用于体内诱导胰腺β细胞形成的方法和组合物

摘要

本发明的实施方案刺激三个水平的β细胞生理学：(i)葡萄糖代谢，(ii)膜受体功能，和(iii)转录因子，其导致胰腺中β细胞的体内形成以用于治疗糖尿病的目的。在某些方面，方法包括整合三个水平的细胞生理学：代谢、膜受体功能和基因转录。多个水平的细胞生理学的整合对β细胞形成产生协同效应。

说明书

说明书

优先权要求

本申请是非临时申请，且要求2012年7月31日提交的美国临时 申请61/678,077的优先权，将所述临时申请通过引用整体并入本文。

涉及的序列表

37CFR 1.821-1.825所要求的序列表与本申请一起电子提交。将 所述序列表通过引用并入本文。

背景

大多数医学药物治疗利用了化约法(reductionist approach)：一种 分子用于一种细胞病理生理学状况。尽管已证实化约法可成功地用于 单基因疾病，但其不能用于复杂的疾病。医生们已认识到需要组合的 方法来治疗复杂的病症例如1型或2型糖尿病。用于糖尿病的一种治 疗是胰岛素注射剂的施用，这追溯到1922年。然而，胰岛素注射剂在 许多1型和2型糖尿病患者中不阻止糖尿病并发症(例如，视网膜病 变、神经病、肾病、心血管疾病和中风)的发生。这些糖尿病并发症 的治疗费用是巨大的并且在很大程度上造成了糖尿病患者增加的医疗 保健费用。

尽管已在生物医学研究中取得了进展，但科学家和临床医师仍然 在寻找有效的用于糖尿病的治疗。在某些形式的糖尿病中，β细胞是 受到损坏、有缺陷或衰竭的。用于糖尿病的潜在治疗包括基于药物的 疗法和基于细胞的疗法，这两者都有其局限性。基于药物的疗法通常 仅治疗症状并且患者长期依赖于它们。基于细胞的疗法受累于细胞及 其来源的缺乏、免疫排斥和高的生产和配送成本。

基于细胞的疗法是治疗其中胰腺β细胞数量或β细胞功能的减小 是成因或促成性的糖尿病和其它病况的一种方法(D'Amour et al., Nature Biotech 24:1392-1401,2006；Kroon et al.,Nature Biotech  26:443-452,2008)。多组分混合剂是用于再生β细胞的胚胎前体的一种 方法，例如已将转录因子的混合剂用于干细胞研究(Eminli et  al.,Nature Genetics 41:968-976,2009)或最近已将病毒载体混合剂用于 小鼠中(Zhou et al.,Nature 455:627-632,2008)。一般而言，这些细胞 在其对葡萄糖的应答上是未发育完全的，并且尽管细胞包含并表达胰 岛素，但是它们不能在葡萄糖存在的情况下或响应葡萄糖浓度的变化 而分泌胰岛素。

因此，仍然存在对于治疗糖尿病的方法例如产生在受试者中体内 地表达和分泌胰岛素的β细胞的需要。

概述

本文描述的方法体外或体内地诱导胰腺β细胞形成。在某些方面， 所述方法在成体受试者中诱导胰腺β细胞形成而无需使细胞去分化以 重演胚胎途径。在其它方面，所述方法在处于不同分化阶段的细胞中 诱导胰腺β细胞形成。在其它方面，所述方法可用于体外诱导β细胞 形成。本文描述的方法的某些实施方案特异性靶向胰腺β细胞形成的 胚胎后诱导而不再现胰腺的胚胎形成过程－所述胚胎形成过程导致多 种胰腺内分泌细胞类型的产生。在成体受试者中体内地产生新的β细 胞的能力可为患有1型和2型糖尿病以及其它类型的糖尿病的患者的 治疗提供新型治疗方法。在成体受试者中增加胰腺β细胞的数量的能 力对于糖尿病可以是治疗性的、预防性的和/或治愈性的。

某些实施方案涉及调节和整合三个水平的β细胞生理学的组合物 和方法：(i)葡萄糖代谢，(ii)膜受体功能，和(iii)转录因子。在某些方 面，本文描述的方法靶向胰腺β细胞形成的胚胎后诱导过程。由于胚 胎过程导致多种内分泌细胞类型，故本文描述的胚胎后方法被设计来 主要地或仅诱导β细胞的形成。在某些方面，β细胞体外地或在器官 或组织例如胰腺中体内地形成而不引起可检测水平的其它内分泌细胞 类型(例如分泌胰高血糖素的α细胞或分泌生长抑素的δ细胞)的形 成。据本发明人所知，在现有技术水平中没有其中在成体受试者中体 内地诱导胰腺β细胞形成而不诱导其它胰腺内分泌细胞类型的报道。 这种在成体受试者中体内地产生β细胞的能力为患有1型和2型糖尿 病以及其它类型的糖尿病的患者的治疗提供了新型治疗方法。

某些实施方案采用基因转移方法来调节胰腺β细胞形成的细胞内 靶。其它实施方案使用模拟由基因转移方法学调节的细胞过程的治疗 剂。其它实施方案还使用基因转移和治疗剂的组合。

在某些方面，提供了葡糖激酶(GK)(GenBank Accession No. NP_034422.2(GI:31982798)或NP_000153.1(GI:4503951)，将其从本 申请的申请日起通过引用整体并入本文)、其功能性节段或变体或GK 活性的活化剂以增加葡萄糖代谢速率。还研究了从GK基因(参见 GenBank accession NG_008847.1，其通过引用并入本文)转录的其它 GK核酸的用途。在某些方面，还可使用保持GK酶活性的GK变体。 在其它方面，提供了蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTB1B)的抑制剂(例如 抑制性RNA、反义DNA、小分子抑制剂等)以增加酪氨酸激酶受体 或酪氨酸激酶相关受体活性。在其它方面，提供了Pdx-1(GenBank  Accession No.NP_000200(GI:4557673)，将其从本申请的申请日起通 过引用并入本文)、其功能性节段或变体或Pdx-1活性的活化剂以靶 向参与β细胞形成的基因。在某些方面，还可使用保持Pdx-1转录激 活能力的Pdx-1变体。还研究了从Pdx-1基因(参见GenBank accession  NG_008183)转录的其它Pdx-1核酸的用途。在某些方面，施用编码 目的蛋白的核酸。在其它方面，将每一种蛋白或抑制剂包含在单一的 和单独的表达盒或表达载体中。在其它方面，在单个表达盒或表达载 体中编码两种或更多种蛋白。

在某些方面，将β细胞诱导剂直接施用至胰腺。在某些方面，通 过胰管施用β细胞诱导组合物。在其它方面，口服地或血管内地施用 β细胞诱导剂。

在其它方面，将β细胞诱导剂体外地施用至细胞。在某一方面， 在体外治疗的细胞是对于正在治疗的受试者是异源的或自体的细胞。 在一个方面，从患者分离自体细胞，施用诱导剂，并随后将经体外治 疗的细胞植入患者。在其它方面，获得异源细胞，施用诱导剂，并随 后将经体外治疗的细胞植入患者。

在某些方面，器官、组织或细胞靶是可被诱导以感受葡萄糖水平 和分泌胰岛素的器官、组织或细胞。在某些方面，靶细胞或组织显示 诱导Glut2和/或葡糖激酶的表达、胰岛素原的表达和切割胰岛素原的 蛋白转化酶的表达的能力或被工程化用于所述蛋白的表达的能力。在 人体中存在具有至少两个β细胞特征的细胞。肠K细胞是这样的细胞 的一个实例。肠K细胞表达Glut2、葡糖激酶和蛋白转化酶，因此胰 岛素表达的诱导是需要的。在另一个实例中，肝细胞也表达Glut2和 葡糖激酶。

某些实施方案涉及从胚胎后胰腺细胞体内地诱导β细胞形成的方 法。在某些方面，方法包括给胰腺体内地提供下列试剂的组合：(i)增 加葡糖激酶(GK)水平或活性的第一试剂，(ii)增加酪氨酸受体激酶活性 的第二试剂，和(iii)增加Pdx-1介导的转录的第三试剂。

在某些方面，第一试剂是编码葡糖激酶的核酸。编码葡糖激酶的 核酸可被掺入病毒载体中。在某些方面，病毒载体是慢病毒载体或其 它的核酸递送载体或颗粒。核酸可在编码序列的3’包含转录后调节元 件，例如土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件(WPRE)。在某些实施方 案中，可将包含蛋白转导结构域的多肽施用至细胞或受试者。在某一 方面，将葡糖激酶提供为包含蛋白转导结构域的重组蛋白融合体。蛋 白转导结构域(PTD或细胞渗透蛋白(CPP)或膜易位序列(MTS))是 能够独立于经典的胞吞作用而将大得多的分子运送至细胞内的小肽。 许多已知的PTD在内化之前结合至相同的表面分子(硫酸乙酰肝素蛋 白多糖(HSPG))，并且该内化依赖于这些分子。在其它方面，第一试 剂可以是葡糖激酶的小分子活化剂。葡糖激酶的活化剂可包括但不限 于R1440、RO0281675、RO4389620(吡格列丁)、LY2121260、PSN-GK1 或GKA-50。

在某些方面，第二试剂是蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制剂。蛋白 酪氨酸磷酸酶1B抑制剂可以是蛋白酪氨酸激酶磷酸酶1B的shRNA 抑制剂。在某些方面，蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂可以是但不限于 Wyeth Research Inc.,32D；反义ISIS-PTP1BRX；Abbott Laboratories, Inc.,Isoxazole^TM；Abbott Laboratories,Inc.，被设计用于下调PTP1B 的表达的反义寡核苷酸；Merck Frosst Center for Therapeutic  Research，PTP1B化合物1和3的选择性抑制剂；Incyte Corporation, Inc.，(S)-异噻唑啉酮((S)-IZD)杂环磷酸酪氨酸；或Affymax,Inc.，基 于三芳基氨苯磺胺的PTP1B抑制剂。

在其它方面，第三试剂是β细胞选择性转录活化剂。在某些方面， 转录活化剂是编码Pdx-1的核酸。在某些方面，将转录活化剂作为具 有蛋白转导结构域的重组蛋白融合体施用至细胞或受试者。在某些方 面，可使用单独地或与NeuroD、Isl1、Nkx6.1和/或Pax4的一种或多 种组合使用的其它转录活化剂。在其它实施方案中，可提供化合物曲 格列酮来取代Pdx-1转录活化或与Pdx-1转录活化结合使用。

在某些方面，在单个组合物中提供第一、第二和第三试剂。在另 一个方面，分开地提供第一、第二和第三试剂。可几乎同时地或在1、 2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟或小时的施用窗口内施用所述试 剂。在某些实施方案中，连续地提供第一、第二和第三试剂。在其它 的实施方案中，同时地提供第一、第二和第三试剂。在某些实施方案 中，第一和第二试剂、第一和第三试剂、或第二和第三试剂是相同的 试剂。

在某些方面，通过至胰腺或其它靶器官或组织中的注射或输注来 提供第一、第二和第三试剂。在其它方面，至胰腺中的注射或输注是 通过胰管进行的。

其它实施方案包括治疗糖尿病的方法，所述方法包括：给胰腺或 其它器官或组织体内地提供包含上述试剂的治疗性组合物。在某些方 面，治疗性组合物包含(i)被配置为表达功能性葡糖激酶蛋白的葡糖激 酶表达盒，(ii)酪氨酸磷酸酶1B抑制剂，和(iii)被配置为表达功能性 Pdx-1蛋白的Pdx-1表达盒，其中胰腺β细胞被诱导。在其它实施方 案中，可将化合物曲格列酮与Pdx-1结合地提供。

某些实施方案包括治疗糖尿病的方法，所述方法包括：获得对于 患者是异源的靶细胞或从患者分离自体靶细胞，和给细胞体外地提供 包含上述试剂的治疗性组合物。在某些方面，治疗性组合物包含(i)被 配置为表达功能性葡糖激酶蛋白的葡糖激酶表达盒，(ii)酪氨酸磷酸酶 1B抑制剂，和(iii)被配置为表达功能性Pdx-1蛋白的Pdx-1表达盒， 其中胰腺β细胞被诱导。在其它实施方案中，可将化合物曲格列酮与 Pdx-1结合地提供。方法还包括将经治疗的靶细胞植入患者。

在某些方面，可使用一种、两种或更多种核酸(即基因)。在某 些方面，使用三种核酸。在其它方面，可将一种、两种或三种核酸与 一种或更多种化学剂组合。在其它方面，可在无核酸的情况下使用正 向或负向调节靶途径的化学剂。

在某些实施方案中，化学剂组合可包括但不限于：与PTB1B的 化学剂抑制剂和/或Pdx-1的化学剂活化剂组合的GK的化学剂活化 剂；或与PTB1B的化学剂抑制剂一起的Pdx-1的化学剂活化剂。

