一组用于干酪乳杆菌的实时荧光定量PCR检测的特异性引物和探针及检测试剂盒

摘要

本发明提供一组用于干酪乳杆菌的实时荧光定量PCR检测的特异性引物和探针，上游引物：LcpolA227F：5’-CCGCGTGATGAGGATATTTATG-3’；下游引物：LcpolA313R：5’-AGACTTGCGAGCAAACTGGC-3’；探针：LcpolA256P：5’-CGCCAAACGGCAAGTGCCAGA-3’；所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2。本发明还提供相应的定量PCR检测试剂盒。应用本发明的引物和探针以及本发明的试剂盒能够快速、准确、灵敏、特异性好的定量待测标本中干酪乳杆菌含量。

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测方法技术领域，具体涉及一组用于干酪乳杆菌的实时荧光定量PCR检测的特异性引物和探针及相应的定量PCR检测试剂盒。

背景技术

益生菌是一类有利于人体健康的活性微生物食品原料，目前常用的益生菌有嗜酸乳杆菌和双歧杆菌两大类，与干酪乳杆菌一起被称为“健康三益菌”，但国内目前对于干酪乳杆菌研究的不多。干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)能够耐受有机体的防御机制，其中包括口腔中的酶，胃液中低PH值和小肠的胆汁酸等，所以干酪乳杆菌进入人体后可以在肠道内大量存活，从而起到调节肠内菌落平衡、促进人体的消化吸收等作用。同时，干酪乳杆菌具有高效降胆固醇，并且能诱导产生抗菌素，促进细胞分裂，产生抗体免疫及抗癌等作用。干酪乳杆菌还具有缓解乳糖不耐症，增强人体免疫，缓解过敏，降低胆固醇以及预防癌症和抑制肿瘤生长等益生保健作用。因此检测干酪乳杆菌的含量对于检测干酪和乳酸菌中有益菌含量，增强机体免疫力至关重要。

乳杆菌种类多，表型相似，很难快速准确区分，传统的定量检测方法依靠特定的微生物培养基对食品中活菌进行分离和计数，测试过程需要进行培养基准备、平板培养、菌落计数、生化鉴定等步骤，所以整个检测显得复杂、费时，且准确率低。因此，迫切需要研究建立快速、准确、灵敏的检测新方法。实时荧光定量PCR技术以其较高的可重复性、灵敏性以及准确性在微生物定量以及乳酸菌定量研究领域得到广泛应用。

实时荧光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR)技术从常规PCR定性检测迈上量化的台阶，实现了PCR技术从定性到定量的飞跃，避免了传统PCR定量鉴定中交叉污染的问题，它相对常规PCR技术先进、操作简便，实现了实时监测、绝对定量和快速检测的目的，同时具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等优点，因此非常适合乳酸菌的检测。 采用乳杆菌种特异性、定量检测方法，可以简化益生菌的检测程序、提高检测效率，能提高我国益生菌的检测能力，完善保健食品的质量监管，并为益生菌产业的长远发展提供技术保障。

发明内容

本发明提供了一组用于干酪乳杆菌的实时荧光定量PCR检测的特异性引物和探针及相应的定量PCR检测试剂盒。能广泛应用于快速、灵敏、特异性好的检测干酪乳杆菌。

本发明提供一组用于干酪乳杆菌的实时荧光定量PCR检测的特异性引物和探针，探针采用Taqman探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下：

上游引物：5’-CCGCGTGATGAGGATATTTATG-3’

下游引物：5’-AGACTTGCGAGCAAACTGGC-3’

探针：5’-CGCCAAACGGCAAGTGCCAGA-3’；

所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2。

上述引物和探针的衍生序列也为本发明的保护范围，所述衍生序列包括引物序列的互补链序列，同时还可以向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。

优选地，所述探针的5’端荧光报告基团是FAM、TET、JOE、HEX或VIC，3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA、DABCYL或BHQ。

本发明还提供一种干酪乳杆菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针。

本发明的第三个目的是提供上述试剂盒在定量检测干酪乳杆菌含量中的应用。

优选地，所述应用为定量检测益生菌酸奶、干酪中干酪乳杆菌含量。

本发明的第四个目的是提供干酪乳杆菌的实时荧光定量PCR检测方法，步骤如下：

(1)制备标准品：将干酪乳杆菌polA保守基因片段插入到载体pMD18-T中，获得含有 polA保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述干酪乳杆菌polA保守基因片段参见序列表中SEQ ID No.1的第165-458位核苷酸序列；

