1型和3 型鸭甲型病毒性肝炎的竞争ELISA方法，虽然也是采用竞争ELISA方法，该法 与本发明建立的竞争ELISA方法的检测目的不同，采用的单克隆抗体也不同， 检测指标也不同。

因此，现在还没有一种简单实用、且方便操作的DHAV-1抗体检测方法用 在实践生产中，致使大多数的种鸭场主对免疫后的鸭群体内的抗体水平难以测 定，只能通过经验来大体估计，这也是近几年中鸭病毒性肝炎的发病呈上升趋 势的原因。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种1型鸭甲肝病毒抗体竞争ELISA 检测方法，解决了目前种鸭和雏鸭体内的DHAV-1抗体效价及商品化DHAV-1 卵黄抗体效价难以评估的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种1型鸭甲肝病毒抗体竞争ELISA检测方法，包括以下步骤：

(1)单克隆抗体的制备：用纯化的全病毒对6周龄BALB/C小鼠进行3次 免疫，取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，采用纯化的VP1蛋白作 为包被抗原，通过间接ELISA的方法进行杂交瘤细胞的筛选，获得单克隆抗体；

(2)检测步骤：

A.抗原包被：VP1蛋白以100ng/孔包被酶标板，包被液采用批pH＝9.6的 碳酸盐缓冲液，4℃过夜作用；

B.洗涤：用含0.05％吐温-20的PBS或PBST作为洗涤液进行洗涤，在A 中的酶标板中加入PBST 200ul/孔，震荡洗涤3-5次，每次5min，甩干；

C.封闭：用含5％脱脂奶的PBST作为封闭液，每孔加入200μL，37℃封 闭2h；

D.重复B的步骤；

E.酶标抗体：酶标抗体进行1：320稀释后，与待检血清进行1∶20稀释 后，每孔加入100μL，37℃作用1h；

F.重复B的步骤；

G.TMB显色：每孔加入50μL TMB显色液，37℃避光显色5-15min，每孔 加2M H₂SO₄终止液50μL终止反应，测定反应各孔OD450nm值；

计算血清样品的抑制率，公式如下：抑制率(％)＝(酶标抗体OD值-样 本OD值)×100％/酶标抗体OD值；若PI≥15.21％时，血清为阳性；PI<15.21％ 时，则判定为阴性。

作为本发明优选地技术方案，所述步骤(1)中获得纯化的病毒包括以下步 骤：选毒力较强的DHAV-1，通过鸡胚接种进行大量扩增，再通过饱和硫酸铵和 密度梯度离心对扩增的病毒进行浓缩及纯化，紫外分光光度法测定蛋白浓度。

作为本发明优选地技术方案，所述步骤(1)中获得纯化的VP1蛋白包括以 下步骤：将原核重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，利用IPTG诱导表 达，对原核表达产物VP1蛋白通过SDS-PAGE电泳进行鉴定，表达的蛋白是以 包涵体的形式存在；大量诱导表达VP1蛋白，对表达的蛋白进行纯化，紫外分 光光度法测定蛋白浓度。

本发明的有益效果：

1、鸭肝炎病毒的VP1蛋白(外壳蛋白)是主要的宿主保护蛋白，编码主 要的抗原位点并具有主要的型特异性中和位点。本发明利用本实验室已经制备 的单克隆抗体进行酶标，以DHAV-1的VP1基因的原核表达蛋白作为包被抗原， 建立了竞争ELISA检测方法，用来检测种鸭及雏鸭体内的DHAV-1抗体水平， 为养鸭场更好的防治该病提供确实的技术支撑。利用建立的竞争ELISA检测方 法对商品化的DHAV-1卵黄抗体效价进行检测，以评价其预防和治疗该病的效 果，为卵黄抗体的正确选择和使用提供技术保证。

2、本发明的单抗竞争ELISA检测方法具有单克隆抗体的高度特异性和 ELISA试验的高敏感性，结果稳定性好，可以商品化和自动化，可以用肉眼判 定，在实际生产中推广应用的价值非常大。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述 的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它 实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种利用单克隆抗体初步建立一种DHAV-1抗体的竞争 ELISA检测方法。

①对单克隆抗体3B2进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。单抗经过常规的 辛酸硫酸铵法纯化后，用SDS-PAGE鉴定单抗的纯度。测定单抗的浓度后，采 用简易过碘酸钠法进行单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记。

②通过方阵试验确定抗原VP1蛋白的包被浓度和酶标抗体的最佳稀释浓 度，通过计算阳性血清和阴性血清的抑制率来确定检测血清的最佳稀释浓度。 利用建立的竞争ELISA方法对样品血清进行检测，确定该检测方法的临界值。 同时，对该检测方法的特异性进行了鉴定。最终确定：抗原包被浓度为100ng/ 孔；酶标抗体稀释倍数为1∶320，检测血清的最佳稀释度为1∶20；临界值为 15.21％，即PI(抑制率)≥15.21％时，血清为阳性；PI<15.21％时，则判定为阴 性。通过特异性试验检测，该方法的特异性良好。