在某些实施方案中，可将核酸与化学剂组合使用。在某些方面， 可将GK基因、PTB1B抑制性核酸和/或Pdx-1活化核酸的一种或多 种与一种或多种化学剂PTB1B抑制剂、化学剂GK活化剂和/或化学 剂Pdx-1活化剂组合地使用。如本文中所用，基因可指编码治疗性核 酸例如编码GK酶的GK基因、编码抑制性核酸的PTB1B基因或编 码Pdx-1途径的活化剂的Pdx-1的核酸。

试剂的各种组合包括但不限于：化学剂GK活化剂+化学剂 PTP1B抑制剂；化学剂GK活化剂+化学剂PTP1B抑制剂+化学 剂Pdx-1活化剂；化学剂Pdx-1活化剂+化学剂PTP1B抑制剂；GK 基因+PTP1B基因；GK基因+化学剂PTP1B抑制剂；GK基因+ PTP1B基因+化学剂PTP1B抑制剂；GK基因+化学剂GK活化剂 +PTP1B基因；GK基因+化学剂GK活化剂+PTP1B基因+化学 剂PTP1B抑制剂；GK基因+化学剂GK活化剂+化学剂PTP1B 抑制剂；化学剂GK活化剂+PTP1B基因；化学剂GK活化剂+化 学剂PTP1B抑制剂；化学剂GK活化剂+PTP1B基因+化学剂 PTP1B抑制剂；GK基因+PTP1B基因+Pdx-1基因；GK基因+化 学剂GK活化剂+PTP1B基因+Pdx-1基因；GK基因+化学剂GK 活化剂+PTP1B基因+化学剂PTP1B抑制剂+Pdx-1基因；GK基 因+化学剂GK活化剂+PTP1B基因+化学剂PTP1B抑制剂+ Pdx-1基因+化学剂Pdx-1活化剂；GK基因+化学剂GK活化剂+ PTP1B基因+化学剂PTP1B抑制剂+化学剂Pdx-1活化剂；化学 剂GK活化剂+PTP1B基因+Pdx-1基因；化学剂GK活化剂+ PTP1B基因+化学剂PTP1B抑制剂+Pdx-1基因；化学剂GK活化 剂+PTP1B基因+化学剂PTP1B抑制剂+Pdx-1基因+化学剂 Pdx-1活化剂；化学剂GK活化剂+化学剂PTP1B抑制剂+化学剂 Pdx-1活化剂；化学剂GK活化剂+化学剂PTP1B抑制剂+化学剂 Pdx-1活化剂+PTP1B基因；GK基因+化学剂GK活化剂+化学 剂PTP1B抑制剂+化学剂Pdx-1活化剂；GK基因+化学剂GK活 化剂+化学剂PTP1B抑制剂+PTP1B基因；GK基因+化学剂GK 活化剂+化学剂PTP1B抑制剂+Pdx-1基因；Pdx-1基因+PTP1B 基因；Pdx-1基因+化学剂PTP1B抑制剂；化学剂Pdx-1活化剂+ PTP1B基因；化学剂GK活化剂+Pdx-1基因+化学剂PTP1B抑制 剂；化学剂Pdx-1活化剂+Pdx-1基因+PTP1B基因；化学剂Pdx-1 活化剂+Pdx-1基因+化学剂PTP1B抑制剂；PTP1B基因+化学 剂GK活化剂+化学剂Pdx-1活化剂；化学剂PTP1B抑制剂+ Pdx-1基因+GK基因；化学剂PTP1B抑制剂+Pdx-1基因+PTP1B 基因；化学剂PTP1B抑制剂+化学剂Pdx-1活化剂+GK基因；化 学剂PTP1B抑制剂+化学剂Pdx-1活化剂+PTP1B基因；化学剂 PTP1B抑制剂+化学剂GK活化剂+PTP1B基因；GK基因+化学 剂GK活化剂+Pdx-1基因+化学剂PTP1B抑制剂；化学剂GK活 化剂+Pdx-1基因+化学剂PTP1B抑制剂+PTP1B基因；GK基因 +Pdx-1基因+化学剂Pdx-1活化剂+PTP1B基因；GK基因+ Pdx-1基因+化学剂Pdx-1活化剂+化学剂PTP1B抑制剂；GK基 因+化学剂Pdx-1活化剂+PTP1B基因+化学剂PTP1B抑制剂； GK基因+化学剂GK活化剂+Pdx-1基因+化学剂Pdx-1活化剂 +PTP1B基因；GK基因+化学剂GK活化剂+Pdx-1基因+化学 剂Pdx-1活化剂+化学剂PTP1B抑制剂；GK基因+Pdx-1基因+ 化学剂Pdx-1活化剂+PTP1B基因+化学剂PTP1B抑制剂；Pdx-1 基因+化学剂Pdx-1活化剂+PTP1B基因+化学剂PTP1B抑制剂； 或Pdx-1基因+PTP1B基因+化学剂PTP1B抑制剂+GK基因。

在某些实施方案中，单一试剂可(i)正向调节葡糖激酶活性，和正 向调节酪氨酸激酶受体活性和/或酪氨酸激酶相关受体活性；(ii)正向调 节葡糖激酶活性，和正向调节β细胞特异性转录；或(iii)正向调节酪 氨酸激酶受体活性和/或酪氨酸激酶相关受体活性(例如抑制PTB1B)， 和正向调节β细胞特异性转录。

在某一方面，化学剂GK活化剂可在两个水平上起作用：增加葡 萄糖代谢速率和增加Pdx-1介导的基因表达。与化学剂GK活化剂组 合的化学剂PTB1B抑制剂可靶向本文描述的三条途径的每一条途径。

在某些方面，在疾病状态例如II型糖尿病中，化学剂PTP1B抑 制剂可在胰岛素存在的情况下作用于酪氨酸激酶受体水平和GK水 平。在某些方面，GK活化剂可增加葡萄糖代谢和Pdx-1介导的转录 活化。例如，罗格列酮增加GK的表达和Pdx-1介导的效应。与胰岛 素分泌能力(insulin secretion competence)结合的化学剂PTP1B抑制 剂可增加葡萄糖代谢和增加酪氨酸激酶受体活性。此外，PPAR-γ活 化剂(如罗格列酮)的家族增加GK表达和Pdx-1表达。因此，可施 用单一试剂来调节多个靶途径。

如本文中所用，“靶细胞”是指可被诱导形成β细胞或β细胞样细 胞的前体细胞、分离的细胞、干细胞、胰腺或其它器官或组织的细胞。 细胞在诱导前可以是β细胞或非β细胞。前体细胞是未完全分化的细 胞。

如本文中所用，“表达”是指mRNA水平(核酸表达)和/或蛋白 水平(蛋白表达)。可使用本领域中常规的技术来设计适合于检测 mRNA(例如使用RT-PCR)的寡核苷酸。可选择地或另外地，可使 用本领域公认的任何技术(例如任何基于抗体的检测技术)来评价蛋 白表达。

如本文中所用，当在治疗疾病或病症的治疗性策略的背景中使用 时，术语“治疗”意指其中疾病或病症的一个或多个症状得到改善或在 其它方面有利地改变的任何方式。如本文中所用，特定疾病或病症的 症状的改善是指可归因于本发明的组合物和方法的治疗或与其相关的 任何减轻，无论是持久的或暂时的、持续的或瞬时的。

如本文中所用，术语“有效量”和“有效以治疗”是指在一段时期内 使用(包括体内的急性或慢性施用和周期性或连续性施用)的本文描 述的一种或多种化合物或药物组合物的量或浓度，所述量或浓度在其 施用背景内对于引起期望的效应或生理学效果是有效的。

用于本发明的一种或多种化合物或药物组合物的有效量包括促进 β细胞形成或成熟(例如葡萄糖依赖性胰岛素分泌细胞的增加或细胞 的葡萄糖依赖性分泌的增加)的量。

术语“受试者”在整个说明书中用于描述对其提供根据本发明的方 法的治疗的动物、人或非人。在某些方面，受试者是人。

术语“提供”根据其通常含义“为使用而供应或供给”来使用。在一 些实施方案中，通过施用蛋白来直接提供蛋白质，而在其它实施方案 中，通过施用编码蛋白的核酸来提供蛋白质。在其它实施方案中，可 提供抑制剂例如shRNA来降低细胞中的蛋白水平。在某些方面，本 发明涉及包含治疗性核酸、肽和/或小分子的不同组合的组合物。

在整个本申请中，讨论了本发明的其它实施方案。关于本发明的 一个方面进行讨论的任何实施方案也适用于本发明的其它方面，反之 亦然。本文中描述的每个实施方案被理解为可适用于本发明的所有方 面的本发明的实施方案。可以预见的是，本文中讨论的任何实施方案 对于本发明的任何方法或组合物是可实现的，反之亦然。此外，本发 明的组合物和试剂盒可用于实现本发明的方法。

在权利要求书和/或说明书中，当与术语“包含”结合使用时，术语 “一个”或“一种”可意指“单独一个”，但其也可与“一个或多个”、“至少 一个”和“一个或多于一个”的意义相一致。

在整个本申请中，术语“约”用于指一个值包含用于测定该值的装 置或方法的误差的标准偏差。

权利要求书中使用的术语“或”用于意指“和/或”，除非明确指出仅 指备选物或备选物是相互排斥的，即使本公开内容支持仅指备选物和 “和/或”的定义。

如本说明书和权利要求书中所用，单词“包含”(以及任何形式的 包含，例如“包含的”和“包含着”)、“具有”(以及任何形式的具有， 例如“具有的”和“具有着”)、“包括”(以及任何形式的包括，例如“包 括的”和“包括着”)或“含有”(以及任何形式的含有，例如“含有的” 和“含有着”)是包含性或开放性的并且不排除其它的成分或方法步骤。

本发明的其它客体、特征和有利方面将在下文详细描述的基础上 是明显的。然而应理解，当显示本发明的具体实施方案时，详细的描 述和具体的实施例仅是以举例说明的方式给出的，因为在该详细描述 的基础上，在本发明的精神和范围内的各种改变和修饰将对于本领域 技术人员是明显的。

附图描述

下述附图形成本说明书的部分并被包含用于进一步显示本发明的 某些方面。通过将这些附图的一个或多个与本文给出的说明书的详细 描述相结合，可更好地理解本发明。

图1：使用包含三种分子的诱导混合剂来体内诱导成体胰腺中的 胰腺β细胞形成的方法的实例。

图2A-2C：显示慢病毒构建体的设计和验证，(A)葡糖激酶，(B) Pdx-1，和(C)shRNA PTP1B。

图3：在体内通过CNIP混合剂(Lenti-GCK+Lenti-Pdx-1和 Lenti-shRNA PTP1B)的PDX-1和GK的过表达和PTP1B表达的抑 制。

图4：相较于注射安慰剂混合剂的对照组，在注射β细胞形成混 合剂的小鼠的成体胰腺组织中单个β细胞染色的定量。

图5：相较于注射安慰剂的对照成体小鼠组，包含三种分子(GK、 PTP1B抑制剂和Pdx-1)的β细胞形成混合剂在成体小鼠胰腺中诱导 的增殖的实例。

图6：相较于注射安慰剂的对照成体小鼠组，在注射β细胞形成 混合剂(GK、PTP1B抑制剂和Pdx-1)的成体小鼠中，胰腺β细胞 量显著增加。使用共聚焦显微镜检查术来捕获胰岛素染色的免疫荧光 图像。使用Image J(NIH,Bethesda MD)来定量β细胞和总的胰腺面 积。将总β细胞量计算为表达为胰腺总面积的百分比的总β细胞面积。

图7：显示相较于注射安慰剂的对照成体小鼠组，在注射β细胞 形成混合剂的成体小鼠组中胰腺中β细胞群集的数量(群集密度)。 将群集密度测定为除以胰腺总面积的β细胞群集的数量。

图8：显示相较于注射安慰剂的成体小鼠对照组，注射β细胞形 成混合剂(GK、PTP1B抑制剂和Pdx-1)的成体小鼠组中的空腹血浆 胰岛素浓度。

图9：在混合剂(Lenti-GCK+Lenti-Pdx-1+Lenti-shRNA  PTP1B)的注射或通过两种分子或每种分子单独的注射后4周，胰岛 和外分泌组织中的增殖的BrdU标记。此图代表在间隔200μm的十个 截面/动物(在每组中，n＝3～4)中进行检查的胰腺区域。结果表达为 BrdU标记的细胞数量相较于对照的倍数增加。将共聚焦激光显微镜 检查术用于分析。Lenti＝慢病毒；GCK＝葡糖激酶；PTP1B＝蛋白酪氨 酸磷酸酶1B。数据显示为平均值±SE。*＝p<0.001CNIP混合剂相对于 对照；■＝p<0.05CNIP混合剂相对于[GK+PTP1B]；#＝p<0.01[GK +PTP1B]相对于对照。

