用于评估香料或香料混合物香味性能的方法

摘要

提出一种评估香料或香料混合物香味性能的方法，其中至少一种气味物与一种选自组包括OR1B1、OR2L8、OR4X2、OR4C16、OR5L1、OR8B4、OR8D2、OR10A6、OR10C1、OR12D2、OR524、OR4E2、OR4P4、OR4K2、OR4C3、OR5I1、OR10Q1的有机受体接触，并测定受体响应。

说明书

发明领域

本发明属于香味和气味领域并且涉及一种通过将香料或香料混合物暴露于特定的嗅觉受体评估和鉴别其香味性能的方法

背景技术

人类的嗅觉系统具有识别和区分大量不同化学成分和气味分子的优异能力。由于气味物质能够唤起记忆和情感或者影响我们的情绪，作为化学传感器的嗅觉系统有助于社会行为和性行为以及生活品质。

气味感知始于气味分子和在嗅神经(olfactory sensory neuron，OSN)中表达的嗅觉受体之间的化学相互作用。这些神经位于被粘膜层覆盖的嗅上皮(olfactory epithelium，OE)，该粘膜层为嗅上皮的表面提供富含液体/蛋白质的分泌物。人类鼻腔的大部分由纤毛柱状呼吸上皮组织构成。排布筛板的鼻腔上部由OSN组成。OSN是双极细胞，其具有单一无分枝树突(dendrite)和穿经筛板抵达大脑嗅球的轴突(axons)。僧帽细胞的轴突随后离开嗅球(OB)抵达高级脑区，包括梨状皮层(piriform cortex)，海马体(hippocampus)和杏仁孔(amygdale)。由每个OSN的球突伸出约10-25根纤毛，每根约5μm长。每个OSN仅表达一类嗅觉受体(OR)蛋白，其为化学-感觉转导主要过程的第一级。

嗅觉系统作为鼻部分子解码器的重要组成之一能够通过嗅觉受体区分数千种化学成分。OR，如视蛋白，苦味和甜味味觉受体(TAS2R1和TAS1R1)以及犁鼻器受体(V1Rs，V2Rs和V3Rs)，由大的基因超家族编码，属于G-蛋白-偶联受体(GPCRs)。它们由一些特征基序(sequence motifs)识别并构成哺乳动物基因组中的最大基因家族。GPCRs具有7个α-螺旋跨膜(TM)区的共同结构特征。它们可根据序列相似性分为6组，并且OR基因属于视紫红质类GPCR超家族中最大的一组。

基因超家族编组为18个基因家族和300个亚家族并且位于分布在除了20号染色体和Y染色体的所有常染色体上的不同尺寸的多簇上。两个最大的OR基因簇位于11号染色体，其中11q上有38个功能基因，11p上有44个功能基因。基于类似氨基酸序列的百分比，OR基因可以被编入特定家族并进一步编入亚家族。具有>40％蛋白序列同源性的OR被认为在相同家 族中，并且如果它们共有>60％，则属于相同的亚家族。根据这一概念，OR基因由雨果基因命名委员会(HUGO Gene Nomenclature Committee，HGNC)分类。

OR平均长度为约310个氨基酸。OR基因序列显示出跨膜螺旋3-6旁系同源基因的巨大多样性，可能引起配体特异性的高度多样性。有一些OR特征的功能域(motifs)。一种这类功能域是“MAYDRYVAIC’”，位于TM3与TM3和TM4之间胞内环(intracellular loop)的接合点。在该功能域内，三个氨基酸‘DRY’(天冬氨酸-精氨酸-络氨酸)的弹性，在视紫红质类GPCRs中高度保留。DRY功能域可能对G-蛋白偶联十分重要。可能在OR组库(repertoire)中，接触位置表现出旁系之间的显著变化。随后的研究已经尝试基于序列分析考察嗅觉受体中的气味结合残基。一些方法共同预测了22个位于其模型中TMs 3至7的假定接触残基。在最近的研究中，通过将动态同源建模与定点突变以及功能分析结合，提供了配体结合位点的分子模型，从而基于计算信息预测受体功能。

分离伪基因(分离伪基因，SPG)

人类OR含有大量伪基因，其中多于50％的基因位点(loci)由于框架破坏突变是无功能的。

人类的一部分嗅觉受体可以被分为嗅觉受体的完整形式和伪基因形式。换句话说，一些嗅觉受体基因同时表达功能和非功能等位基因(allels)，其被称为分离伪基因。它们被解释为人类群体中由于单一核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)的破坏分为完整基因和伪基因。这种分离突变可以引入终止密码子，或改变对于蛋白质适当功能重要的高度保留的氨基酸。

2003年由Gilad和Lanet第一次作出的研究(Mol.Biol.Evol 20(3),p.307-314(2003))显示了人体中的12个SPGs。其结果表明俾格米人(Pygmies，一种非洲人种)中完整等位基因的发生率大于高加索人种。同年Menashe等人(Nat.Genet.34(2),p.143-144(2003))推算出分离嗅觉受体伪基因在整个人类基因组中的数量至少为60。他们发现非洲裔美国人比非非洲裔参与者有更多功能ORs。当2012年Lancet的小组报道了个体间OR基因组库中异常高的遗传多样性，并认为单个人类有高度个人化的功能嗅觉受体“条形码”，SPGs的数量跃升至244。在Olender的研究中每个人类个体都通过这类SPGs的不同组合而个性化。最被接受的假设之一是OR基因的等位基因变异可产生不同的功能特征，这些特征可在人类群体中导致不同气味敏感表型(phenotypes)的产生。一项SPGs和气味敏感性的相关性研究表明OR11H7P基因形式与对异戊酸敏感性之间的高度相关 性，杂合或纯合的OR11H7P完整等位基因比纯合的被破坏的等位基因更可能对异戊酸高渗。可以提到去孤儿化ORs的潜在配体通常可用于相关性研究，从而确定单个嗅觉受体破坏和气味感觉多样性之间的详细关系。

拷贝数变异(Copy Number Variation，CNV)

由基因组重排引起的CNVs可借助不同的分子机制，如基因计量，基因阻断，基因融合和位置效应或隐性等位基因的解隐藏(unmasking)，产生表型。CNVs与表型之间的一些相关性包含于人类疾病之中。最知名的例子是由人类21号染色体三体化导致的唐氏综合症；另一个例子是由于阿尔法珠蛋白基因重排导致的地中海贫血症。

CNVs已经被定义为“1kb或更大的DNA片段并且与参比基因组相比表现出改变的拷贝数”。基于功能定义该解释被改变，并且有人建议我们应当选择平均的外显子尺寸(～100bp)作为定义CNV的参数。拷贝数变异是人类遗传多样性的根源。当缺失，插入或复制的断点位于功能基因中，它可能阻断基因，并通过如红绿视蛋白基因所表达的基因失活导致功能缺失和色盲。

在全基因组研究中，检测了大量OR基因或基因簇的CNVs。在之前的研究中，系统研究了OR基因的个体CNVs。在大约50个人类个体的小组中确定了18个ORs的拷贝数变异。除了参比基因数据没有一个个体具有全部数量的功能OR基因并且几乎每个个体都有ORs功能缺失和获得的独特组合，因此说明CNVs产生了OR基因的个体模式。在Waszak进行的研究(PLos.Comput.Biol.6(11)pp e1000988(2010))中报道了包括CNVs和SNPs的有害变异分别影响了15％和20％的人类OR基因组库。他们揭示了OR基因位点在个体中通过OR基因位点中0至9次拷贝表现出大范围的位点拷贝数。Olender在2012年的研究表明完整基因位点的CNVs数量增加至66％。他们报道了在851个人类基因组OR基因位点中，438个具有显然固定于整个人类群体中的框架破坏伪基因。剩下的413个基因位点中，271个(66％)在完整开放的阅读框架上含有至少一个等位基因缺失，包括框架破坏和CNV等位基因缺失。

这些拷贝数变异的出现可以通过基因复制或外显子改组，导致特定基因家族中以及在全基因组范围上的基因组结构变异。因此，CNVs可能是人类个体间嗅觉能力显著差异的原因之一。然而，CNV与气味感知之间的关系仍未评估。