(2)标准曲线绘制；

(3)使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品和标准品采用相同的反应体系进行实时荧光PCR扩增；

(4)通过标准曲线和待测样品的Ct值进行益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定量检测。

优选地，所述干酪乳杆菌polA保守基因片段是通过以下引物扩增得到的：

上游引物为5'-ATCCTGACGAAAACAGCAATGA-3'，

下游引物为5'-TTCAGTGCCCATAGCCTTCA-3'。

优选地，步骤(3)中所述引物和探针的用量均为1.0μl。

优选地，步骤(3)中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。

本发明提供用于对干酪乳杆菌进行定性、定量检测的引物和探针，可以通过提取待检测样品的DNA或者提取RNA将反转录得到的cDNA结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到快速、准确、灵敏、特异性好的定量待测标本中干酪乳杆菌含量的目的。本发明所提供的引物和探针可对乳制品和干酪中的干酪乳杆菌含量进行定性、定量分析，对判断乳制品及干酪中干酪乳杆菌的含量具有重要意义，本发明将在食品微生物检测领域发挥重要作用。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为引物和探针体系优化实验结果；其中，a代表上下游引物1.6μL，探针1.6μL；b代表上下游引物2μL，探针0.8μL；c代表上下游引物1.6μL，探针0.8μL；d代 表上下游引物1μL，探针1.6μL；e代表上下游引物2μL，探针1.6μL；f代表上下游引物2μL，探针1.0μL；g代表上下游引物1μL，探针0.8μL；h代表上下游引物1.6μL，探针1.0μL；i代表上下游引物1μL，探针1.0μL；

图2为灵敏度实验结果；其中，a代表质粒浓度为1.00×10⁸copies/ml、b代表质粒浓度为1.00×10⁷copies/ml、c代表质粒浓度为1.00×10⁶copies/ml、d代表质粒浓度为1.00×10⁵copies/ml、e代表质粒浓度为1.00×10⁴copies/ml、f代表质粒浓度为1.00×10³copies/ml、g代表质粒浓度为1.00×10²copies/ml；

图3为特异性实验结果，其中出现标准扩增曲线的为干酪乳杆菌质粒，未出现标准扩增曲线的为嗜热链球菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、保加利亚乳酸菌、嗜酸乳杆菌、卷曲乳酸菌、嗜酸乳酸菌、阴性对照；

图4为干酪乳杆菌标准曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用引物、探针和所用序列测定工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成和完成。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1  干酪乳杆菌(DNA polymerase Ⅰ gene)polA基因标准品的制备

要建立实时荧光定量PCR方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守、特异的序列，要保证反应的高特异性。polA基因序列具有高度的保守型，其特别功能区有丰富的半胱氨酸和四个独一无二的插入区，在DNA复制与修复中起重要的作用。polA基因检测干酪乳杆菌，有较高的敏感性和特异性。本部分主要采用PCR技术扩增干酪乳杆菌polA基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体pMD18-T中，构建出重组质粒pMD18-T-LcpolA，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。

一、模板DNA的制备

提取干酪乳杆菌(标准菌株)基因组DNA，用作polA基因PCR扩增的模板。步骤如下：

(1)取1ml菌悬液，8000r/min离心5分钟，弃上清液；

(2)加入10％蔗糖的TE缓冲液400μl悬浮菌液沉淀，混匀后加入20mg/ml的溶菌酶20μl，37℃作用45min；

(3)加入30μl 10％SDS和3μl 10mg/ml蛋白酶K，55℃水浴1h；

(4)加入500μl的酚/氯仿/异戊醇(体积比25:24:1)混匀，12000r/min离心10min；

(5)取上清，加入500μl的氯仿/异戊醇(体积比24:1)混匀，12000r/min离心10min；

(6)取上清，加入50μl 3M NaAc和800μl的无水乙醇，-20℃静置30min，离心去上清；

(7)沉淀用70％的乙醇洗涤，干燥；

(8)溶于50μl双蒸水中，-20℃保存。

二、polA基因片段的PCR扩增

1、引物的设计与合成

本发明通过对NCBI数据库中干酪乳杆菌polA全序列(参见序列表中SEQ ID No.1)进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列(序列表SEQ ID No.1中第165-458位核苷酸序列)为靶目标，应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针以及一组相关序列的外围引物。