图10：在用混合剂CNIP(Lenti-GCK+Lenti-Pdx-1+ Lenti-shRNA PTP1B)或通过两种分子或每种分子单独地进行注射后 4周，相较于混合剂对照和彼此的β细胞量(在每组中，n＝3～4)。 使用Image J(NIH,Bethesda,USA)来测量每个截面的总胰腺面积和 胰岛素阳性染色面积。将β细胞量计算为所有截面的总胰岛素阳性面 积对总胰腺面积的比率再乘以胰腺组织湿重。此图代表在间隔200μm 的十个截面/动物中进行检查的胰腺区域。将共聚焦激光显微镜检查术 用于分析。Lenti＝慢病毒；GCK＝葡糖激酶；PTP1B＝蛋白酪氨酸磷酸 酶1B。*＝p<0.001＝CNIP混合剂相对于对照；p<0.001CNIP混合剂 相对于[GK+Pdx-1]；p<0.001CNIP混合剂相对于[PTP1B+Pdx-1]； ■＝p<0.05CNIP混合剂相对于[GK+PTP1B]。#＝p<0.05[GK+ PTPIB]相对于[PTP1B+Pdx-1)；p<0.05[GK+PTP1B]相对于对照。 数据显示为平均值±SE。

详述

本文描述的某些方法代表了与一种分子对应于一种细胞控制过程 的科学理论相悖的概念。在某些方面，方法包括三个水平的细胞生理学 的整合：代谢、膜受体功能和基因转录。多个水平的细胞生理学的整合 对β细胞形成产生协同效应。协同作用需要多种分子一同起作用以产生 比这些分子的单独效应的总和更大的效应。通过使用本文描述的协同方 法，本发明人已成功地在成体胰腺中诱导胰腺β细胞形成。在成体动物 和人中体内地产生β细胞的能力为患有1型和2型糖尿病的受试者的治 疗提供了新型的治疗方法。

Ⅰ.治疗糖尿病的方法

本发明人已显示，通过利用“细胞网络整合与加工”(CNIP)，可 在成体受试者中体内地增加胰腺β细胞形成。根据CNIP方法，本发明 人在三个主要的水平上干预细胞加工：(1)第一，在细胞内碳水化合 物代谢的水平上，(2)第二，在膜受体功能的水平上，(3)第三，在 基因表达的水平上。通过靶向所有三个水平，可产生诱导β细胞形成的 协同相互作用。本发明人将该方法的一个实例称为“Syner-Ⅲ”，Syner 是希腊名称“协同作用(synergos)”的前缀，Ⅲ是罗马数字3。

CNIP方法被设计来模拟成体受试者中β细胞的形成并不在胚胎发 育的阶段对细胞进行重编程。本发明人注意到，在干细胞研究中或在最 近的在小鼠模型中使用的病毒载体混合剂(Zhou et al.,Nature 455: 627-32,2008)中使用的转录因子混合剂被用于通过再现发育的胚胎阶段 来产生β细胞。相比之下，CNIP方法被设计来在成体状态中起作用并 利用整合三个水平的细胞调节的机制来诱导β细胞形成。

本文描述的方法体内地诱导成体受试者中的胰腺β细胞形成而无需 使细胞去分化以重演胚胎途径。CNIP方法特异性地靶向胰腺β细胞形 成的胚胎后诱导而不再现胰腺的胚胎形成过程—该胚胎形成过程导致 多种胰腺内分泌细胞类型的产生。在成体受试者中体内地产生新的β细 胞的能力可为患有1型和2型糖尿病以及其他类型的糖尿病的患者的治 疗提供新型治疗方法。在成体受试者中增加胰腺β细胞数量的能力对于 糖尿病可以是治疗性的、预防性的和/或治愈性的。

在某些实施方案中，本文描述的组合物和方法可应用于胰腺以外的 组织。在某些方面，本文描述的组合物可被递送至肠内分泌K细胞中并 能够形成胰岛素样β细胞，所述胰岛素样β细胞会响应血糖的升高而分 泌胰岛素。在其他方面，本文描述的组合物可被递送至肝以诱导响应葡 萄糖的β细胞的形成。在其他方面，可在干细胞分化和/或去分化的最后 步骤处应用本文描述的组合物以形成β细胞。在某些方面，本文描述的 组合物可被递送至体内的多种细胞和/或组织以形成β细胞并因此不限 于本文描述的具体实施例。

在某些实施方案中，体外地治疗靶细胞。靶细胞是具有或可被诱导 以具有形成β细胞的能力的那些细胞。提供或获得这样的靶细胞的方法 在本领域是已知的，并且包括提供包含靶细胞的组织并通过本领域已知 的方法(例如在细胞表面特异性抗体的帮助下并使用FACS(细胞分选 仪))分离靶细胞或在允许靶细胞生长的特定条件下培养细胞。在某些 方面，存在适当的靶细胞系(Lieber et al.,Int J Cancer 15(5):741-47, 1975)。

任何能够分化成胰腺β细胞的细胞可用作本发明的方法的靶细胞。 这包括来源于人或动物(例如哺乳动物)组织的前体细胞。在某些实施 方案中，靶细胞是自体靶细胞，即其包含与被治疗的受试者的细胞相同 的遗传信息。在某些方面，靶细胞在施用治疗之前未被遗传修饰。在某 些方面，靶细胞选自胰腺前体细胞、小肠前体细胞、肝前体细胞、来源 于胰管群体的前体细胞、神经内分泌细胞的前体和胰腺干细胞。这包括 所有来自人或动物组织的体细胞分化的细胞。在某些方面，靶细胞选自 来自肝的体细胞分化的细胞、内分泌肠道细胞、胰管细胞、外分泌和内 分泌胰腺细胞和神经内分泌细胞。

在已获得或提供了靶细胞之后，可在体外细胞培养系统中生长和操 作细胞，所述体外细胞培养系统包括标准的细胞培养系统例如组织培养 皿以及6孔、24孔或96孔板。培养条件将取决于靶细胞，并且本领域 技术人员将知道如何培养这些细胞。

A.葡萄糖代谢

葡萄糖代谢是CNIP方法诱导成体胰腺或其他器官或组织中的β细 胞形成的第一方面。葡萄糖是哺乳动物细胞利用的主要能量来源，葡萄 糖的代谢为细胞的功能和增殖提供能量(Bohnsack and Hirschi,Annu  Rev Nutr.24:433-453,2004)。糖酵解的抑制阻止细胞周期进程，从而 证明了葡萄糖代谢对诱导增殖的必要性(Newcomb et al.,Eukaryot.Cell. 2:143-149,2003)。体内地诱导胰腺β细胞形成的因素包括葡萄糖代谢 的增加(Bernard et al.,FASEB J.13:1195-1205,1999；Alonso et al., Diabetes 56:1792-1801,2007)。在成体大鼠中仅24h的葡萄糖输注就使 得β细胞数量增加～50％(Bernard et al.,FASEB J.13:1195-1205, 1999)。此外，葡萄糖通过体外地抑制组成型凋亡程序而促进β细胞存 活(Hoorens et al.,J.Clin.Invest.98:1568-1574,1996)。葡萄糖代谢使 胰腺做好准备以诱导胰腺β细胞形成。

在某些方面，通过提供编码葡糖激酶的核酸或增加葡糖激酶或其它 酶或调节因子的活性来增加葡萄糖代谢的速率。在某些实施方案中，归 因于本文描述的核酸的功能可通过施用增加葡萄糖代谢的各种化学化 合物或小分子来提供。葡糖激酶活化化合物包括但不限于Roche Inc., 化合物R1440；Hoffman-La Roche Inc.,化合物RO0281675； Hoffman-La Roche Inc.,化合物RO4389620(吡格列丁)；Eli Lilly Inc., 化合物LY2121260；OSI Pharmaceuticals,Inc.,化合物PSN-GK1； Astra-Zeneca,Inc.,化合物GKA-50；Pfizer Inc.,描述于国际专利公开 WO/2007122482中的葡糖激酶活化剂；Merck-Banyu Inc.,描述于国际 专利公开WO/2003080585中的葡糖激酶活化剂；Takeda Inc.,描述于国 际专利公开WO/200710434中的葡糖激酶活化剂；Johnson&Johnson  Inc.,描述于国际专利公开WO/2007075847中的葡糖激酶活化剂等。

B.受体酪氨酸激酶和酪氨酸激酶相关受体。

膜受体酪氨酸激酶和/或酪氨酸激酶相关受体是CNIP方法诱导成 体受试者中的胰腺β细胞形成的第二组分。在生理刺激后产生胰腺β细 胞的第二方面是细胞通过其膜受体接收信息。负责刺激胰腺β细胞量的 膜受体来自酪氨酸激酶家族受体和酪氨酸激酶相关家族受体。在妊娠期 间，胰腺β细胞量响应胰岛素抗性的发生和增加的胚胎/胎盘能量需要而 增加，此效应由增加的催乳素、雌激素和胎盘催乳激素分泌介导(Heit et  al.,Annu.Rev Cell Dev.Biol.22:311-338,2006)。β细胞通过增加其胰岛 素分泌来进行补偿的失败导致产生妊娠糖尿病。在进行尸体解剖的怀孕 人体中已观察到胰岛增大和β细胞增生(Van Assche et al.,Br.J.Obstet  Gynaecol 85:818-820,1978)。妊娠期间增加胰腺β细胞量的激素刺激(催 乳素、雌激素和胎盘催乳激素)通过酪氨酸激酶相关受体起作用(Nielsen  et al.,Diabetes 50(Suppl.1):S25-S29,2001)。其它增加β细胞量的激素 也通过酪氨酸激酶家族的受体起作用，这些激素包括肝细胞生长因子、 血小板源生长因子、生长激素、胰岛素、IGF-1和EGF(Nielsen et al., Diabetes 50(Suppl.1):S25-S29,2001)。值得注意的是，这些激素对β细 胞量的效应还依赖于葡萄糖代谢。在不存在葡萄糖的情况下，激素通过 酪氨酸激酶家族起作用以增加胰腺β细胞量的能力丢失(Cousin et al., Biochem.J.344:649-658,1999)。因此，CNIP方法将葡萄糖代谢的效应 与膜酪氨酸激酶和/或酪氨酸激酶相关受体组合以诱导成体胰腺中的β 细胞形成。

在某些实施方案中，归因于本文描述的核酸的功能可通过施用增加 酪氨酸激酶受体和/或酪氨酸激酶相关受体活性的各种化学化合物或小 分子来提供以用于成体胰腺中的β细胞形成。在某些方面，可使用抑制 性核酸例如反义DNA或抑制性RNA分子。这样的化合物包括但不限于 PTP1B抑制剂化合物例如Wyeth Research Inc.,32D；反义 ISIS-PTP1BRX；Abbott Laboratories,Inc.,异唑；Abbott  Laboratories,Inc.，被设计用于下调PTP1B的表达的反义寡核苷酸； Merck Frosst Center for Therapeutic Research，PTP1B化合物1和3 的选择性抑制剂；Incyte Corporation,Inc.，(S)-异噻唑啉酮((S)-IZD) 杂环磷酸酪氨酸；Affymax,Inc.，基于三芳基氨苯磺胺的PTP1B抑制 剂等。

可包括单独的或与shRNA PTP1B组合的靶向酪氨酸磷酸酶家族蛋 白的其它shRNA。PTP1B作用于大部分牵涉成体胰腺中的胰腺β细胞 功能的酪氨酸激酶家族的受体。然而，已显示T细胞蛋白酪氨酸磷酸酶 (TCPTP)和SHP-2(两个其它的细胞内蛋白磷酸酶成员)靶向牵涉胰 岛素信号转导的受体酪氨酸激酶(Tonks,Nat Rev.Mol Cell Biol 7:833-46, 2006)。SHP-2(含SH2结构域的磷酸酶-2)是广泛地表达的包含两个氨 基末端Src同源2(SH2)结构域的细胞内蛋白酪氨酸磷酸酶。SH2-2 与酪氨酸-磷酸化的胰岛素受体和IRS-1结合。TCPTP以两种形式存在： 内质网-靶向的48-kDa形式(TC48)和核45-kDa形式(TC45)。已显 示TC-PTP负向调节胰岛素信号转导和催乳素受体(Aoki and Matsuda, J.Biol.Chem.275:39718-26,2000；Tonks,Nat Rev.Mol Cell Biol 7:833-46, 2006)。因此，表达shRNA-SHP-2和shRNA-TC-PTP的核酸可用于本 文描述的方法和组合物。