嗅觉信号转导途径

在哺乳动物OSN中信号转导的经典途径由作为变量成分的OR和四个常量成分组成：含Gαolf的异三聚体G蛋白；腺苷酸环化酶，其产生第二信使cAMP；环核苷酸门控阳离子通道和钙激活氯通道。嗅神经通过被称为Gaolf的特定亚基表达G-蛋白。Gaolf通过激动子结合至OR激活嗅觉特异腺苷酸环化酶，其导致cAMP的活化。该级联(cascade)后通过提高cAMP水平打开环核苷酸门控通道。钝性OSNs通常在其质膜上保持约-65mV的静息电位(内部相对于外部)。通道开孔通过钠离子(Na+)和钙离子(Ca2+)流入使神经元膜去离子化。Ca2+-流也使Ca2+-依赖-Cl-通道打开，其增强了细胞膜的去离子化并产生沿着感觉轴突的作用电位，使信号传输至嗅球。

腺苷酸环化酶(AC)/cAMP途径对脊椎动物的嗅觉反应至关重要。然而气味物激活了多余一个的转导级联；IP3也被证明是有效的第二信使。多嗅觉信号途径这一概念出现的关键是在生化分析中观察到一些气味没有引起cAMP的增多。该“非-cAMP气味”反而在嗅觉细胞中引起磷酸肌醇信号。对于不同物种已经报道1,4,5-三磷酸肌醇(InsP3)也可能参与嗅觉。2005年这一问题得到解释，不同人群中磷酸酰肌醇相关信号蛋白，包括磷脂酶C beta 2(PLC b2)，InsP3-III型受体(InsP3R-III)和经典的瞬时受体电位通道6(TRPC6)，共局限于哺乳动物嗅上皮中的一种微绒毛细胞。它们表明在哺乳动物嗅上皮存在一类新的第二化学感受细胞，其使用磷酸酰肌醇作为信号转导中的第二信使。

然而，据报道不同的化学成分在体内能够激活cAMP途径或IP3途径或者两种途径。但是在异源细胞系统中进行的体外实验的关联现在仍不清楚。

异源系统中重组嗅觉受体的功能表达

由于缺少适当的用于表达和检测气味响应的异源系统对OR功能的理解发展缓慢。GPCRs的表达是一个复杂的过程，包括蛋白质折叠，翻译后修饰，和通过细胞腔隙，包括内质网和高尔基体，运输。ORs功能表达不足的一个主要原因是受体没有到达异源细胞的细胞膜。它们由于低效折叠和与出口组织的较差耦合，再结合通过蛋白酶体途径和自噬途径的聚集和降解，停留在内质网上。

过去10年的研究已经发展出在异源系统中表达ORs。已经做出一些尝试以实现ORs在异源系统细胞膜上表达。在有些情况下，20个视紫红质或血清素受体的N-终端氨基酸融合至ORs的N-终端区域导致功能ORs在质膜上有限表达并在异源系统中，如HEK293细胞，引发成功的气味响应。已经表明适当异位到质膜需要ORs的N-终端糖基化。在异源细胞中标记的 ORs可以与Gα亚基共转染。分离的Gα和Gβγ亚基激活各种效应子，包括腺苷酸环化酶，磷脂酶和质膜通道。Gs和Gq偶联信号途径的初级效应子分别是腺苷酸环化酶和磷脂酶C(Chen et al.1995)。Gs亚基通常包括腺苷酸环化酶的活化和通过放射免疫法测定cAMP的浓度，而Gq亚基的活化通常通过测定由磷脂酰肌醇-4.5-二磷酸产生三磷酸肌醇或甘油二酯或通过细胞内钙的变化检测。

另一个协助运输ORs至细胞膜的重要辅助因子是受体转运蛋白(RTPs)1和2以及受体表达增强蛋白(REEP)1。一种被称作OR伴侣的跨膜蛋白，RTP1，表现出增强ORs的细胞表面表达，并且许多ORs通过与RTP1共表达而去孤儿化。

一些G-蛋白激活增强子与ORs共表达以改善嗅觉信号转导。鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)能够提高G-蛋白的活性。作为已知的在嗅感神经中表达的GEF，Ric-8B能够与Gαolf相互作用。GEF催化GDP转化为GTP产生能够活化各种效应子的活化形式的Gα。Ric-8A和Ric-8B是哺乳动物嗅觉系统中的GEF。Ric8A能够与Gα亚型，Gαq,Gαi和Gαo相互作用，Ric-8B与Gαs型相互作用。已经表明Ric-8(A和B)促进ORs在异源系统中的有效功能表达。同样已经表明Ric-8A的豆蔻酰化序列共轭突变体(Myr-Ric-8A)能够用作信号放大器，并且Myr-Ric-8A极大的增强了HEK293细胞中Ga15-介导的对ORs的Ca2+响应。作为在HEK293细胞中增强OR-介导的Ca2+信号的辅助因子，Myr-Ric-8A通过使用Ca-成像应当有助于ORs在异源细胞中的功能表达。

此外，Hsc70蛋白的存在能够支持ORs的表达。属于Hsp70基因家族的Hsc70仅在小鼠精子中减数分裂后表达。此外，它可参与嗅觉受体的折叠或转运(trafficking)。与小鼠和人类的Hsc70t和嗅觉受体共转染的HEK293细胞表现出显著增强的OR表达。Hsc70t表达也改变了在细胞表面功能表达嗅觉受体的细胞数量，从而极大地提高了在Ca-成像实验中响应气味物的细胞数量。

因此，引入OR表达所需的因子是指，作为OR检测的临界水平，ORs细胞表面表达可以通过与参与OR转运至细胞表面的辅助蛋白共表达显著改善，并且预期这些蛋白解决了ORs细胞表面表达的问题。

气味感受

气味物是一种能够能够引发嗅觉响应的物质，而气味是源自嗅觉器官刺激的感受。气味在我们每天的生活中扮演重要部分，从食欲的刺激到用作警告信号。气味物的一般标准为：它应该是挥发的，疏水的并且分子量小于约300道尔顿。在解释气味感受时应注意气味阈(odor  threshold)。该术语用于确定在气味重复出现的百分之五十的时间内动物(人类)对特定气味物反应的最低浓度。

气味阈在个体人类之间变化很大，并且其根据效率和亲和力基于气味的的强弱程度而分类。

气味物感知通常发生在不同气味分子的复杂混合物。例如玫瑰的气味由260种化学成分构成。在一些感觉模式中，混合刺激的幅度被认为是单个刺激幅度的总和；这一性质已知为可叠加性(additivity)。预估的两种气味物混合物的气味强度通常被认为是不可叠加的。这一现象被称为“相互抵消(counteracting)”。存在三种相互抵消类型：“部分叠加，其中混合物比气味较强成分气味更强烈；折中，其中混合物的气味强度介于各成分强度之间；以及补偿，其中混合物的气味比气味较弱成分的更弱”。

过去许多理论已经提出描述闻气味物的机理，没有一个发现嗅觉受体，但是生物认识的进步已经逐渐将它们排除。理论之一是物理理论，提出气味分子的形状决定了哪些嗅觉受体细胞将作出反应。该理论基于分子形状和分子振动部分。

气味的化学结构基础

为了了解气味物和受体之间的关联，有必要知道气味物或气味描述符(odor descriptors)的哪些性质对于与嗅觉受体的相互作用是至关重要的。已经提出大部分嗅觉受体对多种气味有响应。尽管在许多发面不同，它们应该共有某些分子性质如官能团。这些性质大多倾向于气味物的化学结构，碳原子数(CAN)，官能团种类和位置，这些作为气味描述符的一部分已经在最近的嗅觉研究中得到确定。不同的研究已经表明嗅感神经对具有相似CAN的分子有反应，无论这些分子是否共有相同的官能团。对有5个碳原子的气味物反应的ORs对具有4或6个碳原子的气味物表现出相似的响应，但是对具有7个或更多碳原子的反应物基本响应。这意味着具有相似CAN和官能团的气味物引起类似的响应模式。对于官能团，使用90种具有不同化学结构的气味物测定一种小鼠嗅觉受体(I7)表明羰醛基对于气味物在I7受体上的活性至关重要。使用果蝇(Drosophila melanogaster)嗅感神经和100种具有不同官能团的气味物也进行了相似的实验。

应当注意并不是所有的气味物描述都与化学结构相关，在一些实施例中，气味的概念不能通过结构说明。两个著名的实例是麝香(musks)和龙涎香(ambers)。

麝香是最著名的气味物之一。由于其广泛用于香料中并由于其费用和法律规定，人工合成麝香已经很长时间。表现麝香气味性质的分子结 构十分不同。另一组气味物是原本由鲸鱼产生的龙涎香。龙涎香是具有明显不同结构的密切相关的气味的有趣结合：特木倍醇(Timberol)，卡拉花醛(karanal)和柏木甲醚(cedramber)非常相似以至于调香师也会偶尔将它们混淆，例如龙涎香中的以下分子，结构非常不同但具有相似的气味感受。