该检测方法包括以下步骤：

(1)单克隆抗体的制备：用纯化的全病毒对6周龄BALB/C小鼠进行3次 免疫，取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，采用纯化的VP1蛋白作 为包被抗原，通过间接ELISA的方法进行杂交瘤细胞的筛选，获得单克隆抗体；

(2)检测步骤：

A.抗原包被：VP1蛋白以100ng/孔包被酶标板，包被液采用批pH＝9.6的 碳酸盐缓冲液，4℃过夜作用；包被缓冲液配制：1×碳酸盐缓冲液(100mL， pH＝9.6)：Na₂CO₃0.2756g，NaHCO₃0.6216g，用蒸馏水溶解并定容至100mL， pH值9.6，4℃保存；

B.洗涤：用含0.05％吐温-20的PBS或PBST作为洗涤液进行洗涤，在A 中的酶标板中加入PBST 200ul/孔，震荡洗涤3-5次，每次5min，甩干；PBS溶 液配制：NaCl 4.25g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.178g，Na₂HPO₄·12H₂O 1.386g，用蒸馏 水溶解并定容至500mL，pH值7.1-7.3；PBST稀释液的配制：每1L PBS加入 Tween-20 0.5mL，充分混匀；

C.封闭：用含5％脱脂奶的PBST作为封闭液，每孔加入200μL，37℃封 闭2h；PBST封闭液的配制：将5g脱脂奶溶解于100mL PBST稀释液中，短 期保存于4℃，长期保存于-20℃。

D.重复B的步骤；

E.酶标抗体：酶标抗体进行1：320稀释后，与待检血清进行1∶20稀释 后，每孔加入100μL，37℃作用1h；

F.重复B的步骤；

G.TMB显色：每孔加入50μL TMB显色液，37℃避光显色5-15min，每孔 加2M H₂SO₄终止液50μL终止反应，测定反应各孔OD_450nm值；

TMB显色液的配制：Buffer A：醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，H₂O₂(30％) 0.3mL，加超纯水定容至500mL。4℃保存；Buffer B：EDTA-Na 0.2g，柠檬酸 0.95g，甘油50mL，四甲基联苯胺(TMB)0.2g(用DMSO溶解为10mg/mL)， 加超纯水定容至500mL。4℃避光保存；使用时，将Buffer A和Buffer B以体积 比1：1的比例混合，现配现用；

2M H₂SO₄终止液的配制：将浓H₂SO₄以体积比1:8的比例加入蒸馏水中， 混匀冷却至室温即为2M硫酸溶液。

计算血清样品的抑制率，公式如下：抑制率(％)＝(酶标抗体OD值-样 本OD值)×100％/酶标抗体OD值；若PI≥15.21％时，血清为阳性；PI<15.21％ 时，则判定为阴性。

其中，步骤(1)中获得纯化的病毒包括以下步骤：选毒力较强的DHAV-1， 通过鸡胚接种进行大量扩增，再通过饱和硫酸铵和密度梯度离心对扩增的病毒 进行浓缩及纯化，紫外分光光度法测定蛋白浓度。

步骤(1)中获得纯化的VP1蛋白包括以下步骤：将原核重组表达质粒转化 到大肠杆菌BL21(DE3)中，利用IPTG诱导表达，对原核表达产物VP1蛋白通 过SDS-PAGE电泳进行鉴定，表达的蛋白是以包涵体的形式存在；大量诱导表 达VP1蛋白，对表达的蛋白进行纯化，紫外分光光度法测定蛋白浓度。

应用实施例1

种鸭血清的检测

利用该检测方法对某采集的20份种鸭血清，应用本试验建立的竞争ELISA， 进行了DHAV-1抗体的检测。检测结果为：20份血清的其抑制率为11.5-71.3％， 其中有几份血清的抑制率在临界值15.21％以下，并且检测结果整体上离散度较 大。我们建议该批种鸭立即加强免疫一次。免疫后14天，再次采集种鸭血清20 份进行检测，检测结果为：20份血清的抑制率为43.2-67.3％，均在临界值以上， 离散度明显变小。跟踪其商品代雏鸭，结果发现该鸭群的后代在该病的高发日 龄段内得到了很好的保护，没有出现发生该病。该种鸭场十分重视鸭肝炎的免 疫防控工作，一般开产后每隔两个月加强免疫一次，试图通过生产高母源抗体， 使后代雏鸭减少鸭肝炎的发病率。但在实际生产中效果并不十分明显。这说明 疫苗的免疫程序并不能仅靠经验，依靠科学的检测方法得到科学的数据是制定 科学的免疫程序的基础。

目前为止，我们建立的ELISA方法已在2个种鸭场进行了应用，通过检测抽 检鸭群的鸭肝炎抗体情况，来制定和改进免疫程序，均取得了良好的效果。

应用实施例2

商品化卵黄抗体的检测

我们采集了动物医院销售的三家正规厂家的鸭肝炎卵黄抗体，应用本试验建 立的竞争ELISA进行检测，结果其抑制率分别为43.8％、53.3％、55.2％。利用 这三种卵黄抗体进行了中和保护试验，结果显示卵黄抗体的保护率与竞争ELISA 的抑制率是一致的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。