C.β细胞特异性转录

CNIP方法的第三方面涉及基因表达水平并牵涉转录激活因子或转 录因子，其用作吸引子以汇聚和集中葡萄糖代谢效应和由葡糖激酶产生 的代谢/分子效应以及酪氨酸激酶受体和酪氨酸激酶相关受体以在成体 胰腺中形成β细胞。术语“转录”是指将基因的DNA序列拷贝至RNA产 物中的过程，其通常通过DNA指向的RNA聚合酶使用DNA作为模板 来进行。每个系统都具有调制吸引子(modulator attractor)，如同物 理学中。在混沌系统中，网络终点的方向将跟随吸引子的力。简单化地 说，抛射体的撞击目标将取决于与空气阻力和抛射体的重力效应相结合 的推进初始力。初始力、空气阻力和重力将协同地作为确定抛射体的最 终目的地的吸引子。活生物体是非线性的动态系统，其以“混沌”状态存 在。在转录水平上，一组基因的表达保持不变，这些基因被称作“管家” 基因。它们执行细胞的常规功能，然而其它基因类别则响应于环境刺激 表达。在胰腺β细胞适应生理应激的过程中，基因表达的上调对于胰腺 β细胞形成的诱导是必需的(Bouwens and Rooman,Physiol Rev  85:1255-1270,2005)。对于生理应激的该适应性应答在基因表达水平上 的关键介导牵涉转录因子形式的模块化吸引子(modular attractor)的 活化(Albert and Barabasi,Rev Mod Physics 74:47-97,2002；Albert and  Othmer,J Theor Biol 223,1-18,2003)。因此，CNIP方法包括转录因子 (作为模块化吸引子)，其涉及在成体胰腺中响应生理应激的β细胞形 成。

可将单独的Pdx-1过表达与其他TF的协同性汇聚力一起使用来引 导CNIP基因表达模式以诱导胰腺β细胞形成。因此，牵涉成体胰腺β 细胞形成并可体内地增加Pdx-1对β细胞形成的效应的其它TF可用于 本文所述的方法。在某些方面，可使用牵涉β细胞形成的TF。可排除 牵涉其它内分泌细胞形成的TF。与Pdx-1组合或替代Pdx-1添加的牵 涉后发育期中胰腺β细胞形成的TF包括：NeuroD、Isl1、Nkx6.1和 Pax4。还可将抗糖尿病化合物例如抗糖尿病噻唑烷二酮类(例如曲格列 酮)与TF结合使用以增加β细胞形成。例如，曲格列酮通过Pdx-1启 动子中的功能性过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)反应元件增加 小鼠胰岛中的Pdx-1表达(Gupta et al.,J Biol Chem.283(47):32462-70, 2008)。还涉及通过Pdx-1基因启动子中的PPARγ反应元件的正向调节 诱导Pdx-1。

D.治疗性组合物

在某些方面，可将本文描述的1种、2种、3种或更多种治疗性部 分组合在一个或多个组合物中或将其组合地施用。在一个方面，将一种 或多种治疗性部分提供为1个、2个、3个或更多个核酸递送载体和/或 治疗剂的混合剂。可如本文中所述口服地、局部地或全身性地施用这样 的混合剂。

在其它方面，可连接2种、3种或更多种治疗性部分以产生二价、 三价或四价组合物。可如本文中所述口服地、局部地或全身性地施用这 样的组合物。在某些方面，口服施用这样的组合物。在其他方面，局部 注射或输注所述组合物。

在其它方面，可通过化学接头系统将1种、2种、3种或更多种治 疗性部分连接在一个分子中。可如本文中所述口服地、局部地或全身性 地施用这样的组合物。

Ⅱ.核酸组合物

术语“核酸载体”用于指其中可插入核酸序列以用于引入细胞的载 体核酸分子，在所述细胞中所述核酸序列可被复制、转录和/或翻译(即 被表达)。核酸序列可以是“外源的”，这意指所述核酸序列对于其中引 入载体的细胞来说是外来的或者所述序列对于所述细胞是“内源的”但 位于宿主细胞内该序列非通常发现于的位置。在某些方面，外源载体可 编码内源核酸。核酸载体包括质粒、粘粒、病毒基因组以及其它表达载 体(噬菌体、动物病毒和植物病毒)、人工染色体(例如YAC)等。 在本公开内容的基础上，本领域技术人员能够容易地通过标准重组技术 构建载体(参见例如，Maniatis et al.,Molecular Cloning:A laboratory  Manual.Cold Spring Harbor Laboratory,New York.,1989；Ausubel  et al.,Current Protocols in Molecular Biology,New York City,NY,John  Wiley&Sons,Inc.,1994,将其通过引用并入本文)。

术语“表达载体”是指包含编码能够被转录的RNA的核酸的任何类 型的遗传构建体。在一些情况下，RNA分子随后被翻译成蛋白质、多 肽或肽。在其它情况下，例如在抑制性RNA、反义分子或核糖酶的产 生中，这些序列不被翻译。表达载体可包含多种“控制序列”，其是指这 样的核酸序列：其对于可操作地连接的编码序列在特定宿主细胞中的转 录和可能的翻译是必需的。除了支配转录和翻译的控制序列，载体和表 达载体可包含还具有其它功能并描述于本文中的核酸序列。

某些方面涉及使用编码β细胞诱导性组分的核酸。核酸的实例包括 提供于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4中的GK；提供于SEQ ID NO:2 中的PTB1B shRNA；和提供于SEQ ID NO:3中的Pdx-1；或本领域技 术人员认可的等同物。在某些方面，核酸包括与SEQ ID NO:1、2、3 和/或4具有80、85、90、95、98或100％同一性的核苷酸序列。在某 些实施方案中，本发明的核酸编码与SEQ ID NO:5(GK)或SEQ ID  NO:6(Pdx-1)的蛋白具有80、85、90、95、98或100％同一性并且保持 适当活性的蛋白。

考虑到几种不同的密码子能够编码单一氨基酸，故序列可以被改变 而仍然编码相同的蛋白或多肽。还可根据用于表达的具体生物体进行密 码子选择的最优化。

A.启动子和增强子

“启动子”是一种控制序列，其是控制转录的起始和速率的核酸序列 区域。其可包含遗传元件，在该遗传元件上可结合调节性蛋白质和分子 (例如RNA聚合酶和其它转录因子)以起始核酸序列的特异性转录。 短语“有效地位于”、“有效地连接”、“在控制之下”和“在转录控制之下” 意指启动子相对于核酸序列处于正确的功能性位置和/或方向以控制该 序列的转录起始和/或表达。

启动子通常包含用于定位RNA合成的起始位点的序列。另外的启 动子元件调节转录起始的频率。通常地，这些位于离起始位点上游 30-110的区域，尽管已显示许多启动子也包含起始位点下游的功能性元 件。为了使得编码序列在启动子的“控制之下”，将转录阅读框的转录起 始位点的5’末端定位于所选择的启动子的“下游”(即3’端)。“上游” 启动子刺激DNA的转录并促进RNA的表达。启动子元件之间的间隔通 常是可变的，以便当元件相对于彼此反转或移动时，启动子功能得到维 持。取决于启动子，看起来个体元件可协同地或独立地发挥功能以激活 转录。可以或不可以将启动子与“增强子”结合使用，所述“增强子”是指 参与核酸序列的转录活化的顺式作用调节序列。

启动子可以是与核酸序列天然相关的序列，如可通过分离位于编码 区段和/或外显子上游的5’非编码序列所获得的。这样的启动子可被称 作是“内源的”或“同源的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然相关 的位于该序列的下游或上游的序列。可选择地，通过将核酸定位于重组 的、外源的或异源的启动子(其是指在天然环境下通常不与核酸序列相 关的启动子)的控制之下将获得某些优势。重组的或异源的增强子还指 在天然环境下通常不与核酸序列相关的增强子。这样的启动子或增强子 可包括其它基因的启动子或增强子和分离自另一种病毒或原核或真核 细胞的启动子或增强子，以及非“天然存在”(即包含不同转录调节区 的不同元件和/或改变表达的突变)的启动子或增强子。

自然地，采用有效指导DNA区段在选择用于表达的细胞器、细胞、 组织、器官或生物体中进行表达的启动子和/或增强子将是重要的。分子 生物学领域的普通技术人员通常知晓启动子、增强子和用于蛋白表达的 细胞类型组合的使用(参见例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning:A  Laboratory Manual,vol.I.2nd edition.Cold Spring Harbor Laboratory  Press,1989,将其通过引用并入本文)。所采用的启动子可以是组成型的、 组织特异性的、诱导型的和/或在适当条件下可用于指导所引入的DNA 区段的高水平表达，例如在重组蛋白和/或肽的大规模生产中是有利的。 启动子可以是异源的或内源的。

还可另外地使用任何启动子/增强子组合(按照例如真核生物启动子 数据库EPDB,www.epd.isb-sib.ch/)来驱动表达。使用T3、T7或SP6 胞质表达系统是另一种可能的实施方案。真核细胞可支持来自某些细菌 启动子的胞质转录，如果提供适当的细菌聚合酶(作为递送复合物的部 分或作为另外的遗传表达构建体)的话。

在某些方面，本发明的核酸可包括将在胰腺组织中特异性表达的非 诱导型或诱导型启动子。这样的非诱导型启动子包括来自胰岛素基因、 胰高血糖素基因、淀粉酶基因等的组织特异性胰腺启动子。这样的诱导 型启动子包括在葡萄糖反应元件控制之下的胰腺特异性启动子或在可 由化学物质、肽、配体或代谢产物诱导的反应元件控制之下的胰腺特异 性启动子。

B.起始信号

还可能需要特异性起始信号来有效翻译编码序列。这些信号包括 ATG起始密码子或相邻的序列。可需要提供外源翻译控制信号，包括 ATG起始密码子。本领域技术人员能够容易地确定此并提供必需的信 号。已公知起始密码子必须与所期望的编码序列的阅读框是“在框内”的 以确保整个插入物的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然 的或人工的。表达的效率可通过包含适当的转录增强子元件来增加。

C.多克隆位点

载体可包括多克隆位点(MCS)，所述MCS是包含多个限制性内 切酶位点的核酸区域，任何所述限制性内切酶位点均可与标准重组技术 结合使用以消化载体。“限制性内切酶消化”是指用仅在核酸分子中的特 定位置上起作用的酶来催化核酸分子的断裂。许多这些限制性内切酶是 可商购获得的。这样的酶的使用是本领域技术人员所广泛理解的。通常， 使用在MCS内进行切割的限制性内切酶来使载体线性化或片段化以使 得外源序列能够连接至载体。“连接”是指在两个核酸片段之间形成磷酸 二酯键的过程，所述两个核酸片段可以或不可以是彼此连续的。涉及限 制性内切酶和连接反应的技术对于重组技术领域的普通技术人员而言 是公知的。

D.终止信号

本发明的载体或构建体将一般包含至少一个终止信号。“终止信号” 或“终止子”包括牵涉RNA转录物通过RNA聚合酶的特异性终止的 DNA序列。因此，在某些实施方案中，涉及终止RNA转录物的产生的 终止信号。在体内终止子对于实现期望的信息水平可以是必需的。

可用于本发明的终止子包括任何已知的本文所述的或本领域技术 人员已知的转录终止子，包括但不限于终止序列例如牛生长激素终止子 或病毒终止序列例如SV40终止子。在某些实施方案中，终止信号可以 是例如因序列截短而缺乏可转录或可翻译的序列的。

E.转录后调节元件(PRE)

转录后调节是在RNA水平上(即在基因的转录与翻译之间)的基 因表达控制。在某些方面，使用土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件 (WPRE)。WPRE增加核转录物的水平并促进RNA输出。WPRE可 促进RNA加工中的其它步骤，从而指导通常会在核内被降解的RNA被 有效地表达。WPRE还可用于促进RNA-蛋白质复合物的产生，所述 RNA-蛋白质复合物会保护新合成的转录物免于在核内被降解。 (Zufferey et al.,Journal of Virology,73:2886-2892,1999and US Patent  6284469,将其通过引用并入本文)。

F.多腺苷酸化信号

在表达中，特别是真核表达中，将通常包括多腺苷酸化信号以使转 录物发生适当的多腺苷酸化。据信多腺苷酸化信号的性质对于本发明的 成功实践不是至关重要的，并且可采用任何这样的序列。优选的实施方 案包括SV40多腺苷酸化信号或牛生长激素多腺苷酸化信号，其是方便 的并且已知在多种靶细胞中良好地起作用。多腺苷酸化可增加转录物的 稳定性或可促进胞质运输。

G.复制起始点

为了在宿主细胞中扩增载体，可包含复制位点的一个或多个起始点 (通常被称作“ori”)，其是在其上起始复制的特定核酸序列。可选择地， 如果宿主细胞是酵母，可采用自主复制序列(ARS)。