另一方面也存在气味完全不同的对映异构体，一个实例是R和S香芹酮，R-香芹酮是薄荷味，S-香芹酮是香菜味。

以下异构体也对气味物强度有影响：

示出的是以下分子：1-氨茴酸甲酯，2-桉叶油醇，3-neron，4-对孟烷衍生物，5-caparrapi氧化物，6-虹彩烷(iridanes)。在所有情况中强异构体在左侧而弱异构体在右侧。

与嗅觉系统的响应一致，Wetzel报道了受体仅对极低浓度的新洋茉莉醛(helional)有响应，但对具有非常相似化学结构的胡椒醛无响应(J.Neurosci.19(17)p.7426-7433(1999))。

嗅觉障碍

气味感受是不同个体之间最多变的感受。这种变化在嗅觉障碍和正常生理变异如特定嗅觉丧失中反应。

嗅觉障碍在人类群体中的分布是一个有争议的问题。然而，大多数的研究表明化学感受障碍的发生率为1％至3％。作为嗅觉障碍发生的因素报道了不同的原因。嗅觉障碍的主要原因之一是直接影响和损害嗅上皮或嗅觉途径的过程。嗅觉障碍可以被归为以下不同的种类：

1)嗅觉丧失：缺少嗅觉感受和完全没有嗅觉功能；

2)部分嗅觉丧失：能够感受到一些，但不是所有气味物；

3)嗅觉减退(hyposmia)或缺乏(microsmia)：对气味物的敏感性的一般降低；

4)嗅觉过敏(hyperosmia)：不正常的敏感嗅觉功能(提高的嗅觉感受)，伴随着对所有气味物的敏感性增强；

5)嗅觉失认(olfactory agnosia)：不能识别一种气味感受；

6)嗅觉障碍(恶臭幻觉(cacosmia)和嗅觉倒错(parosmia))：一种正常愉快的气味被认为是难闻的气味；

7)幻嗅觉(phantosmia)：在没有气味刺激下体验到嗅觉障碍的感受；

8)特定嗅觉丧失：在其他普通气味感受的存在下不能闻到一些气味物中的一种。

特定嗅觉丧失 

特定嗅觉丧失的主要理论是由Marcel Guillot于1984年在其标题为“Anosmies partielles et odeurs fondamentales”的文章中提出。AMoore使用新的术语部分代替“特定嗅觉丧失”，并解释其为“具有正常嗅觉敏感度的人却不能感受其气味浓度对其他大多数人很明显的特定化合物的情况”。在补充描述中解释了特定嗅觉丧失，最常见的是人对给定的气味物具有10-100倍降低的敏感度，在这一范围之外则为特定嗅觉减弱的确切定义。Amoore指出第一例嗅觉丧失缺陷是对异戊酸，1-吡珞啉，三甲胺，异丁醛，5α-雄甾-16-烯-3-酮和十五酸内酯。

嗅觉丧失的一个已知实例是雄甾烯酮(5α-雄甾-16-烯-3-酮)，其特定嗅觉丧失比例为30％，一些具备正常嗅觉感受的人无法在检测浓度下感 受到雄甾烯酮的味道，而那些能够感受到的人则以不同的方式描述这种气味：汗味，尿骚味，麝香味，甜味，或者甚至类似香水的味道。

对于一种给定气味物的性质描述符的不同被称为特定allosmia，而术语特定嗅觉丧失描述了一些人无法闻到一种气味。因此，感受雄甾烯酮同时是特定allosmia和特定嗅觉丧失的实例。

遗传学家对闻到雄甾烯酮的能力感兴趣，因为预期到个体差异可以由特别精调整的嗅觉受体中的有害等位基因解释，并且各种研究表明对雄甾烯酮的嗅觉丧失在同卵双胞胎中特别一致，闻到雄甾烯酮的能力是遗传特征。这一假设被证明是部分正确的。一个新的方法显示人类OR基因OR7D4中的两种非同义(non-synonymous)SNPs的结合导致了19-39％的雄甾烯酮敏感性和性质感知的不同。该研究发现具有至少一个WM拷贝的样本比那些不携带WM等位基因的样本对雄甾烯酮的敏感性更弱。这些结果第一次提出OR遗传变异和气味感知之间的关联。

不仅对雄甾烯酮，而且对异戊酸，芦笋代谢物和顺式3-己烯-1-醇也观察到嗅觉受体等位基因和感知之间的关联。异戊酸是证明人类特定嗅觉丧失的第一波证据之一(Russell et al.1993)。遗传研究显示了异戊酸敏感性和人类14号染色体上的分离OR伪基因OR11H7P这一基因型之间的关联。同样在早期研究中表明遗传决定了对作为麝香气味物的十五酸内酯的敏感性。

对于特定嗅觉丧失和遗传变异之间关系的课题，可以推测如果一种气味物由一种特定OR识别，该OR的突变可能导致对该气味物的特定嗅觉丧失，但如果该气味物由多于一种OR识别，则特定嗅觉丧失不会发生，除非所有相关ORs都突变。然而，应当注意这些遗传关联不能完全解释特定嗅觉丧失。嗅觉敏感性可以受到性别的影响，或者一些环境和习惯因素也被认为影响嗅觉过程。

总结现有技术可以知道气味物和嗅觉受体之间的相互作用是气味物检测中的关键步骤。嗅觉受体是最大的一组G蛋白-偶联受体。在世界范围内存在着这些带有假定会影响其功能的遗传变异的受体。然而，在数以千计中气味物中仅有一小部分的激动子被确定。由于这种明显的复杂性，受体-配体配对的确定过去和现在都仍处于起步阶段，并且到目前为止仅有极少数的人类同源受体-配体配对已知。嗅觉系统一般性质的阐释，如一些气味物和ORs之间一般相似性的确定，需要在不断测定分析中使用化学不同的气味物研究大量不同的ORs。可以使用的人类基因组的完整序列和由1000个基因组计划及其他源头得到的无数SNP的定量数据提供了大量机会将嗅觉表型与气味受体基因的基本型(underlying genotype)相关联。

因此本发明解决的问题是将特定嗅觉丧失(不同人类群体所面临)与潜在基因突变相关联并研发一种方法用于评估香料或香料混合物香味性能，特别是对于那些已知仅被一小部分个体识别的产品。

本发明的另一个目的是确定去孤儿化受体以解决一些不同的问题，如气味物相似度的量化，受体相似度的量化以及由为识别少数气味物精调整或为识别多种气味物宽调整的ORs构成的气味物的受体代码。

发明内容

本发明的目的是一种评估香料或香料混合物香味性能的方法，其中至少一种气味物与一种选自组包括OR1B1、OR2L8、OR4X2、OR4C16、OR5L1、OR8B4、OR8D2、OR10A6、OR10C1、OR12D2、OR524、OR4E2、OR4P4、OR4K2、OR4C3、OR5I1、OR10Q1的有机受体接触，并测定受体响应。

令人惊讶地观察到所述ORs能够对一种或多种气味物响应，仅能被一小部分个体识别的那些气味物。

包括SPGs和CNVs的ORs大规模研究

已知OR基因受体是人类基因组中最易遗传突变的区域之一，并且其包括数以千计的尺寸大于1Kb的DNA片段的缺失或复制(CNV)，这仅在一些个体中存在但不在其他个体中存在，以及大量单一核苷酸多态性(SNPs)，其中一些导致OR基因的失活(即分离伪基因)。

通过关注具有破坏其编码区和其功能的普遍突变的嗅觉受体基因的子集，由现有技术已知人类嗅觉多样性的遗传基础。由于在人类群体中这些基因与其完整基因共同存在(因此被称为分离伪基因，或SPGs)，它们可能是解释人类在气味识别中差别的有希望的候选者，以找出遗传变异与作为一种人类气味感知中的表型变异的嗅觉丧失之间的相互关系。在本研究中我们关注遗传多态性气味受体的大规模分析。

如在一些研究中所述，在OR遗传变异和气味感知之间存在关联。特定嗅觉丧失被认为源自嗅觉受体基因突变；然而，人群中仍然没有基因变异与特定嗅觉丧失相关联。人们怀疑编码作用于气味识别前沿的嗅觉受体的基因的突变，可以解释观察到的人类识别气味能力的显著差异。在一些实例中已经说明由于SNPs的OR变异是这类差异的主要原因。同样指出SPGs对于人类气味感知的多样性具有潜在贡献。对于这些性质，选择了40种孤儿SPGs和34种最丰富的CNVs并使用与嗅觉丧失相关的气味检测。通过钙成像技术我们确定了对应18个人类ORs，包括SPGs和CNVs 的32种激动子。结果显示与嗅觉丧失相关的气味激活了40种SPGs中的12种ORs(30％)，34种CNVs中的6种ORs(18％)。