干酪乳杆菌polA全序列如下： 

5’-CGATGTCACTTTGCTGACGCTGCCAGCGGTTAAACGGTGGCTGGAAGATGCCAAACGAGATCTGACAGTTTTTGATGGCAAACGAAACATCGTCGCCGCTAATCGACTCGGCGTGAAATTACCGGATATCGCTTTTGACGTGTTATTAGCGTCCTATTTGATTAATCCTGACGAAAACAGCAATGATTTG GGTAAAATCGCTGAAGATCACGATTATCATGACTTGCCGCGTGATGAGGATATTTATGGCAAAGGCGCCAAACGGCAAGTGCCAGAAGACGATAAGCTGTTTGGCCAGTTTGCTCGCAAGTCTAATGCTTTGTTCGCATTGCGGCCTGATTTGACTGGCGATTTGGAAAAGCAGGCCCAAACAGACTTATTCACTGATATGGAAATGCCGCTTTCTCGGGTTTTGGCAGAAATGGAAATTCAAGGGATTACCCTAAATGCTAAAACGCTGAAGGCTATGGGCACTGAATTCTCACAAAGCATCAAGATTTTGGAAGAGAAAATCTATGCAGAAGCTGGCGTGAAGTTCAATTTGAACTCACCAAAGCAGCTCGGCGAAATTCTTTTTGAAAAATTGAATCTGCCTGTGATCAAGAAAACGAAGACCGGTTACTCGACAAGCGTTGACGTGTTGAACGAATTGAAATCGGCAAGTCCGATTGTGCAGGACATTTTGGATTATCGCGGCTGGGCGAAATTAAATTCGACTTATGTTGTCGGCT-3’

该外围引物序列如下：

上游引物：LcpolA165F：5'-ATCCTGACGAAAACAGCAATGA-3'

下游引物：LcpolA459R：5'-TTCAGTGCCCATAGCCTTCA-3'

扩增片段即保守片段序列，大小为：314bp。

2、PCR反应体系和反应条件

以DNA为模板，以上述外围引物LcpolA165F/LcpolA459R为扩增引物，采用下述体系和反应条件进行PCR扩增。

PCR反应体系： 

其中引物采用LcpolA165F/LcpolA459R，Taq酶采用北京百泰克Power Taq Plus DNA Polymerse，PCR扩增仪为北京百泰克iCycling系列96梯度PCR仪。

扩增程序/反应条件： 

94℃预变性5min；94℃30s、60℃30s、72℃1min，35个循环；72℃10min，取3 μL扩增产物进行1％琼脂糖电泳，检测PCR产物大小，然后采用Axygen公司生产的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收剩余的PCR扩增产物。

三、重组质粒pMD18-T-LcpolA的构建和转化

1、连接反应：将上述纯化得到的PCR扩增产物与pMD18-T(大连宝生物公司)进行连接，采用如下连接体系进行配制：

配制完成后置于16℃进行过夜连接反应。

2、pMD18-T-LcpolA质粒的转化以及PCR鉴定

(1)从-70℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞，置于冰盒上使其自然解冻；

(2)取连接产物10μL加入50μL的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟；

(3)42℃水浴中热休克90秒，热休克后立即置冰上冷却2min；

(4)向1.5ml EP管中加入预冷的400μl的LB液体培养基(不含氨苄青霉素)混匀后，37℃200转/分钟轻摇培养1h；

(5)将上述培养液摇匀后取100μl涂布于含Amp、IPTG、X-gal的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜；

(6)次日观察，从平板上挑取白色单克隆菌落于100μL LB液体培养基(含氨苄青霉素)的PCR管中，37℃振荡培养2-3小时。吸取2μL作为模板进行PCR鉴定，剩余的菌液加入到20ml的LB液体培养基中进行扩摇。

(7)用载体通用引物RV-M/M13-47扩增上述稀释菌液，PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物大小鉴定阳性转化子。

引物RV-M/M13-47序列如下： 

引物RV-M:5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’

引物M13-47:5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’

PCR反应体系如下：

PCR扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、55℃30s、72℃1min，35个循环；72℃10min。

(8)采用Axygen公司生产的质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒，测定浓度和纯度，同时吸取一部分纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。