H.可选择的和可筛选的标志物

在本发明的某些实施方案中，可通过将标志物包含在表达载体中来 体外或体内地鉴定包含本发明的核酸构建体的细胞。这样的标志物会赋 予细胞可鉴定的改变从而允许容易地鉴定包含表达载体的细胞。通常 地，可选择标志物是赋予允许选择的性质的标志物。阳性可选择标志物 是其中该标志物的存在允许其选择的标志物，而阴性可选择标志物是其 中其存在阻止其选择的标志物。阳性可选择标志物的实例是药物抗性标 志物。

药物选择标志物的包含通常帮助克隆和鉴定转化子，例如，赋予对 新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博莱霉素和组氨醇的抗性 的基因是有用的可选择标志物。除了赋予允许基于实施条件鉴别转化子 的表型的标志物，还涉及了其它类型的标志物包括可筛选的标志物例如 GFP，其是基于比色分析的。或者，可利用可筛选的酶例如单纯疱疹病 毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还会 知晓如何采用免疫学标志物，可能地与荧光辅助细胞分选(FACS)和/ 或免疫组织化学相结合。据信所使用的标志物不是重要的，只要其能够 与编码基因产物的核酸同时表达。可选择和可筛选的标志物的其它实例 是本领域技术人员所公知的。

Ⅲ.多肽组合物

可对多肽的氨基酸组成进行修饰和/或改变，因此本发明涉及多肽和 编码其的核酸的序列的变化，然而其中它们能够保持关于本发明的治疗 性、预防性和治愈性方面的实质活性。

生物学功能性等同物可包括已被工程化以包含不同的序列而同时 保持编码“野生型”或标准肽的能力的多核苷酸。这可通过遗传密码子的 简并性(即存在编码相同氨基酸的多个密码子)来实现。在一个实例中， 本领域技术人员可期望将限制性内切酶识别序列引入多核苷酸中而不 干扰该多核苷酸编码蛋白的能力。

在另一个实例中，多核苷酸可编码具有更多显著改变的生物学功能 性等同物。某些氨基酸可取代蛋白结构中的其它氨基酸而不显著损失与 结构(例如抗体的抗原结合区、底物分子上的结合位点、受体等)相互 作用的结合能力。所谓的“保守性”改变不破坏蛋白的生物学功能，因为 结构改变不影响蛋白执行其所具有的功能的能力。因此，本发明人已考 虑了可对本文中公开的基因和蛋白的序列进行各种改变，而仍然满足本 发明的目的。

在功能性等同物方面，本领域技术人员已充分理解，在“生物学功 能性等同”的蛋白和/或多核苷酸的定义中所固有的，其是这样的概念： 在保持具有可接受水平的等同生物学活性的分子的情况下可在分子的 确定部分内进行的改变的数量存在限制。因此生物学功能性等同物在本 文中被定义为所选择的氨基酸(或核苷酸)可被取代的那些蛋白质(和 多核苷酸)。在某些方面，多肽与该多肽的野生型形式具有80、85、90、 92、94、96、98或100％的同一性。在某些方面，使用与SEQ ID NO:5 或6具有80、85、90、92、94、96、98或100％的同一性的多肽或编码 所述多肽的核酸。

通常地，分子的长度越短，可在分子内进行而又保持功能的改变越 少。较长的结构域可具有中等数量的改变。全长蛋白对于较大数量的改 变将具有最大的容忍性。然而，必需理解高度依赖于其结构的某些分子 或结构域可几乎不能或不能容忍改变。可使用已知用于检测目的多肽的 活性的各种测定来确定多肽的功能。

氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似度，例如其疏水 性、亲水性、电荷、大小和/或类似的。氨基酸侧链取代基的大小、形状 和/或类型的分析显示精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸都是带正电荷的残基； 丙氨酸、甘氨酸和/或丝氨酸都具有相似的大小；和/或苯丙氨酸、色氨 酸和/或酪氨酸都具有通常相似的形状。因此，基于这些考虑，精氨酸、 赖氨酸和/或组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和/或丝氨酸；和/或苯丙氨酸、色 氨酸和/或酪氨酸在本文中被定义为生物学功能性等同物。

为了实现更多数量的改变，可考虑氨基酸的亲水指数。每一个氨基 酸已基于其疏水性和/或电荷特征被赋以亲水指数，这些是：异亮氨酸 (+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸 (+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝 氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)； 谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨 酸(-3.9)；和/或精氨酸(-4.5)。

亲水氨基酸指数在赋予蛋白相互作用生物学功能过程中的重要性 是本领域所普遍理解的(Kyte&Doolittle,1982，其通过引用并入本文)。 已知某些氨基酸可取代具有相似亲水指数和/或评分的其它氨基酸和/或 仍然保持相似的生物学活性。在基于亲水指数进行改变的过程中，其亲 水指数在±2之内的氨基酸的取代是优选的，其亲水指数在±1之内的氨 基酸的取代是特别优选的，和/或其亲水指数在±0.5之内的氨基酸的取代 是更特别地优选的。

在本领域中还理解可基于亲水性来有效地进行相似氨基酸的取代。 如美国专利4,554,101中所详述的，已对氨基酸残基赋以下列亲水性值： 精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨 酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)； 脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨 酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)； 苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值进行改变的过程 中，其亲水性值在±2之内的氨基酸的取代是优选的，其亲水性值在±1 之内的氨基酸的取代是特别优选的，和/或其亲水性值在±0.5之内的氨基 酸的取代是更特别地优选的。

在某些实施方案中，如本文所述的重组多肽包含蛋白转导结构域。 蛋白转导结构域(PTD)具有跨生物膜转运的能力。PTD是相对短(1-35 个氨基酸)的序列，其将此表观转运活性赋予蛋白质和与其缀合、复合 或融合的其它大分子物质。例如，HIV来源的TAT肽(YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:7))已被广泛用于多种试剂(从小分子到蛋白质、肽、药用 纳米载体和成像试剂的范围)的细胞内递送。可选择地，还可将受体介 导的内吞机制用于细胞内药物递送。例如，转铁蛋白受体介导的内化途 径是已被开发用于药物和蛋白质的位点特异性递送的有效的细胞吸收 途径。这可通过将转铁蛋白与治疗性药物或蛋白质进行缀合来化学上地 实现或通过将治疗性肽或蛋白质注入转铁蛋白的结构中来遗传性地实 现。天然存在的蛋白质(例如铁结合转铁蛋白)在这样的药物靶向领域 中是非常有用的，因为这些蛋白质是生物可降解的、非毒性的和非免疫 原性的。蛋白转导结构域包括但不限于来源于例如下列蛋白的PTD：人 免疫缺陷病毒1(HIV-1)TAT(Ruben et al.,J.Virol.63:1-8,1989),例如 GRKKRRQRRR(TAT 48-57,SEQ ID NO:8)；疱疹病毒被膜蛋白 VP22(Elliott and O'Hare Cell 88:223-33,1997)；果蝇(Drosophila  melanogaster)触角足(Antp)蛋白的同源异型蛋白(Penetratin PTD； Derossi et al.J.Biol.Chem.271:18188-93,1996)；protegrin 1(PG-1)抗菌 肽SynB(例如SynB1,SynB3和Syn B4；Kokryakov et al.FEBS Lett. 327:231-36,1993)；和碱性成纤维细胞生长因子(Jans FASEB J.8:841-47, 1994)。PTD还包括合成的PTD，例如但不限于多聚精氨酸肽(Futaki et  al.,J.Mol.Recognit.16:260-64,2003；Suzuki et al.,J.Biol.Chem. 276:5836-40,2001)；transportan(Pooga et al.,FASEB J.12:67-77,1988； Pooga et al.,FASEB J.15:1451-53,2001)；MAP(Oehlke et al.,Biochim. Biophys.Acta.1414:127-39,1998)；KALA(Wyman et al.,Biochemistry  36:3008-17,1997)；和其它阳离子肽，例如多种β-阳离子肽 (Akkarawongsa et al.,Antimicrob.Agents and Chemother.52(6):2120-29, 2008)。

Ⅳ.递送载体

在某些方面，将组分通过使用编码或表达这样的组分的核酸来提供 至胰腺或其它器官或组织。病毒和非病毒递送载体可用于本文所述方法 (例如Syner-III)。术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“核苷酸 序列”和“核苷酸分子”在本文中可互换地使用，并且除非另有指明，其 是指脱氧核糖核酸(包括cDNA、DNA、PNA)的聚合物或核糖核酸 (RNA)的聚合物。核酸可获自细胞提取物、基因组或基因组外DNA、 病毒核酸、或人工/化学合成的分子。所述术语可包括双链或单链的脱氧 核糖核酸或核糖核酸。

A.病毒递送

某些病毒通过受体介导的胞吞作用感染细胞或进入细胞并且表达 病毒编码基因的能力已使得它们成为用于将外来核酸转移至细胞(例如 哺乳动物细胞)中的有吸引力的候选物。因此可利用病毒来编码和表达 增加葡萄糖代谢的活性、增加酪氨酸激酶受体活性和增加与β细胞相关 的基因的转录的试剂。可用于递送核酸的病毒载体的非限制性实例描述 于下文中。

腺病毒载体。用于核酸递送的具体方法包括使用腺病毒表达载体。 尽管已知腺病毒载体具有低的整合至基因组DNA中的能力，但这个特 征被这些载体提供的高基因转移效率所弥补。“腺病毒表达载体”意欲包 括这样的构建体，其包含足以(a)支持该构建体的包装和(b)最终表达已 克隆至其中的组织或细胞特异性构建体的腺病毒序列。对遗传组织或腺 病毒(36kb的线性双链DNA病毒)的认识允许用大至7kb的外来序列 来取代大片段的腺病毒DNA(Grunhaus and Horwitz,Semin.Virol.3, 237-252,1992)。

AAV载体。可使用腺病毒辅助转染来将核酸引入细胞。在使用腺 病毒偶联系统的细胞系统中已报道了增加的转染效率。腺相关病毒 (AAV)具有低的整合效率并且其可感染非分裂细胞，从而使得其可用 于将基因递送至组织培养中的或体内的哺乳动物细胞中。AAV具有广 谱的感染性宿主范围。关于产生和使用rAAV载体的详细内容描述于美 国专利5,139,941和4,797,368中，将其各自通过引用并入本文。

逆转录病毒载体。逆转录病毒具有将其基因整合至宿主基因组中、 转移大量外来遗传物质、感染广谱的物种和细胞类型以及被包装至特定 细胞系中的能力。为了构建逆转录病毒载体，将核酸(例如编码目的蛋 白的核酸)插入病毒基因组中替代某些病毒序列以产生复制缺陷的病 毒。为了产生病毒体，构建包含gag、pol和env基因但不具有LTR和 包装组分的包装细胞系。当将包含cDNA的重组质粒与逆转录病毒LTR 和包装序列一起引入特定细胞系(例如通过磷酸钙沉淀)中时，包装序 列允许重组质粒的RNA转录物被包装至病毒颗粒中，所述病毒颗粒随 后被分泌至培养基中。随后收集包含重组逆转录病毒的培养基，任选地 进行浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染广泛多样的细胞 类型。

慢病毒是复杂的逆转录病毒，其在常见的逆转录病毒基因gag、pol 和env之外，还包含其它的具有调节性或结构性功能的基因。慢病毒载 体在本领域是广为人知的(参见例如，美国专利6,013,516和5,994,136, 将其各自通过引用并入本文)。慢病毒的一些实例包括人免疫缺陷病毒： HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。已通过多重减毒HIV致病 基因来产生慢病毒载体，例如基因env、vif、vpr、vpu和nef被删除以 使得载体是生物学上安全的。

重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞并且可用于核酸序列的体内 和离体基因转移和表达。例如，能够感染非分裂细胞的重组慢病毒描述 于美国专利5,994,136(将其通过引用并入本文)中，其中用两个或更多 个具有包装功能即gag、pol和env以及rev和tat的载体转染适当的宿 主细胞。

可通过将包膜蛋白与用于靶向至特定细胞类型的受体的抗体或特 定配体连接来靶向重组病毒。通过将目的序列(包括调节区)插入病毒 载体中，连同另一个例如编码用于特定靶细胞上的受体的配体的基因， 载体即为靶特异性的。可将这样的病毒载体靶向至胰腺的细胞。

其它病毒载体。可将其它病毒载体用于本发明的方法。可使用来源 于例如下列病毒的载体：牛痘病毒(Ridgeway,In:Vectors:A survey of  molecular cloning vectors and their uses,Rodriguez and Denhardt  (Eds.),Stoneham:Butterworth,467-492,1988；Baichwal and Sugden,In: Gene Transfer,Kucherlapati(Ed.),NY,Plenum Press,117-148,1986； Coupar et al.,Gene 68:1-10,1988)、辛德毕斯病毒、巨细胞病毒和单纯 疱疹病毒。它们提供若干有吸引力的用于各种哺乳动物细胞的特征 (Friedmann,Science,244:1275-1281,1989；Ridgeway,In:Vectors:A  survey of molecular cloning vectors and their uses,Rodriguez and  Denhardt(Eds.),Stoneham:Butterworth,467-492,1988；Baichwal and  Sugden,In:Gene Transfer,Kucherlapati(Ed.),NY,Plenum Press, 117-148,1986；Coupar et al.,Gene 68:1-10,1988；Horwich et al.,J. Virol.64:642-650,1990)。