在部分研究中，OR1B1、OR2L8、OR4X2、OR8D2和OR8B4被去孤儿化作为对下述气味物分别具有33％、22％、16％、50％和26％次要等位基因频率(minor allel frequency，MAF)的SPGs(SNPs的MAF作为高度保留的氨基酸的点突变)，气味包括3-羟基-2-甲基-4-吡喃、西瓜酮(Calone)、雄甾烯酮、睾酮、Yasamber、Timbrol,2-氨基苯乙酮、茴香醛、C6醛类、C6醇类和；铃兰醇(Muguet alcohol)。在所有气味物中，雄甾烯酮是表征最佳的化学成分之一。据报道雄甾烯酮(5α-雄甾-16-烯-3-酮)是由睾酮衍生的有气味的类固醇，并且不同的个体感知不同，如讨厌的(“汗味，尿骚味”)，好闻的(“甜味，花香”)或无味。基于研究11％至75％的人无法感知雄甾烯酮的气味。这种感知雄甾烯酮的能力的多样性可能说明感知雄甾烯酮部分是由遗传决定的。如一些家庭研究已经显示，同卵双胞胎比异卵双胞胎的雄甾烯酮阈更相似(分别为0.95和0.22)，并且也报道了闻到雄甾烯酮能力的一致性，同卵双胞胎比异卵双胞胎明显更高(分别为100％和61％)。此外已知人类气味受体，OR7D4，在体外被雄甾烯酮和相关的有气味的类固醇雄甾二烯酮(雄甾4,16二烯-3-酮)选择激活。我们的结果显示在所有遗传变异的74种ORs中，仅有OR1B1对雄甾烯酮响应。作为分离伪基因的OR1B1在人体中表现出功能和非功能的等位基因，这使其成为解释人类群体中雄甾烯酮感知多样性的优异候选基因。

在SNP数据库中对OR1B1多态性的搜寻确定了发生率大于25％时受体中出现三次SNPs。在使用雄甾烯酮作为用于OR1B1-WT的适当配体的重组表达系统中，我们研究了OR1B1-574、OR1B1-688和OR1B1-789受体变异的配体特异性。OR1B1-574是OR1B1的突变形式，其以33％的发生率将OR1B1的活性基因转化为伪基因(精氨酸变为终止氨基酸)。OR1B1-688和OR1B1-789是错义SNPs。OR1B1-688和OR1B1-789与OR1B1-WT相比，在激发对雄甾烯酮和睾酮响应中没有表现出任何显著差异；然而，OR1B1-574表现出在SNP的574位置上突变，其将氨基酸变为胞外环2并将OR1B1转变为伪基因，严重损害OR1B1的功能。应当注意OR1B1对雄甾烯酮响应，并且此外也对3-羟基-2-甲基-4-吡喃和西瓜酮响应，因此被不能认为是雄甾烯酮的特定受体，但是其他73种ORs对这种气味没有响应。这一结果能够提供OR1B1基因(作为SPGs)多态性与表型变异之间的关联。我们的结果还说明一种气味物可以激活多于一种受体。因此在假设多受体对雄甾烯酮响应下，雄甾烯酮嗅觉减退可以反映特定嗅觉受体的全部缺失，或数量/密度减少。然而我们的结果没有排除特定雄甾烯酮嗅觉减退作为关键点有助于考察气味辨别的遗传基础。

尽管环十五酸内酯(ω-cyclopentadecalactone)已知为与特定嗅觉丧失相关的气味物，没有嗅觉受体表现为用于感知环十五酸内酯的去孤儿化受体。最近的研究已经表明家庭内对于环十五酸内酯的特定嗅觉丧失遵从简单的孟德尔遗传模式，并且特定嗅觉丧失的原因被解释为一种嗅觉受体蛋白的可遗传缺陷。我们在此将OR10Q1作为CNV组中的一个对麝香组中气味物环十五酸内酯响应的OR。对比分析指出作为用于环十五酸内酯的去孤儿化受体，OR10Q1和OR4K2的遗传变异与人类群体中环十五酸内酯的特定嗅觉丧失比例不同(表4.1)。在所有76种嗅觉受体中，包括SPGs和CNVs，CNV组中的三种嗅觉受体对麝香组响应。例外是对环十五烯内酯(Globalide)响应的OR4P4，其在人类群体中的缺失率为40％，以及对环十五酸内酯响应的OR10Q1和OR4K2。可以推断，至少分离伪基因在环十五酸内酯和环十五烯内酯麝香气味物的表型多样性不起作用。同样OR10Q1对环十五酸内酯的亲和力通过重叠延伸PCR变异反应。使用MAF>10％根据独特的单一核苷酸变异产生变异的OR10Q1。我们研究了在体外使用环十五酸内酯作为用于OR10Q1的适当配体，OR10Q1-540(突变变种)和OR10Q1(野生型)受体变种的配体特异性。突变变种与OR10Q1-WT相比没有表现出任何显著的差异。

对于大多数涉及不同类的嗅觉丧失的气味物仅有有限了解。这种关于嗅觉丧失的数据缺失导致在不同群体中寻找遗传突变和气味感知之间关联的困难。然而，一些特定的气味物(异戊酸、1-吡珞啉、三甲胺、异丁醛、5α-雄甾-16-烯-3-酮和十五酸内酯)作为初级气味物被测定。在这些确定的初级气味物中我们确定了一些与异戊酸、异丁醛、5α-雄甾-16-烯-3-酮和环十五酸内酯相关的ORs。遗传变异率和可能的感知多样性在表A中比较：

表A

比较嗅觉受体的遗传突变率与嗅觉丧失出现率

对比分析指出OR1B1的遗传变异在尿骚味嗅觉丧失中起重要作用，而OR4K2(54％)、OR10Q1(0.6％)和OR12D2(37％)的遗传变异与麝香味(12％)、麦芽味(36％)或汗味(3％)的特定嗅觉丧失比率相比是不同的。然而这一分析是基于“特定嗅觉丧失和初级气味物概念”的理论。

根据本结果，OR2L8对Ysamber K和Timbrol响应。根据实验结果，25％的气味物(32种的7种)对多于一种ORs有响应，在表B中列出：

表B

对多于一种ORs有响应的气味物

气味物 嗅觉受体 Ysamber K OR2L8；OR4K5 十八烷醛 OR4C16；OR5L1 Β-大马酮 OR5L1；OR4C3 己醛 OR8D2；OR10A6 铃兰醇 OR8D2；OR10A6 2,4,6-trichloranisole OR52B4；OR4E2 3-苯丙醛 OR4E2；OR4K2

根据上述观点，通过收集ORs和考虑人类具有ORs与巨大个体间变异的特定结合，检测到的气味物，可以认为嗅觉系统产生了涉及不同种类嗅觉丧失的气味感知表型变异的巨大潜力。SNPs转译为单个ORs可能不能进行关于人类群体中气味感知的平面预测。

根据关于ORs与遗传多态性大规模研究的目标，我们提供更多的去孤儿化受体以获得对于嗅觉受体与化学成分之间关联的更好理解。在我们的研究中我们筛选了大约20％的人类呼吸嗅觉受体作为SPGs和CNVs，从而可以预期在未来对相似气味物响应的嗅觉受体数量将增多。同样，在本检测中特定气味受体的响应缺失必须谨慎解读，因为它可能反映在本检测中嗅觉受体功能缺失而不是缺少检测气味的敏感性。

总之，鉴于去孤儿化嗅觉受体的总数，应当注意尽管开始时使用数量大致相似的SPGs和CNVs，我们确定的对于SPGs的激活剂的数量大于CNVs的两倍。这一结果与目前的知识一致，即每个人类个体的特征在于这类分离伪基因的不同组合，产生人类群体中的基因多样性，并且指出了SPGs在与不同嗅觉丧失相关的基因变异中的重要作用。鉴于近期对于 人类个体中完整和不完整等位基因与CNV和SPGs的特定结合，其导致每个人具有功能嗅觉受体的高度个性化条形码，与我们的去孤儿化受体以及SPGs和CNVs之间的不同气味物相结合，使其易于解释气味感知的不同模型。