四、标准品的获取和定量

1、将步骤三得到的含有重组质粒pMD18-T-LcpolA的大肠杆菌DH5 α 100μL转种于5mL的LB液体培养基，37℃200rpm过夜摇培；

2、取1ml培养过夜的菌液转种于30ml LB液体培养基，200rpm增菌培养2-3小时，然后采用Axygen公司生产的质粒制备试剂盒提取质粒；

3、利用北京百泰克生物科技有限公司超微量紫外可见分光光度计(ND5000)对提取的质粒进行测定，测定A260、A280，根据A260/A280判断质粒的纯度；

4、质粒pMD18-T-LcpolA浓度(拷贝数)计算

(1)质粒的分子量＝3006bp×660(每对碱基的平均分子量)；

(2)测得质粒浓度为71.09ng/μl，质粒纯度A260/A280＝1.89，A260/A230＝1.93。因在进行实时荧光定量PCR时，需要以“拷贝数”为单位，因此需要将单位转换成copies/ml。

质粒copies/ml＝阿伏伽德罗常数×质粒摩尔数

其中阿伏伽德罗常数＝6.02×10²³copies/mol。

因此提取的质粒浓度copies/ml＝71.09×10^-9g/ml×6.02×10²³copies/mol÷(3006bp×660g/bp·mol)＝2.1×10¹⁰copies/mol

10μl质粒+11μl的无菌水就得到浓度为1.00×10¹⁰的质粒，再将该质粒进行10倍比稀释就可得到一系列浓度的质粒，并于-20℃保存备用。

实施例2  实时荧光定量PCR检测干酪乳杆菌方法的初步建立

一、特异性引物和探针的设计与合成

以上述选取的干酪乳杆菌的polA基因的保守片段序列为靶目标，应用Primer express3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针，探针采用Taqman探针。

作为本发明的核心，一组用于干酪乳杆菌实时荧光PCR检测的特异性引物和探针核苷酸序列如下：

上游引物：LcpolA227F：5’-CCGCGTGATGAGGATATTTATG-3’

下游引物：LcpolA313R:5’-AGACTTGCGAGCAAACTGGC-3’

探针：LcpolA256P:5’-CGCCAAACGGCAAGTGCCAGA-3’。

该引物和探针扩增的目标核苷酸序列为：

5’-CCGCGTGATGAGGATATTTATGGCAAAGGCGCCAAACGGCAAGTGCCAGAAGACGATAAGCTGTTTGGCCAGTTTGCTCGCAAGTCT-3’。

二、待测样本的制备

A、样本总RNA的制备

1).将组织放入研钵中，加入液氮磨碎，每50-100mg组织加入1ml Trizol，用匀浆器进行匀浆处理；

2).将匀浆样品在室温(15～30℃)放置5分钟，取澄清的匀浆液进行下一步操作；

3).每1ml Trizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟；

4).4℃，10000转/分钟离心15分钟，将水相转移到新管中，每1mlTrizol加入0.5ml异丙醇或者1ml冰乙醇，-80℃冰柜冻存或于-80℃冰柜冻存30分钟以上；

5).4℃10000转/分钟离心10分钟，弃去上清；

6).每1ml Trizol至少加1ml 75℅乙醇。4℃不超过7500转/分钟离心5分钟，弃上清；

7).室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，加入25～200μl无RNase的水，吹打混匀，55～60℃放置10分钟使RNA溶解，-70℃保存。

B、反转录扩增 

反转录体系及扩增条件：总mRNA(10pg-1μg)10μl,Oligo(dT)1μl 70℃变性10分钟，插入冰中冷却10分钟，加入dNTP 1μl，逆转录酶0.5μl，5×RT Buffer 0.5μl，PCR专用水7μl，42℃反应2小时。-20℃保存。

三、实时荧光定量PCR条件优化

以浓度为1.00×10⁶copies/ml的阳性质粒为模板，采用百泰克公司生产的2×real-time PCR Premixture(probe)实时荧光定量PCR试剂盒进行实验，实验采用的实时荧光定量PCR仪为上海枫岭生物技术有限公司生产的FTC-3000实时荧光定量PCR仪，优化步骤一提供的引物和探针的用量。反应体系采用20μl体系，引物和探针的量采用表1中的组合进行反应。

表1 PCR反应体系中引物和探针的用量

PCR反应条件：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。结果参照图1，数据显示20μl体系时，引物(5μM)和探针(5μM)分别加入1.0μl时，Ct值最小，荧光信号最强。