经修饰的病毒。可将待被递送的核酸装入已被工程化以表达特定的 结合配体或偶联至所述配体的感染性病毒内。病毒颗粒从而将特异性结 合至靶细胞的同源受体并将内含物递送至细胞。基于通过将基团化学添 加至病毒的表面蛋白或重组工程化病毒表面蛋白中的基团来化学或遗 传修饰病毒，开发了被设计来允许病毒载体的特异性靶向的新型方法。 一种使用乳糖基团的这样的修饰可允许通过唾液酸糖蛋白受体特异性 感染肝细胞。

另一种用于重组病毒的靶向的方法被设计为其中使用针对病毒表 面蛋白和针对特定细胞受体的生物素化抗体。抗体可通过使用抗生蛋白 链菌素利用生物素来偶联(Roux et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86:9079-83,1989)。通过使用针对主要组织相容性复合体I类和II类抗 原的抗体，证明了同向性病毒在体外对多种具有这些表面抗原的人类细 胞的感染(Roux et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9079-83,1989)。

在某些方面，可使用接头系统，即同时结合递送载体和靶胰腺细胞 受体以促进胰腺中的转导的分子。在其它方面，可将天然的病毒载体受 体的使用与胰腺靶向配体融合。在另一方面，可将双特异性抗体(偶联 在一起的两种抗体)偶联至递送载体从而导致递送载体具有针对靶胰腺 细胞的特异性。在某些方面，可将靶向基团通过化学方法结合至递送载 体。在其它方面，可将结合至递送载体的经遗传掺入的Ig-结合结构域 的抗体用于增强递送。在其它方面，可将小的靶向基序插入衣壳、包膜、 病毒吸附物、其它病毒表面蛋白以靶向胰腺细胞。

在某些方面，病毒构建体可编码两种异源蛋白组分(例如GK和 Pdx-1)和表达shRNA PTP1B。在其它方面，每种组分可包含在个别的 和单独的病毒中。

本文所述组合物可通过内窥镜检查术经胰管来递送。简要地，给患 者施用镇静剂或麻醉剂，插入可弯曲的内窥镜通过口、经过食道、进入 胃、通过幽门进入其中存在肝胰管壶腹(胆总管和胰管的开口)的十二 指肠中。肝胰壶腹括约肌是控制壶腹开口的肌肉阀。该区域可在进行程 序时通过内窥摄像机直接看见。将塑料导管或套管插入通过壶腹，并将 β细胞诱导组合物(例如Syner-III)引入胰腺胆管中以靶向胰腺。还可 通过用胰腺靶向基团偶联病毒载体例如修饰病毒载体的包膜结构以仅 靶向胰腺组织来静脉内递送β细胞形成组合物。

B.脂质介导的转染

在其它实施方案中，可将核酸包埋在脂质颗粒例如脂质体中。脂质 体为囊泡结构，其特征在于磷脂双分子层膜和内部的水介质。多层脂质 体具有被水介质分开的多个脂质层。它们在磷脂悬浮于过量的水溶液中 时自发地形成。脂质组分经历自身重排，随后形成封闭的结构并将水和 溶解的溶质包埋在脂质双分子层之间(Ghosh and Bachhawat,In:Liver  Diseases,Targeted Diagnosis and Therapy Using Specific Receptors and  Ligands,Wu et al.(Eds.),Marcel Dekker,NY,87-104,1991)。还涉及了 与Lipofectamine(Gibco BRL)或Superfect(Qiagen)复合的核酸。

外源DNA的脂质介导的核酸递送和表达在体外是非常成功的 (Nicolau and Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190,1982；Fraley et  al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:3348-3352,1979；Nicolau et al., Methods Enzymol.149:157-176,1987)。还已证明了外源DNA在培养的 鸡胚、HeLa和肝癌细胞中的脂质介导的递送和表达是可行的(Wong et  al.,Gene 10:87-941980)。

在本发明的某些实施方案中，可将脂质颗粒与血凝病毒(HVJ)复 合。已显示这促进与细胞膜的融合并促进脂质封装DNA的细胞进入 (Kaneda et al.,Science 243:375-378 1989)。在其它实施方案中，可将脂 质颗粒与核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合或与其结合使用(Kato et  al.,J.Biol.Chem.266:3361-3364,1991)。在其它实施方案中，可将脂质 颗粒与HVJ和HMG-1复合或与其结合使用。在其它实施方案中，递送 媒介物可包含配体和脂质颗粒。

在某些方面，可通过脂质体来递送本文所述的组分，包括PTP1B 的shRNA和编码Pdx-1和葡糖激酶的核酸。可静脉内递送包含核酸的 脂质体并当其到达胰腺组织时进行释放。在某些方面，本发明的核酸被 掺入包含存在于脂质体表面上的化学偶联配体的脂质体中。所述配体特 异性靶向胰腺细胞。通过使用这样的策略，可将多种配体或受体例如抗 体、生长因子、细胞因子、激素和毒素锚定在脂质体表面上以便β细胞 诱导组分可被靶向至和引入胰腺细胞中。

C.受体介导的转染

此外，可通过受体介导的递送媒介物将核酸递送至靶细胞。这些利 用将发生在靶细胞中的大分子通过受体介导的胞吞作用的选择性吸收。 考虑到各种受体的细胞类型特异性分布，此递送方法给本发明添加另一 程度的特异性。

某些受体介导的基因靶向媒介物包含细胞受体特异性配体和核酸 结合试剂。其它的则包含已与待被递送的核酸有效地连接的细胞受体特 异性配体。已将几种配体用于受体介导的基因转移(Wu and Wu,J.Biol. Chem.262:4429-4432,1987；EP patent 0273085)，这建立了该技术的可 操作性。在本发明的某些方面，将选择配体来对应于特异性表达在靶细 胞群上的受体。

在其它实施方案中，细胞特异性核酸靶向媒介物的核酸递送媒介物 组分可包括与脂质颗粒组合的特异性结合配体。待被递送的核酸被装入 脂质颗粒内并且特异性结合配体被功能性地掺入脂质层中。脂质颗粒从 而将特异性结合至靶细胞的受体并将内含物递送至细胞。已显示通过使 用其中例如将表皮生长因子(EGF)用于核酸至显示EGF受体上调的 细胞的受体介导的递送的系统，这样的系统是功能性的。

在其它实施方案中，靶向递送媒介物的核酸递送媒介物组分可以是 脂质颗粒本身，其将优选包含指导细胞特异性结合的一种或多种脂质或 糖蛋白。例如，已将乳糖神经酰胺(半乳糖末端的无唾液酸神经节苷脂) 掺入脂质颗粒中并观察到增加肝细胞对胰岛素基因的吸收(Nicolau et  al.,Methods Enzymol.149:157-176,1987)。可以预见的是，可以以类似 的方式或如本文中所述将本发明的组织特异性转化构建体特异性递送 至靶细胞中。

D.微粒轰击

可将微粒轰击技术用于将核酸引入至少一种细胞器、细胞、组织或 生物体中(U.S.Patents 5,550,318；5,538,880；5,610,042；and PCT  Application WO 94/09699；将其各自通过引用并入本文)。该方法依赖于 将DNA涂覆的微粒加速至高速率从而允许其穿过细胞膜和进入细胞而 不杀死细胞的能力(Klein et al.,Nature 327,70-73,1987)。本领域中已知 广泛多样的微粒轰击技术，其中许多可应用于本发明。

在微粒轰击中，可将一个或多个颗粒用至少一种核酸涂覆并通过推 进力将其递送至细胞中。已开发了若干用于加速小颗粒的装置。一种这 样的装置依赖于高压放电来产生电流，所述电流进而提供动力。所使用 的微粒由生物惰性物质例如钨或金颗粒或微珠组成。示例性颗粒包括包 含钨、铂和金的颗粒。可以预见的是，在一些情况下，DNA在金属颗 粒上的沉淀对于使用微粒轰击的至受体细胞的DNA递送会是非必需 的。然而，可以预见的是，颗粒可包含DNA而非被DNA涂覆。DNA 涂覆的颗粒可通过颗粒轰击增加DNA递送的水平但其本身是非必需 的。

可通过空气枪(基因枪)将裸质粒DNA转移至细胞中。可使用基 因枪方法利用内窥镜检查术经胰管注射Syner-III质粒以到达胰腺组织。 通过基因枪的质粒DNA轰击通过打开膜小孔的物理压力和/或通过促进 裸质粒DNA通过细胞膜的扩散而进入细胞。

E.纳米颗粒

可将本发明的核酸掺入靶向胰腺或其它组织的纳米颗粒的三维多 元结构中。所使用的纳米颗粒包括但不限于脂质体、聚合物、蛋白质、 胶束、树状分子(dendimer)、量子点、纳米壳、纳米晶体、金纳米颗 粒、顺磁纳米颗粒和碳纳米管。

F.水动力基因递送

可采用水动力基因递送经胰管递送裸质粒DNA。可将气囊导管置 入胰管中。使置入胰管中的气囊导管膨胀用于闭塞辅助的注入。

G.电穿孔

在某些方面，可将一对电极置于胰腺或其它组织之上或之中，并且 本发明的核酸沉积在电极上以便遗传物质被转移至组织中。

H.超声促进的基因转移

可将本发明的核酸掺入微气泡中，并静脉内注射所述微气泡。当微 气泡到达胰腺或其它组织时，用超声靶向所述微气泡。随着微气泡膨胀 和爆裂，它们将核酸释放至胰腺中。局部的冲击波使得核酸穿透附近的 细胞膜。

Ⅰ.通过针头进行的基因转移

在某些方面，使用针头将本发明的核酸直接注射至胰腺或其它组织 中。

Ⅴ.药物组合物

在本说明书的基础上，适当治疗方案(例如剂量、施用频率、全身 性的相对于局部的等)的确定在本领域技术人员的能力之内。对于施用， 将与药学上可接受的载体一起将本文所述组分配制在单位剂型(溶液、 悬液、乳液等)中。这样的媒介物通常是非毒性和非治疗性的。这样的 媒介物的实例是水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hanks溶液。还 可使用非水性媒介物例如非挥发性油和油酸乙酯。优选的媒介物是于盐 水中的5％(w/w)人白蛋白。媒介物可包含小量的添加剂，例如增加等 渗性和化学稳定性的物质，例如缓冲液和防腐剂。

可通过任何适当的途径单独地或组合地施用本文所述治疗性组合 物以及其生物学等同物。胃肠外施用的实例包括静脉内、动脉内、肌内、 腹膜内等。本文所述的施用途径仅是示例性的且不以任何方式进行限 定。

按照本发明的实施方案，施用至动物特别是人中的治疗性组合物的 剂量应当足以在合理的时间范围内在受试者中产生期望的反应。已知治 疗性组合物的剂量取决于多种因素，包括所采用的具体治疗性组合物的 效力，动物的年龄、种类、病况或疾病状态和体重。

此外，剂量和给药方案将主要取决于宿主的生物损伤类型、受试者 类型、受试者的历史和正在进行施用的治疗性组合物的类型。剂量大小 将由施用的途径、时间设置和频率以及可伴随具体治疗性组合物的施用 的任何不利的副作用和所期望的生理效应的存在、性质和程度来确定。 还已知多种病况或疾病状态(特别是慢性病况或疾病状态)可能需要牵 涉多次施用的长期治疗。

因此，治疗性组合物的量必须是有效的以实现增加的治疗指数。如 果采用多次剂量，施用的频率将取决于例如受试者类型。本领域技术人 员可根据常规的实验确定在给定受试者中在任何具体的病例中最为有 效的适当的施用途径和频率。适当的剂量和给药方案可通过常规已知的 测距技术来确定。通常地，利用低于化合物的最佳剂量的较小剂量来开 始治疗。此后，以小增量增加剂量直到获得在该情况下的最佳效应。

用于本发明的实施方案的治疗性组合物通常包括载体。这些载体可 以是常规使用的任何载体并且仅受施用途径以及化学和物理考虑因素 (例如溶解度和与治疗剂的反应性)的限制。此外，非限制性地，可以 将治疗性组合物配制为聚合组合物、包络物，例如环糊精包络物、脂质 体、微球体、微囊体等。

本文所述的药学上可接受的赋形剂例如媒介物、佐剂、载体或稀释 剂是广为人知的并且可容易地获得。优选药学上可接受的载体是相对于 治疗性组合物为化学惰性的物质并且是在使用条件下不具有有害副作 用或毒性的物质。