宽调整和精调整嗅觉受体

一些嗅觉受体是“多职能的”，其结合各种配体并表现出宽泛的识别能力以及结合腔大的可塑性，而其他受体被称为“专职能的”，其精调整至对应少量配体。目前的研究结果显示我们使用的77％(14/18)的受体是宽调整并且不仅对一种特定的气味物或化学成分响应。气味感觉使我们感知环境中存在的挥发化学物质。大量的气味分子能够被人类的鼻子精确了解。为此，我们的嗅觉感知通过使用有限数量的活性ORs感知各种各样的气味物和化学成分。我们通过包括少于400个受体的组合代码感知气味。随后，如本发明所示，我们的大部分受体可能宽调整并且不只对特定气味物响应。OR结合腔的可塑性使得各种配体能够与不同的残基相互作用，并且嗅觉受体可适用于不同的化学结构。因此宽调整OR使通过有限数量的功能受体感知无限气味物的解释成为可能。

应当注意ORs表现为负责特定气味物(4/18)并且能够对多种化学成分响应，但是由于在我们的研究中使用的气味物数量少，我们无法给出其他可能的气味物。

香味和化学 

结构-气味的关系复杂并且一些气味的描述如味道或气味质量通常无法由其分子结构预期。据报道嗅觉受体感知气味分子的一部分而不是分子的整个形状。按照这种观点实验数据表明大多数的气味物对一种具有相同功能团的OR响应。在OR感知气味物中化学官能团和碳原子数(CAN)可能比化学结构的相似性更重要。同样已知官能团基本决定了气味物的特点，但应当注意的是仅仅是官能团的存在不能解释分子的气味。

单个ORs与感知的气味特征之间的潜在关联的实验结果可归为三种不同的组别。

a)ORs仅对一种气味物响应：OR4X2、OR4C16、OR5I1和OR10Q1分别对2-氨基苯乙酮、C18醛、Octanal和十五酸内酯响应。第二，ORs识别的共有特定化学描述符如官能团或气味品质的气味物，如OR2L8和OR4K5仅对龙涎香组响应而OR5L1对具有水果性质的气 味物响应。在实验中，64％(9/14)的ORs对多于一种具有相似官能团或相同气味性质的气味物响应。由许多研究已知碳原子数是重要的气味物描述符。

b)35％(5/14)的对多于一种化学成分响应的ORs对具有相似CAN的气味物响应。OR4E2对CAN为9至11的气味物响应；OR2L8和OR4K5仅对CAN为15至17的气味物响应。具有低或高CAN(6<CAN<12)的气味物由允许数量的去孤儿化气味物组成。应当注意多数已知的气味物如麝香、龙涎香或雄甾烯酮具有大的CAN。

c)对不共有常见描述符的气味物响应的ORs。OR52B4、OR4P4、OR4K2和OR4C3在此类中。除了OR12D2我们无法找到任何其他仅对具有相似化学形状的气味物响应的OR。但是应当注意OR12D2的所有配体属于羧酸组并且共有相同的官能团。例如，在所用的18种去孤儿化ORs中只有OR12D2对具有相似官能团的结构相关的气味物响应。

在平行研究中筛选出对麝香气味物与其他麝香组中类似气味物响应的所有ORs(OR4P4、OR4K2和OR10Q1)，所述其他麝香组中类似气味物包括以下种类：

但是在这种情况下无法检测到化学结构相似性与OR在麝香组中响应之间任何显著相关性。

鉴于我们的结果，尽管不能排除对非相关气味物响应的第三组，在大多数情况下这些发现与如下想法相一致，即与气味物化学结构的整体形状相比，单个ORs可以对特定气味描述符如化学基团，气味品质(气味感知如薄荷味，水果味，木头味或麝香味)或CAN相互作用或响应。在这些气味物描述符中官能团可能比碳原子数更重要。

在本发明的过程中发现1种OR可以识别多种具有相关官能团的气味物，而一种气味物由不同受体识别。例如OR8B4和OR8D2被铃兰醇激活，而C6醇引起OR8D2和OR10A6的响应。发现C6醛、C6醇、Graniol和Octanal作为OR2W1的配体；也发现Graniol作为OR2M7的配体。发现OR51E2和OR51L1分别是丙酸和正己酸的受体。此外，在基于遗传的研究中确定OR11H4、OR11H6和OR11H7是异戊酸受体。尽管不是所有气味物都能激活多于一种OR，但与之前的去孤儿化结果结合，很明显ORs和气味物之间的关联很复杂并且一个气味物可以激活多于一个受体，根据已知为“结合编码”的假设使通过ORs的不同结合感知无数气味物成为可能。

5α-雄甾-16-烯-3-酮(尿骚味)和十五酸内酯(麝香味)分子

选择5α-雄甾-16-烯-3-酮和十五酸内酯分别作为尿骚味和麝香味气味物的参考气味物。这两种气味物具有在相同范围内的分子量和相似的官能团取向并且还具有相同的分子厚度。但是雄甾烯酮分子更长且更窄，而十五酸内酯更短且更宽。可以认为这些区别是导致人类嗅觉器官中尿骚味和麝香味之间差异的源头。在实验中我们发现不同的受体可以是负责雄甾烯酮和十五酸内酯的ORs。ORs对这两种初级气味物响应的区别可能是识别机理的一部分。

同样，在平行研究中表明OR1B1(为雄甾烯酮去孤儿化)对雄性激素组的类固醇激素睾酮响应。雄甾烯酮是类固醇以及睾酮的代谢产物。睾酮和雄甾烯酮具有相似的化学结构和相同的CAN。

有意思的是睾酮部分由肾上腺分泌。HORDE数据库显示OR1B1在肾上腺中的表达。同样表明OR1B1在前列腺和脑组织中表达。

附图说明

图1示出了克隆Ors。

图2示出了通过重叠延伸PCR产生OR1B1和OR10Q1突变体。

图3示出了视紫红质-标记。

图4示出了Ca-成像检测。

图5A-B示出了嗅觉受体对与特定嗅觉丧失相关个体气味物的显著响应。

图6示出了通过Ca-成像和CRE-荧光素酶激活OR10Q1和OR2L8。

图7示出了具有相似化学结构的麝香物不产生相同响应。

图8示出了具有相似化学结构的麝香物不产生相同响应。

图9示出了已知为SPGs或CNVs的74中嗅觉受体的系统树图。

图10示出了已知为SPGs的74中嗅觉受体的系统树图或作为去孤儿化气味受体的特定变异区域的TM3-TM6的系统树图。

图11示出了对HEK293细胞中异源表达的受体进行的Ca-成像测试检测时，OR1B1-574与OR1B1WT相比，对雄甾烯酮和睾酮的响应。

图12示出了对HEK293细胞中异源表达的受体进行的Ca-成像测试检测时，OR1B1-688和OR1B1-789与OR1B1WT相比，对雄甾烯酮和睾酮没有显著不同的响应。

图13示出了对HEK293细胞中异源表达的受体进行的Ca-成像测试检测时，OR10Q1-614与OR10Q1WT相比，对十五酸内酯响应相似。

具体实施方式

A.材料和方法 

A1.DNA结构和质粒 

人类ORs(SPGs/CNVs)通过使用特定引物的PCR由人类人基因组DNA放大，其放大全部开放阅读框并包含用于进一步亚克隆为pCI表达载体(invitrogen)的限制酶切位点(EcoRI、NotI、ApaI和SalI)。放大的ORs在Rho-标记pCI载体的多克隆位点克隆(图2.1)。使用100ng基因组DNA和用于人类嗅觉受体的特定引物进行PCR反应。产生的质粒通过测序查证。使用引物3plus软件，基于参数包括55和65℃之间的Tm值(melting temperature)，30％和70％之间的GC-含量和18至28之间的长度bp(表2.1)设计引物(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/引物3plus/引物3plus.cgi)。选择与pCI-载体中限制酶切位点一样的限制酶切位点。使用Webcutter 2.0软件控制(http://users.unimi.it/～camelot/tools/cut 2.htm)以确保限制核苷酸位点与目标基因中的任何限制核苷酸位点都不相同。