四、方法评估 

1、灵敏度实验 

将上述制备得到的质粒进行10倍比稀释得到一系列浓度的质粒，选取浓度为1.00×10⁸copies/ml、1.00×10⁷copies/ml、1.00×10⁶copies/ml、1.00×10⁵copies/ml、1.00×10⁴copies/ml、1.00×10³copies/ml、1.00×10²copies/ml等作为梯度模板。PCR反应体系如下：

PCR反应条件：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个 循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，结果参照图2。数据显示当质粒浓度达到1.00×10³copies/ml时依然有荧光信号，但质粒浓度达到1.00×10²copies/ml时未检测到荧光信号，因此本发明方法的灵敏度为1.00×10³copies/ml。

2、特异性实验 

为了证实本发明对干酪乳杆菌检测的特异性，我们选取了乳制品中的其它乳酸菌做特异性实验，选取的乳酸菌包括：嗜热链球菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、保加利亚乳酸菌、嗜酸乳杆菌、卷曲乳酸菌、嗜酸乳酸菌、鼠李糖乳杆菌。

该特异性实验包括用上述样本的基因组DNA和cDNA为模板进行的实验。上述乳酸菌的DNA提取均采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302-02)，RNA提取均采用百泰克RNApure高纯总RNA快速抽提试剂盒(RP1202),cDNA合成均采用百泰克Super RT Kit cDNA第一链合成试剂盒，采用百泰克公司生产的2×real-time PCR Premixture(probe)实时荧光定量PCR试剂盒进行实验，反应体系如下：

PCR反应条件：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，分析特异性。结果参考图3，具体结果不管以cDNA为模板还是以基因组DNA为模板仅干酪乳杆菌检测为阳性，其余乳酸菌均为阴性，表明本发明具有很好的特异性。检测结果参见表2。

表2特异性实验

3、标准曲线制备

以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到干酪乳杆菌的标准曲线，标准曲线方程为y＝36.9-3.0321x，作为待测样品定量测定的参照标准，结果参考图4。

4、待测样品的定量检测

以待测样品cDNA和标准品的DNA为模板，用干酪乳杆菌的特异性引物，以相同的体系同时进行干酪乳杆菌polA基因片段的荧光定量PCR扩增。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。

通过标准曲线和待测样品的Ct值进行益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定量检测。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以 对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

 

<110>  苏州百源基因技术有限公司

<120>  一组用于干酪乳杆菌的实时荧光定量PCR检测的引物和探针及相应的定量PCR检测试剂盒

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  731

<212>  DNA

<213>  干酪乳杆菌polA全序列

 

<400>  1

cgatgtcact ttgctgacgc tgccagcggt taaacggtgg ctggaagatg ccaaacgaga       60

 

tctgacagtt tttgatggca aacgaaacat cgtcgccgct aatcgactcg gcgtgaaatt      120

 

accggatatc gcttttgacg tgttattagc gtcctatttg attaatcctg acgaaaacag      180

 

caatgatttg ggtaaaatcg ctgaagatca cgattatcat gacttgccgc gtgatgagga      240

 

tatttatggc aaaggcgcca aacggcaagt gccagaagac gataagctgt ttggccagtt      300

 

tgctcgcaag tctaatgctt tgttcgcatt gcggcctgat ttgactggcg atttggaaaa      360

 

gcaggcccaa acagacttat tcactgatat ggaaatgccg ctttctcggg ttttggcaga      420

 

aatggaaatt caagggatta ccctaaatgc taaaacgctg aaggctatgg gcactgaatt      480

 

ctcacaaagc atcaagattt tggaagagaa aatctatgca gaagctggcg tgaagttcaa      540

 

tttgaactca ccaaagcagc tcggcgaaat tctttttgaa aaattgaatc tgcctgtgat      600

 

caagaaaacg aagaccggtt actcgacaag cgttgacgtg ttgaacgaat tgaaatcggc      660

 

aagtccgatt gtgcaggaca ttttggatta tcgcggctgg gcgaaattaa attcgactta      720

 

tgttgtcggct                                                            731

 

 

<210>  2

<211>  87

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ccgcgtgatg aggatattta tggcaaaggc gccaaacggc aagtgccaga agacgataag       60

 

ctgtttggcc agtttgctcg caagtct                                           87