赋形剂的选择将部分地决定于具体的治疗性组合物以及用于施用 组合物的具体方法。因此，存在用于本发明实施方案的药物组合物的多 种多样的适当制剂。例如，非限制性的制剂可以是可注射的制剂例如但 不限于用于静脉内、皮下、肌内、腹膜内注射等的制剂，和口服制剂例 如但不限于液体溶液包括悬液和乳液、胶囊、袋剂、片剂、锭剂等。适 合用于胃肠外施用的非限制性制剂包括水性的和非水性的等渗无菌注 射溶液，包含无活性成分例如抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、增溶剂、增 稠剂、稳定剂、防腐剂、表面活性剂等。非限定性地，溶液可包含油脂、 脂肪酸，包括去垢剂等，以及其它在这样的组合物中公知和常见的成分。

Ⅵ.实施例

下列实施例以及附图被包括在内以显示本发明的某些实施方案。本 领域技术人员应理解实施例或附图中所公开的技术代表由本发明人发 现的在所描述的方法的实践中良好地起作用的技术，并因此可被认为构 成其实践的方式。然而，在本公开内容的基础上，本领域技术人员应理 解可对所公开的具体实施方案进行许多改变并仍然获得相似的或类似 的结果而不背离本发明的精神和范围。

实施例1

成体胰腺中的β细胞形成

A.结果

为了举例说明的目的，治疗性部分包括慢病毒-CMV-葡糖激酶 (GK)、慢病毒-H1-shRNA PTP1B和慢病毒-CMV-PDX-1。对照组合 物包括以与治疗性组合物相同的浓度注射的慢病毒-CMV-GFP和慢病 毒-H1-随机打乱shRNA(shRNA Scramble)。注射后四周，在小鼠胰 腺中检测PDX-1和GK的体内过表达和PTP1B表达的体内抑制。在胰 岛和在外分泌组织中检测到葡糖激酶过表达。葡糖激酶在外分泌组织中 的表达证实了治疗性组合物导致的葡糖激酶的过表达，因为胰腺组织仅 在内分泌细胞中表达葡糖激酶。Pdx-1过表达通过使用掺入Pdx-1的 cDNA以区分外源和内源表达的c-Myc标签来检测。还检测了共表达 GFP的shRNA PTP1B。蛋白表达通过western印迹来确认。

CNIP方法的第一方面：CNIP方法的一个目的是增加胰腺中的葡 萄糖代谢以诱导胰腺β细胞形成。为了葡萄糖进入糖酵解途径，其首先 必须通过膜葡萄糖转运系统进入细胞内空间。葡萄糖转运蛋白Glut1和 Glut3存在于外分泌和内分泌人胰腺组织中，并且Glut2存在于胰腺β 细胞中(Coppieters et al.,Diabetes Metab Res Rev 27:746-754,2011)。然 而，葡萄糖转运不是葡萄糖进入糖酵解途径的限速步骤(Wasserman et  al.,J.Exp.Biol.214:254-262,2011)。糖酵解途径中葡萄糖代谢的第一限 速步骤是在己糖激酶对葡萄糖磷酸化的水平上。己糖激酶对葡萄糖的磷 酸化产生代谢产物葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)。胰腺β细胞包含Ⅳ型己糖 激酶，其被称为葡糖激酶(GK)。与其它己糖激酶相反，葡糖激酶不 受细胞内G-6-P积累的变构抑制。因此，对于葡糖激酶，葡糖激酶的量 和活性调节通过糖酵解的葡萄糖流量速率。对于己糖激酶家族的其它成 员，G-6-P的产物抑制是酶活性的关键调节因子并且因此葡萄糖进入糖 酵解途径。如果葡萄糖未被己糖激酶磷酸化，其不能经历进一步的代谢 并且不能对转录器产生任何信号以诱导基因表达(Doiron et al.,J Biol  Chem.269:10213-10216,1994and J Biol Chem.271:5321-5324,1996)。 因此，在某些方面，可将葡糖激酶包含在CNIP混合剂中以诱导胰腺β 细胞形成。

本发明人设计了在巨细胞病毒(CMV)启动子的控制之下表达葡 糖激酶的慢病毒载体构建体(图2A)。该慢病毒载体构建体在编码序 列的3’非翻译区包含土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件(WPRE)，其 增加转基因的表达水平。WPRE在核内起作用以通过增加核转录物的水 平和极大地增加RNA半衰期来转录后地刺激基因表达(Zufferrey et al., J.Virol.73:2886-289,1999)。将小鼠葡糖激酶(GCK)基因亚克隆至 pEntCMV-WPRE载体并通过DNA测序确认插入物。将pENT-GCK 用LR Clonase II酶(Invitrogen)进行处理并连接至pLenti载体。将重组 产物转化至大肠杆菌细胞中。经温育过夜后，选择阳性克隆并纯化质粒 DNA。将pEnt-GCK和pLenti-GCK转染至293细胞中。转染后48小 时，在SDS-PAGE缓冲液中裂解细胞并使其经历4-20％SDS-PAGE凝 胶电泳并通过Western印迹进行分析。使用以1:1000稀释的抗-GCK抗 体和随后的HRP缀合的第二抗体进行Western印迹。使用ECL试剂对 Western印迹膜进行显影。

将pLenti-GCK用于产生纯的高滴度的慢病毒载体。如上所述将 Lenti-GCK直接注射至成体小鼠的胰腺中。成体小鼠C57BL/6(8周龄； 来自Charles River,Wilmington,MA)将被用于利用慢病毒载体构建体 靶向胰腺的体内实验。

已显示利用质粒载体的增加的葡糖激酶表达增加葡萄糖-6-磷酸 (G-6-P)库(Doiron et al.,J Biol Chem.269:10213-10216,1994)。葡萄 糖-6-磷酸是处于几个代谢途径(糖酵解、糖异生、戊糖磷酸途径、糖原 生成和糖原分解)的交叉点的关键中间体。Doiron等人(1996)证明了 至转录器的葡萄糖信号由木酮糖-5-磷酸介导，其是由戊糖磷酸途径产生 的代谢产物。如Doiron所显示的，木酮糖-5-磷酸是负责通过葡萄糖代 谢介导转录器诱导的主要代谢产物。调节通过戊糖磷酸途径的代谢流量 的关键酶是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)。G-6-P通过G6PD酶的作 用进入戊糖磷酸途径。因此，在本发明的CNIP方法的开发中，可使用 Lenti-CGK和Lenti-G6PD的组合来引导葡萄糖-6-磷酸进入戊糖磷酸途 径以增加介导葡萄糖代谢的转录效应的木酮糖-5-磷酸形成。在木酮糖-5- 磷酸的形成中的另一个重要的酶是转酮醇酶(TK)，其位于戊糖磷酸 途径的更下游。因此，可选择的方法将是组合Lenti-TK和Lenti-CGK 以增加葡萄糖代谢调节的基因表达效应。可将所有分子(Lenti-CGK、 Lenti-G6PD和Lenti-TK)的协同作用用于活化在葡萄糖代谢控制之下 的转录器和增加β细胞形成。

CNIP方法的第二方面：CNIP方法的第二方面包括增加膜受体酪 氨酸激酶活性和酪氨酸激酶相关受体活性。葡萄糖代谢是牵涉成体胰腺 中β细胞形成的主要机制。另一个牵涉β细胞形成的系统是结合至酪氨 酸激酶受体的配体(Vasavada et al.,Int J Biochem Cell Biol.38:931-950, 2006)。胰腺β细胞量响应生理应激(即妊娠)的增加由通过催乳素受 体起作用的生长激素、催乳素和胎盘催乳激素介导。催乳素受体不具有 内在的酪氨酸激酶活性但其与酪氨酸激酶的Janus激酶家族的成员相互 作用。催乳素受体是酪氨酸激酶相关受体家族的部分。酪氨酸激酶的 Janus激酶家族负责β细胞量响应在妊娠中出现的激素变化的增加 (Vasavada et al.,Int J Biochem Cell Biol.38:931-950,2006)。胰岛素、胰 岛素样生长因子、肝细胞生长因子和表皮生长因子的作用还通过活化膜 结合的酪氨酸激酶受体增加β细胞量(Vasavada et al.,Int J Biochem Cell  Biol.38:931-950,2006)。因此，催乳激素(包括生长激素、催乳素和胎 盘催乳激素)、胰岛素、胰岛素样因子、肝细胞生长因子和表皮生长因 子受体需要酪氨酸激酶的活化以增加胰腺β细胞量。

已显示蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制胰岛素、胰岛素样生 长因子受体、催乳素和肝细胞生长因子活化酪氨酸激酶的能力(Aoki and  Matsuda,J.Biol.Chem.275:39718-39726,2000；Kakazu et al.,Invest  Opthalmol Vis Sci.49:2927-2935,2008；Tonks,Nat Rev.Mol Cell Biol  7:833-46,2006)。因此，可包含在CNIP混合剂中的一种分子是靶向 PTP1B的抑制剂或抑制性RNA(例如shRNA)。shRNA对PTP1B蛋 白产生的抑制将增加受体酪氨酸激酶活性，所述活性参与响应生理浓度 的对应激素的结合的成体胰腺β细胞形成。已使用与上文针对 lenti-CGK所描述的相同的方法将shRNA PTP1B引入慢病毒构建体中 处于H1聚合酶启动子的控制之下(Doiron et al.,Diabetologia 55:719-728, 2012)(图2C)。由于聚合酶Ⅲ的管家功能，聚合酶Ⅲ启动子H1在所有 细胞中是普遍具有活性的。如上文所述地将lenti-shRNA-PTP1B提供给 胰腺。

慢病毒shRNA PTP1B。将小发夹RNAi构建至pEQU6载体中。靶 序列的长度是20nt(GCCAGGACATTCGACATGAA SEQ ID NO:2)。 通过DNA测序来验证shRNAi序列。

使用靶基因表达质粒pEnt-PTP1B和一个pEQ-PTP1B-shRNA载体 来进行共转染实验。下表描述了每个反应的组分。转染后48小时，在 SDS-PAGE缓冲液中裂解细胞并将其经历4-20％SDS-PAGE凝胶电泳 和Western印迹分析。使用以1:1000稀释的抗-PTP1B抗体进行Western 印迹。使用ECL试剂评价膜。对于每个6孔：

  293细胞 PTP1B-shRNA 小鼠PTP1B cDNA   1.0 pEQ-PTP1B shRNA   2.0 pEQ-随机打乱shRNA 3.0   总DNA 3.0 3.0

CNIP方法的第三方面：可包括在本文所述方法中的第三方面包括 通过转录因子增加基因表达以整合葡萄糖代谢的效应(第一方面)和酪 氨酸激酶受体家族活性的刺激(第二方面)以诱导胰腺中的β细胞形成。

已提出了不同的模型来解释转录因子至核内结合其靶DNA序列的 促进的扩散。一个模型提出转录因子(TF)通过促进的扩散结合DNA。 首先，TF在非特异性位点随机地与DNA相互作用。在最初的TF与 DNA分子的相互作用之后，通过促进的扩散，TF通过沿着DNA“滑行” 而从其最初的非特异性位点移动至其靶序列。随着TF沿着DNA滚动 并找到其对应的结合位点，其诱导转录器的活化或抑制。不考虑被提出 来解释TF如何到达其DNA结合位点的模型，所有提出的模型和实验 都包括TF随机移动以找到其在转录器中的活化或抑制位点的促进的扩 散。传至转录器的葡萄糖代谢信号转导的一个作用是增加TF结合DNA 分子的概率(Doiron et al.,J Biol Chem.271:5321-5324,1996)。事实上， 传至转录器的葡萄糖代谢信号转导诱导TF表达并且TF从胞质至核的 转运开启了葡萄糖诱导的基因(Doiron et al.,J Biol Chem. 271:5321-5324,1996)。因此，TF增加葡萄糖诱导的基因表达的生物物 理机制依赖于存在于核中的TF数量水平。事实上，当核中的TF量增 加时，与DNA分子相互作用以随机找到其特异性结合位点的几率增加 (Mitanchez et al.,Endo Rev 18:520-540,1997)。参与成体胰腺中β细胞 形成的基因的增加的表达可通过过表达活化β细胞形成途径的关键TF 来实现或增强。

牵涉出生后β细胞形成的一个主要的转录因子是Pdx-1(Doiron and  DeFronzo,Int J Endocrinol Metab.9:356-357,2011)。Pdx-1在出生之前 和之后在胰腺中具有不同的作用(Doiron and DeFronzo,Int J  Endocrinol Metab.9:356-357,2011)。在胚胎阶段，Pdx-1对于胰腺发育 是必需的并且其在内分泌和外分泌组织中表达。然而，在出生之后， Pdx-1仅在胰腺β细胞和生长抑素细胞中表达。因此，在成体胰腺中， Pdx-1不诱导胚胎胰腺发育但其通过响应传至转录器的葡萄糖代谢信号 转导而作用于诱导胰岛素基因表达来诱导胰腺β细胞形成(Doiron and  DeFronzo,Int J Endocrinol Metab.9:356-357,2011；Mitanchez et al., Endo Rev 18:520-540,1997)。已显示Pdx-1在发育后诱导成体动物中的 β细胞形成(Bouwens and Rooman,Physiol Rev 85:1255-1270,2005)。 Pdx-1因其增加β细胞形成的胚胎后作用而可用于CNIP方法。