表达辅助因子RTP1被共转染以支撑重组ORs在细胞表面的表达。其他辅助因子Gα15、Myr-Ric8A、和HSC70同样被共转染用于由OR活化产生的嗅觉信号的扩大。通过使用包括Myr位点的Ric8A引物(Yoshikawa,Touhara 2009)并将PCR产品克隆至pcDNA3载体产生Myr-Ric8A。在构建Myr-Ric8A中使用的正向和反向引物如下：

gcatatGAATTCACCATGGGTAGCAACAAGAGCAAGCCCAAGGATGCCAGCCAGCGGATGGAGCCCCGGGCGGTTGC 

作为包含EcoRI限制酶切位点的正向引物

gcatatGCGGCCGCTCAGTCAGGGTCCGAGTCAGGGT作为包含NotI限制酶切位点的反向引物。

图1示出ORs的克隆。

A)含Rho-标记的pCI表达载体(Invitrogen)作为前导肽序列。

B)通过PCR使用100ng基因组DNA和用于人类嗅觉受体的特定引物放大ORs。选择与pCI-载体中限制酶切位点相同的限制酶切位点。

C)产生的重组质粒通过测序查证。

A2.重叠延伸PCR突变

通过重叠延伸PCR(OEP)将突变引入OR1B1和OR10Q1(表2.2)。以下表2.1显示用于OR1B1和OR10Q1基因定点突变的引物。侧翼引物(Flanking primer)与内引物结合提供突变基因片段，全长引物包括用于进一步克隆为pCI表达载体的EcoRI和NotI限制酶切位点。基于核苷酸次要等位基因频率选择定点突变。

表2.1

用于定点突变引物

在通过重叠延伸PCR方法的突变中，初始PCRs提供突变基因片段，随后与携带所需点突变的重叠互补3’末端混合并用作后续PCR模板以产生全长产物。这些中间体的重叠股在后续PCR中在该3’区域杂交，并延伸至产生由侧翼引物放大的全长产物；示于图2。全长引物包含用于进一步克隆为pCI载体的限制酶切位点。突变体的核苷酸序列通过测序查证。更详细地根据以下过程得到引物：

第一PCRs产生重叠基因片段，其随后用作第二PCR模板DNA以产生全长产物。内引物产生重叠，在中间体片段上的互补3′末端，并引入用于定点突变的核苷酸取代。这些中间产物的重叠股在3′区域水解为下一个PCR并通过侧翼引物放大延伸至产生全长产物。

A3.气味物库

涉及特定嗅觉丧失的气味物用于OR表达的气味物探索。根据化学结构(表2.3)和气味这66种气味物被分为至不同组。每种混合物中包含的气味物在下面示出。

(1)麝香组:

(1.1)佳乐麝香(Galaxolide)(1.2)环十五烯内酯,(1.3)Globanone、(1.4)海佛麝香(Helvetolide)、(1.5)Iso麝香酮、(1.6)十五酸环内酯、(1.7)麝香酮(Muscone)、(1.8)酮麝香、(1.9)氧嗪酸钾(Oxonate)、(1.10)特拉赛麝香(Traseolide)、(1.11)Macrolide Supra。

(2)龙涎香混合物 

(2.1)龙涎呋喃(Ambroxan)、(2.2)柏木甲醚、(2.3)卡拉花醛、(2.4)木倍醇,(2.5)Ysamber K。

(3)酮混合物

(3.1)2-氨基苯乙酮、(3.2)2-丁酮、(3.3)3-羟基-2-甲基-4-吡喃-4-酮、(3.4)5α-雄甾-16-烯-3-酮(Androstadien-3-one)、(3.5)二氢茉莉酮酸甲酯(Hedion)、(3.6)α-紫罗酮、(3.7)1-辛烯-3-酮、(3.8)灵猫酮(Civetone)、(3.9)甲基萘酮B、(3.10)甲基己基酮、(3.11)β-突厥酮(Damascone)、(3.12)西瓜酮(Calone)

(4)羧酸混合物 

(4.1)乙酸、(4.2)异丁酸、(4.3)异己酸、(4.4)异戊酸、(4.5)正己酸、(4.6)丙酸

(5)醇混合物

(5.1)C6醇、(5.2)C9醇、(5.3)茴香醇(Anisylalcohol)、(5.4)苄基醇、(5.5)肉桂醇(Cinamylalcohol)、(5.6)铃兰醇、(5.7)苯基乙醇、(5.8)苯基丙醇、(5.9)香叶醇(Geraniol)

(6)醛-内酯混合物

(6.1)3-苯基丙醛、(6.2)C6醛、(6.3)C12醛、(6.4)C14醛、(6.5)C18醛、(6.6)茴香醛(Anisic Aldehyde)、(6.7)苯甲醛、(6.8)Heptanaldehyde、(6.9)Hydratropicaldehyd、(6.10)异丁醛,(6.11)Octanal、(6.12)反-2-壬烯醛

(7)其他混合物 

(7.1)2,3-丁二酮、(7.2)2-4-6-三氯茴香醚、(7.3)土臭素(Geosmin)、(7.4)L-香芹酮(L-Carvone)、(7.5)新铃兰醛(Lyral)、(7.6)Sandranol、 (7.7)2-异丁基-3-甲氧基吡嗪、(7.8)1-丁硫醇、(7.9)Methyldisulfide、(7.10)粪臭素(Skatole)、(7.11)Ozonil(7.12).

优选的气味物属于由酮、醛、内酯、羧酸和有气味的类固醇构成的组。气味物储备溶液在二甲基亚砜(DMSO)中制备。使用Ringer溶夜稀释化学成分至Ca-成像浓度(最终DMSO浓度最大为0.2％)。

A4.细胞培养和DNA瞬时转染

HEK293细胞如前所述在Petri培养皿中培养(Benbernou et al.2007)。在潮湿环境下(37℃,5％CO2)，我们在含有标准DMEM的培养介质中使用10％热灭火胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100单位/ml链霉素培养HEK293细胞。2-3天后进行转染，即细胞培养汇合70-80％。在Ca-成像方法中在HEK293细胞中使用磷酸钙方法用于DNA质粒瞬时转染。

钙离子和磷酸根例子产生与DNA偶联的结晶沉淀，其可以通过内吞作用侵入细胞。使用由嗅觉受体候选者的pCI表达载体和PCR-放大全长cDNA组成的质粒DNA，以及Gα15、RTP1、Myr-Ric8A、HSC70、和m-Cherry作为辅助因子瞬时转染细胞。可以通过在HEK293细胞上滴加转染溶液，15-20分钟后产生沉淀物。在通过Ca-成像测定之前在37℃，5％CO2下培养细胞。在CRE-荧光素酶和CRE-SEAP检测中在HANA3A细胞中使用阳离子脂质体-介导转染法瞬时转染DNA质粒。

将HANA3A细胞以大概厚度为4000细胞/孔(在体积为50μl中)放置于覆盖聚-D-赖氨酸的96孔板上。培养24小时后(37℃/CO2)，表2示出加入不同管中的添加剂(根据单孔规模)：

表2

添加剂

为了制备转染混合物，我们将溶液(a)和(b)混合在一起并在室温下培养15-20分钟，在最后一步将45μl DMEM(含5％FBS)加入“ab”混合物。在将介质由96孔板中的细胞吸走后向每个孔中加入50μl DMEM(含5％FBS和AB混合物)。

A5.Ca-成像

转染HEK293细胞的钙成像通过使用10倍物镜(CPlanFL N Olympus)的倒置显微镜(Olympus；IX70)进行。使用CCD相机(Charge Coupled Device,C9100Hamamatsu)每4s测定荧光发射。用于提供气味物的毛细管在细胞上方设置。管中装填气味物、DMSO和ATP。手动控制每4-5秒向转染细胞滴加气味物。在35mm培养皿中液滴形式的溶液在HEK293细胞上展开。

在实验中，使用Fura-2乙酰甲酯(Fura-2/AM)。非极性Fura-2/AM具有荧光性但不具有钙敏感性。一旦扩散进入细胞质，Fura-2/AM水解为具有钙敏感性的Fura-2并用作Ca2+螯合剂。不管是否存在钙，Fura-2发射波长为510nm。一旦Fura-2与细胞质中的自由细胞内Ca2+结合，在波长340nm和380nm的发射比例变化并与细胞内Ca2+相关。根据这一特征，分析Fura-2的340/380nm发射比例能够量化细胞内钙水平。

在准备Ca-成像测定中，向转染HEK293细胞加入3μl Fura-2/AM(3μM)并在37℃，5％CO2下培养30-45分钟。在这步之后在黑暗环境中进行实验(Fura-2为光感性)。培养之后，用2ml Ringer溶液替代细胞培养介质。

使用转染m-Cherry质粒控制细胞转染率。通过m-Cherry转染的细胞在荧光显微镜观察为红色细胞(最大发射610nm)。

A6.使用气味物刺激和筛选

使用DMSO新鲜制备1M气味物储备液。将6种混合物(每种化合物质为200μM)顺序施用于细胞(20s混合物/30s Ringer)。使用单一气味物测定这些之前对气味物混合组产生明显响应的ORs。气味物制备为浓度100-200μM。