CNIP方法被设计来诱导成体胰腺中β细胞形成的胚胎后发育而不 激活胰腺发育的胚胎途径。其它的方法使用胚胎途径或干细胞来重现胰 腺的胚胎学发育。诱导胚胎途径来增加β细胞形成的缺陷是其诱导所有 的内分泌细胞类型，包括产生胰高血糖素的α细胞，已显示其在1型和 2型糖尿病的葡萄糖不耐受中起着重要的致病性作用。CNIP方法绕开 胚胎途径和干细胞途径来诱导成体胰腺中的胰腺β细胞形成。

Pdx-1表达和从胞质至核的转运由传至转录器的葡萄糖代谢信号转 导诱导(Mitanchez et al.,Endo Rev 18:520-540,1997)。如所描述的，葡 萄糖代谢对于β细胞形成是必需的。为了产生细胞类型，必须改变细胞 的遗传表达谱。葡萄糖代谢的基因诱导是其中通过血液中的葡萄糖水平 来控制和调节基因表达谱的表观遗传现象实例(Doiron et al.,J Biol  Chem.271:5321-5324,1996；Mitanchez et al.,Endo Rev 18:520-540, 1997)。Pdx-1基因表达和从胞质至核的转运由葡萄糖代谢诱导。然而， 葡萄糖代谢信号转导的作用应指向牵涉胰腺β细胞形成的转录器。Pdx-1 的过表达将通过增加可随机结合至DNA分子并找到其特异性DNA结合 位点的Pdx-1的量来增加β细胞形成。因此，Pdx-1的过表达在汇聚CNIP 混合剂的所有信号转导机制以刺激β细胞形成的过程中起着中枢的作 用。胰腺中Pdx-1的过表达导致汇聚CNIP混合剂中的分子以在激活葡 萄糖代谢信号转导对转录器的其它效应(与β细胞形成无关)之前产生 β细胞(Doiron et al.,J Biol Chem.271:5321-5324,1996；Mitanchez et al., Endo Rev 18:520-540,1997)。已使用与上文针对lenti-CGK所描述的相 同的方法将Pdx-1cDNA引入慢病毒构建体中处于CMV启动子的控制 之下。使用体内注射方法来利用lenti-CMV-Pdx-1靶向成体小鼠胰腺。

慢病毒CMV-Pdx-1构建体(图2B)：将小鼠PDX-1基因亚克隆 至pEntCMV-WPRE载体并通过DNA测序确认插入物。将 pENT-PDX-1用LR Clonase II酶(Invitrogen)进行处理并连接至pLenti 载体。将重组产物转化至大肠杆菌细胞中。经温育过夜后，选择阳性克 隆并纯化质粒DNA。

将pEnt-PDX1和pLenti-PDX1转染至293细胞中。转染后48小时， 在SDS-PAGE缓冲液中裂解细胞并使其经历4-20％SDS-PAGE凝胶电 泳和Western印迹分析。使用以1:1000稀释的抗-Myc(用于PDX1构 建体)抗体和随后的HRP缀合的第二抗体进行Western印迹。使用ECL 试剂检测抗体结合。

通过比较治疗组和对照组，将外分泌组织中单个或两个胰岛素阳性 细胞的数量用作β细胞形成的指示(图4)。对于治疗组，在外分泌组 织中检测到单个或两个胰岛素阳性细胞的增加。

治疗组中相较于对照的单个或两个胰岛素阳性细胞的增加与β细胞 增殖的增加(通过标志物BrdU定量)相关(图5)。BrdU标志物显示 胰岛和外分泌组织中的增殖。

增殖标志物BrdU与胰岛素阳性细胞的共定位证明在注射治疗性组 合物的组中形成了新的胰腺β细胞。仅观察到胰腺β(胰岛素)细胞增 殖。未观察到α(胰高血糖素)或δ(生长抑素)细胞增殖。通过组织学定量， 治疗性组合物诱导了胰腺β细胞形成。的确，如上文所解释的，治疗性 组合物被设计来诱导胰腺β细胞的胚胎后形成而不引起胰高血糖素或生 长抑素细胞的形成。

在治疗组和对照组中定量了β细胞量(图6)。相较于注射对照安 慰剂的对照成体小鼠组，注射治疗性组合物的成体小鼠中的胰腺β细胞 量显著增加。

定量了治疗组和对照组中的β细胞群集密度。相较于对照，治疗性 组合物引起β细胞群集密度的显著增加(图7)。

胰腺β细胞增殖、β细胞量和β细胞群集密度的增加与注射治疗性 组合物的成体小鼠在过夜空腹之后的胰岛素产生相较于对照安慰剂组 的增加相关(图8)。

B.方法

用于靶向基因递送至成体胰腺的体内方法：为了研究成体动物中的 β细胞形成，使用病毒载体来体内靶向成体胰腺。方法学已被验证 (Doiron et al.,Diabetologia 55:719-728,2012)并被用于CNIP方法来体内 产生胰腺β细胞。

慢病毒载体的优势是它们不活化树突细胞至显著的程度。此外，慢 病毒载体可(i)感染并整合至分裂和非分裂细胞中，(ii)提供高的转导效率 并维持体内基因表达，(iii)不诱导显著的宿主免疫应答，和(iv)可被成功 地再施用。重要的是，病毒载体至成体小鼠胰腺中的体内注射方法允许 评价针对在成年期发生的慢性疾病的新的治疗和/或潜在的治愈，并且避 免发生在胚胎发育期间缺失基因时出现的代偿机制。此方法消除了一些 针对敲除模型报道的矛盾的发现，即在敲除了胰岛素受体的小鼠(参见 Kitamura et al.,Annu.Rev.Physiol.,65:313-32,2003)和GLUT4的纯合 无效突变体(GLUT4-/-)(参见Minokoshi et al.,Journal of Biol.Chem., 278(36):33609-12,2003)中(其不显示糖尿病表型)正常的/近似正常的 肌肉胰岛素敏感性。因此，在某些实施方案中，将慢病毒载体用于直接 靶向胰腺。

简要地，可通过如下的管内途径将腺病毒构建体引入小鼠胰腺中： 将32-规的导管(Braintree Scientific,Inc,Braintree,MA)通过胆囊中的 小开口插入胆囊管中。随后将导管插入胆总管中并用围绕胆管和导管的 0/0缝合的活结进行固定以防止载体回流至肝中。利用置于肝胰壶腹括 约肌周围的微夹具来避免载体渗漏至十二指肠中，将100μl表达绿色荧 光蛋白(GFP)的慢病毒载体以10⁸TU/ml通过导管缓慢注射至胰管中。 感染后2周，将整个胰腺取出用于组织学检查。48小时之后，在巨细胞 病毒(CMV)启动子控制之下编码GFP的慢病毒的注射特异性靶向胰 腺组织(Doiron et al.,2012)。通过慢病毒载体的胰腺转导的定量形态测 定分析(基于GFP表达)显示60％的组织表达GFP。即使在四周之后 仍在胰腺中检测到表达(图3)。通过组织学和PCR，在机体内的任何 其它组织包括心脏、肺、肝、脑、腿肌和肾中未发现慢病毒载体表达的 绿色荧光蛋白(数据未显示)。在注射后第2天和第14天用H&E对胰 腺组织进行染色以寻找炎症(胰腺炎)的证据。未观察到炎症的证据。 在包含shRNA Grb10或随机打乱shRNA的慢病毒载体注射之后， shRNA Grb10和随机打乱shRNA组中在注射后14天之内(随机打乱 shRNA小鼠，5.4±0.3克/天[n＝5]相对shRNA Grb10小鼠，5.9±0.5克/ 天[n＝6])的活动、每日食物摄入以及体重增加是相似的。在慢病毒注射 之后在对照组或实验组中均未观察到腹泻，并且胰腺(脂肪酶)和肝 (AST、ALT)的酶未增多(Doiron et al.,Diabetologia 55:719-728,2012)。 这些结果证实慢病毒注射技术没有引起不利的胃肠、胰腺或肝效应。

本发明人还构建和产生了表达葡糖激酶(GK)、Pdx-1转录因子和 靶向PTP1B的shRNA的慢病毒。对于所有实验，使用8周龄的雄性 C57BL/6小鼠(Charles River,Wilmington,MA,USA)并给小鼠维持随意 食用的水和常规食物。在用慢病毒载体注射后第1天，利用于PBS中的 BrdU(Sigma-Aldrich,St Louis,MO,USA)以50μg/g体重的剂量对小鼠 每天进行腹膜内(i.p.)注射持续12天以定量β细胞增殖。在慢病毒注 射后4周，将整个胰腺取出用于组织学检查。

至成体胰腺的体内直接施用可用于过量产生蛋白质或用于抑制蛋 白质的产生。总而言之，本发明人已开发了体内靶向成体胰腺的方法学 方案。该技术将用于促进β细胞形成的CNIP方法的有效性研究。上文 所述的慢病毒注射方法提供了成体胰腺可被直接靶向的概念的证据。使 用慢病毒方法来靶向/产生胰腺β细胞所获得的数据可通过使用小分子 和非病毒治疗剂来进行改良。

动物研究：对于所有实验，使用8周龄的雄性C57BL/6小鼠(Charles  River,Wilmington,MA,USA)并给小鼠维持随意食用的水和常规食物。 在用慢病毒载体注射后第1天，利用于PBS中的BrdU(Sigma-Aldrich,St  Louis,MO,USA)以50μg/g体重的剂量对小鼠每天进行腹膜内(i.p.) 注射，持续12天。在慢病毒注射后4周，将整个胰腺取出用于组织学 检查(见下文)。

免疫荧光和免疫组织化学分析：将成体小鼠胰腺组织通过浸入4％ 多聚甲醛-1％戊二醛的磷酸盐缓冲液中进行4℃过夜来固定并随后用 Tissues-Tek OCT化合物进行包埋用于冷冻切片。使用下列第一抗体： 抗-生长抑素(G-10)、抗-Ki-67(M-19)、抗-胰高血糖素(K79bB10) 和抗-胰岛素A(C-12)抗体和对照兔IgG(Santa Cruz Inc.,Santa Cruz, CA,USA)。对于增殖研究，用Ki67(M-19)抗体(Santa Cruz Inc.,Santa  Cruz,CA,USA)或用大鼠单克隆BrdU抗体(Abcam Inc.,Cambridge, MA,USA)染色胰腺组织。对于Ki67和BrdU抗体，通过在10mM柠 檬酸盐缓冲液中将切片煮沸10分钟随后冷却至室温30分钟来进行抗原 修复。用DAPI(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA,USA)对核 进行复染色。所使用的荧光二抗包括驴抗-山羊荧光黄、山羊抗-小鼠荧 光黄、山羊抗-兔德克萨斯红和驴抗-山羊德克萨斯红(Santa Cruz Inc., Santa Cruz,CA,USA)。β细胞面积代表除以用Olympus FV-1000激光 扫描共聚焦显微镜扫描的总胰腺表面的胰岛素免疫染色阳性染色的细 胞的表面积。使用Image J(National Institutes of Health,Bethesda,MD, USA)定量胰岛素阳性面积和总胰腺面积。将β细胞量计算为乘以胰腺 湿重的β细胞面积。对于每个条件分析至少3只小鼠。在慢病毒的注射 后第2天和第14天用H&E对胰腺组织进行染色以寻找炎症(胰腺炎) 的证据。

Western印迹：对于western印迹，在10和15％SDS/PAGE上分 离等量的总蛋白并将其转移至硝酸纤维素膜上。随后利用于0.1％TBS  Tween-20中的5％脱脂奶封闭膜，并利用针对Pdx-1(Cell Signaling  Technology,Danvers,MA,USA)、PTP1B(Abcam Inc.,Cambridge,MA, USA)、葡糖激酶(Santa Cruz Inc,Santa Cruz,CA,USA)和 GAPDH(G9545,Sigma Aldrich,St Louis,MO,USA)的特异性抗体进行 探测。随后用HRP缀合的第二抗体(NA934)温育膜并用化学发光试 剂(Amersham Bioscience,GE Healthcare,Pittsburgh,PA,USA)进行显 影。

统计分析：结果显示为平均值±SEM。在适当情况下，利用Students 非配对T检验或单向方差分析(one-way ANOVA)进行统计比较。当 p<0.05时，结果被认为是统计上显著的。