Ringer溶液用于两种不同气味物测定之间清洗细胞。通过响应时间、响应强度(比基线的噪音振幅大两倍以上)和响应曲线的形状(曲线急剧上升伴随逐步恢复)确定主动响应。响应曲线的典型形状是通过观察使用200μM的气味物重复刺激确定。使用100μM单一气味物测定后，通常使用200μM刺激气味物重复测定。为了确定产生显著响应曲线的每种 受体的结果，实验重复12次。最后将细胞暴露于可激活P2Y受体通道的ATP(0.25mM)并将Ca2+导入细胞。

A7.筛选策略

为了使用所有66种气味物筛选ORs，将它们分为7个不同的化学组。两步施用气味物，在第一步：通过气味组筛选ORs并在第二步中将特定气味物用于去孤儿化。在ORs筛选第一步，气味物组施用于ORs，期间在三个不同时间测定。选择至少两次对相同气味组响应的OR用于使用相同响应气味物组中的特定气味物进行下一步筛选。在第二步中，如果OR在三次测量后对特定气味物显著响应，应选择它进一步测定，否则由实验中排除。为了得到去孤儿化嗅觉受体的最终构造重复六次，期间两组实验包括三次测定。在本研究中这些ORs表现为在所有实验中表现出显著响应的去孤儿化受体(P<0.05)。

A8.CRE-荧光素酶

Dual-受体(DLR^TM)实验和Dual-Glo^TM实验能够由一个样品顺序测定萤火虫和海肾荧光素酶。气味受体活化导致细胞内cAMP的增多；我们使用CRE-荧光素酶测定这一变化。由构成活跃的SV40启动子驱动的海肾荧光素酶(pRL-SV40；Promega)用作细胞活力(cell viability)和转染效率的内部控制。最后通过将得到的萤火虫荧光素酶除以海肾荧光素酶将数据标准化为海肾活性。

通过Ca-成像使用由66种气味物形成的七种不同的气味混合物使ORs响应。气味物以5种不同浓度施用(50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM)并且将所有对Ca-成像不表现活性的ORs去除。为了荧光素酶检测我们使用Dual-Glo^TM荧光素酶实验体系(Promega)，描述如下：

1.在poly-D-lysine-涂布的96孔板上转染的HANA3A细胞24小时后用于刺激。每个孔中的细胞应当在刺激的同时汇合50-80％。

2.用CD293(成分确定培养基)替代DMEM介质并在37℃，5％CO2下板培养30分钟。

3.将在CD293中稀释的25μl气味物溶液加入并在37℃，5％CO2下培养四小时。

4.在室温下使用荧光素酶缓冲液(每孔20μl)培养板10分钟。

5.用酶标仪测定(Luminometer)。

6.加入第二种缓冲液(海肾/20μl每孔)并在室温下培养10分钟。

7.用酶标仪测定(Luminometer)。

8.根据测定荧光素酶和海肾活性的制造商协议，使用公式(Ln-Lmin)/(Lmax-Lmin)计算标准化的荧光素酶活性，其中Ln是响应气味物的萤火虫荧光，L min是板上的最小荧光素酶值，且L max是板上的最大荧光素酶值

A9.CRE-SEAP检测

分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)是广泛用于研究启动子活性或基因表达的受体。它是通过去除GPI anchor的人类胎盘碱性磷酸酶(PLAP)的截短型。与内源性碱性磷酸酶不同，PLAP具有极强的热稳定性并可抵抗抑制剂L-高精氨酸。SEAP被分泌至细胞培养上清液并因此能够不扰乱细胞而测定抗体活性。对于SEAP检测，各个孔的细胞使用Gαolf、Ric8b、RTP1,OR和pCRE-SEAP质粒转染从而继续进行接下来的步骤。CRE-SEAP检测协议由L.Buck友好提供。

第一天：细胞接种

将HEK293细胞接种在DMEM(10％胎牛血清)中，每孔6000-7000个细胞。

第二天：转染细胞并添加实验配体

1.对于一个孔，以下物质被加入eppendorf管(根据孔数量的规模以及过量使用以弥补移液时的损失)：

OR CRE-SEAP质粒 Gαolf RTP1 25-50ng 25ng 25ng 25ng

使用脂质体转染：

每个孔：

1-母体混合物(OR+CRE-SEAP+Gαolf+RTP1)+25μl opti-Mem介质

2-脂质体(每孔0.2μl)+25μl OptiMem介质(请等待5分钟)

1+2＝在室温下培养15-20分钟(不替换介质)

3-在37℃下培养24小时。

第三天

转染24小时后，用200μl不含血清而含有不同激动子(气味物)的DMEM介质替换介质。

1 在37℃下培养6小时.

2 将各孔的200μl介质转移至新板(96孔板)。

3 在65℃下加热30分钟。

4 将各孔的100μl上清液转移至新的96孔板(黑孔板)&向各个孔中加入100μl SEAP缓冲液(0.5mM MgCl2、1M二乙醇胺、1.2mM 4-MUP、10mM高精氨酸，pH＝10)

5 在37℃下培养10分钟。

应当注意，加入反应缓冲液后实验变为时间敏感性。

6 下列波长的荧光下读取酶标仪：335nm激发&449nm反射(程序名称为CRE-SEAP)(Packard IV酶标仪系统的程序名称为CRE-SEAP)。

A10.免疫组织化学 

免疫测定系统用于考察嗅觉受体在HEK293细胞中的表达以及在细胞表面的表达。为了免疫组织化学研究在聚赖氨酸-涂布的盖玻片(厚度80–100μm；Menzel，Germany)上种植HEK293。在HEK293细胞转染后，室温下在含有10mM葡萄糖的Ringer溶液中使用3％多聚甲醛培养30分钟以固定盖玻片。在含有1％冷水鱼皮明胶(Sigma)的PBS中使用0.1％Triton X-100渗透细胞并使用Rho-标记抗体4D2(初级抗体)在BS/明胶/Triton X-100(1:200)中培养。清洗后使用荧光标记的第二抗体(488-山羊-抗小鼠1:1000)培养盖玻片并加入ProLong抗淬灭试剂(分子探针)。使用共聚焦显微镜(LSM510Meta；Zeiss)得到所有的荧光图像(LSM510Meta；Zeiss)。为了研究在细胞表面的OR表达我们尝试活细胞表面染色质膜。

对于活细胞表面染色质膜使用初级抗-视紫红质抗体检测N端标记的Rho-标记的表达，使用4D2抗体在染色溶液中培养4D2(1:100,在冰上培养1小时)和HEK293细胞30分钟。吸入含有4D2抗体的染色溶液后，在冰上使用第二抗体培养细胞。标记的OR蛋白通过使用488-488-山羊-抗小鼠第二抗体和共焦显微镜(LSM510Meta；Zeiss,100_HCXPL APO oil immersion)成图。

A11.数据分析

使用Excel软件由钙成像数据绘制各个细胞的图(荧光强度与以秒计算的时间)。荧光强度的分数变化分析响应：ΔF/Fo或(F_Fo)/Fo)，其中F是刺激之后各个时间点的强度，Fo是施加刺激前的荧光发射强度(基线)。为了测定OR活性对特定气味物的显著细胞响应，使用统计卡方测试(four fields)。认为P-值<0.05是重要结果。

B.结果

B1.SPG和CNV OR候选物的确定 

在HORDE数据库中总共约60种嗅觉受体表现为SPGs。在第一种方法中，我们尝试克隆所有的60种SPGs并且在大多数情况下我们选择ORs作为具有高SNP变异的SPGs。克隆以后重组的质粒测序，将结果与NCBI数据库的基因数据银行进行比较。这些确定为伪基因的ORs由实验中排除。最后选择了表1中所示的40种SPGs用于去孤儿化：

表1

分离伪基因 

这40种SPGs分布于SNP发生率介于OR2S2中0.02％和OR1E3p中约50％的大部分OR家族。含有15种ORs嗅觉受体家族2、5和8被认为是本发 明中最大的家族。关于嗅觉受体与SPGs的数据由人类嗅觉数据探索(HORDE)得到。

基于大规模CNV-鉴定选择shCNV-OR候选物。通过不同技术确定包含获得或失去一些直至数以百计的基因组DNA千碱基对(kilobase)的CNV。

微阵列比较基因组杂交方法(阵列CGH)被用于55种非相关个体的基因组分析。通过使用大插入DNA片段，阵列辨别了整个人类基因组中的每1Mb。39种非健康相关对比单体的基因组DNA与16种已经测定染色体失衡的个体的基因组DNA相比。对比分析实现了所有预期CNVs的识别。这一项目作为基因变异数据库的主要来源做出贡献，例如，基因组变异数据库(DGVs)和人类嗅觉数据探索(Human Olfactory Data Explorer，HORDE)。CopySeq被用于150种具有不同系谱的非相关个体基因组的分析。34种hCNV-OR候选者根据由上述计划确定并在表2中示出的CNV特征成对进行。

Table 2

已知CNV的ORs

这些ORs选自两个CNV不同的组作为得到或失去基因的ORs。此外作为CNV的ORs通过其在人类种群中由OR1S2中0.01％至OR4C5中99％的不同分布选择。这些嗅觉受体中的大部分位于家族4。

B2.嗅觉受体的大规模研究

为了更好的理解嗅觉受体与化学气味物之间的关系以及遗传变异在气味表型中的作用，我们分析了人群中40种PGs和34种CNVs对66种具有不同化学结构以及不同感知的气味分子的响应。人类ORs系列(Libraries)通过在作为表达载体的pCI质粒中克隆ORs产生，其代表了人类OR家族中的大部分SPGs和CNVs(表1和2)。

使用含有Rho-标记的pCI质粒进行克隆。已经显示位于N-终端的视紫红质(Rho-标记)的前20个氨基酸的参与促进了一些ORs的细胞表面表达。图3显示位于ORs的N-终端的视紫红质的前20个氨基酸的参与促进了ORs的细胞表面表达。如上所述处理PCRs并在补充Rho-标记的pCI载体中克隆。克隆步骤后所有浓缩质粒测序并将那些确定为伪基因的由实验排除。

为了使用66种气味物筛选74种ORs，由于大量的ORs和气味物不可能逐一使用66种气味物检测所有ORs。因此我们将化学成分分为7个不同的组并选择那些被一组气味物激活的ORs。

为了分析ORs对气味物的响应，使用Ca-成像。如2.5中所述，转染HEK293细胞的钙成像通过使用10倍物距(CPlanFL N Olympus)的倒置显微镜(Olympus；IX70)进行。在实验中，使用Fura-2乙酰甲酯(Fura-2/AM)。不管是否存在钙，Fura-2发射波长为510nm。一旦Fura-2与细胞质中的自由Ca2+结合，发射波长在340nm和380nm之间变化并与细胞内Ca2+含量相关。根据这一特征，分析Fura-2的340/380nm发射比例能够量化细胞内钙水平。

在图4中使用OR10Q1转染的HEK293细胞作为使用十五酸内酯筛选的实例示出。伴随着Ca2+浓度的增加荧光强度改变。在这种情况下当使用十五酸内酯刺激细胞，细胞内Ca-浓度将提高。Ca-浓度的提高由Cell-R软件记录为颜色改变。不同的Ca-浓度浓度水平由Cell-R软件通过由深蓝(细胞内Ca-浓度基线)到红色(Ca-浓度的最高值)区别。测定的最后，随着细胞内Ca2+的增多对ATP(作为细胞活力的标志)响应变强。

作为第一步，使用7种含有100μM各个气味物的气味物混合物顺序测定过程中，监控为了提到细胞内钙所使用的ORs转染HEK293细胞。在 测定的74种ORs中，38种对一种或多种混合物响应并适用于分析；其他36种排除出进一步分析(表3)。

表3

ORs对气味物基团的响应(OGs)

B3.嗅觉受体的去孤儿化

在74种嗅觉受体中，38种ORs(51.3％)表现出对至少一种浓度为200μM的混合物的响应。我们随后将200μM的66种气味物单独施用于对混合物响应的ORs。遵循去孤儿化策略，在过程的最后18种人类ORs(24％)对66种与特定嗅觉丧失相关的气味物中的至少一种表现出显著响应(p<0.05)(表4)。通过响应时间、响应强度(比基线的噪音振幅大两倍以上)和响应曲线的形状(曲线急剧上升伴随逐渐恢复)确定主动响应。20种受体没有表现出显著结果，并由实验的下一步骤排除。

使用OR1B1、OR2L8、OR4X2、OR8D2、OR8B4和OR10Q1转染Hek293细胞。观察到这些ORs分别对酮、龙涎香、酮、醇、醛和麝香气味物组有响应。根据去孤儿化策略，使用亚组中的气味物筛选所有对气味物组响应的嗅觉受体。在去孤儿化的最后一步之后观察到OR1B1被属于酮组的西瓜酮、雄甾烯酮和3-羟基-2-甲基-4-吡喃酮显著激活(P<0.05)。然而，尽管OR1B1对其他组的气味物响应，但进一步的研究没有表明通过其他混合中的单一物质显著激活该受体。使用相同策略用于使用龙涎香组作为激活OR2L8的特定组筛选OR2L8。Ca-成像结果显示在使用Timbrol和Yasamber作为龙涎香组中的个体气味物筛选细胞的过程中，使用OR2L8转染的细胞中Ca2+浓度提高。在随后的通过Ca-成像筛选过程中，发现OR4X2可以是2-aminoacetophenon的受体(P<0.05)。作为进一步去孤儿化的嗅觉受体，在组筛选过程中，OR8D2对龙涎香组和醇组响应，但在亚组筛选中醇组中的仅两种气味物，铃兰醇和C6醇显著激活OR8D2(P<0.05)。当将龙涎香组的个体气味物施用于受体没有观察到反应(P>0.05)。OR8B4对醛组中的两种气味物，茴香醛和C6醛显著响应(P<0.05)。麝香气味混合物激活12种ORs。然而其中仅有三种在单一物质筛选中对单个麝香气味物响应。其中之一是显著响应环十五酸内酯的OR10Q1(P<0.05)。除了麝香组，OR10Q1也对龙涎香组混合物有响应，但是施用单一龙涎香气味物时没有产生任何响应。

响应ORs包括OR1B1、OR2L8、OR4X2、OR8D2、OR8B4和OR10Q1的Ca-成像图如上所述详细示于表5和图5。

表5

细胞响应

图5折线图中的每条曲线代表由浓度为200μM的特定个体气味物刺激的单一细胞的细胞内钙增加。在折线图中，最终细胞也对表明细胞活力的ATP响应。为了找出个体气味物是否显著激活受体，我们在三次测量的最后一步计算所有响应细胞并使用统计卡方测试(柱状图)测定显著性。通过转染细胞数(在三次测量中约2000转染细胞)vs.两组中的细胞响应数(测试样品盒对比样品)计算P-值。棒图说明SEM(根据统计卡方测试p*<0.05,0.001<P**<0.0001and P***<0.0001)。第一图表明OR1B1对西瓜酮、雄甾烯酮和3-羟基-2-甲基-4-吡喃的响应。相比于对比样中0、0、5个细胞响应，表达的OR1B1总共分别引起20、35、9个细胞对西瓜酮、雄甾烯酮和3-羟基-2-甲基-4-吡喃的响应(柱状图)；p-值<0.05(在三次测量中筛选出2000个细胞)。折线图示出在一次测量中的响应曲线。第二图示出OR2L8对Timbrol和Yasamber的响应。表达的OR2L8总共引起10个细胞对两种气味物的响应(柱状图)；p-值<0.05评价为显著响应。折线图示出在一次测量中的响应曲线。第三图示出OR4X2对2-氨基苯乙酮的响应。与对比样中的细胞响应相比，表达的OR4X2总共引起20个细胞对2-氨基苯乙酮的响应(柱状图)；p-值<0.05(在三次测量中筛选出2000个细胞)。折线图示出在一次测量中的响应曲线。下一图是OR8B4对茴香醛和C6醛的响应。表达的OR8B4总共分别引起14和8个细胞对茴香醛和C6醛的响应(柱状图)；p-值<0.05评价为显著响应。折线 图示出在一次测量中的响应曲线。OR8B4对铃兰醇和C6醇响应。表达的OR8D2总共分别引起9和21个细胞对C6醛和茴香醛的响应(柱状图)；p-值<0.05评价为显著响应。折线图示出在一次测量中的响应曲线。最后一图示出OR10Q1对十五酸内酯的响应。与对比样中的2个细胞响应相比，表达的OR10Q1总共引起52个细胞对十五酸内酯的响应(柱状图)；p-值<0.05评价为显著响应(在三次测量中筛选出2000个细胞)。折线图示出在一次测量中的响应曲线。对比HEK293细胞使用辅助因子和不含ORs的pCI质粒转染。

在总共18种去孤儿化受体中6种受体属于CNV组，1种受体已知为表6中示出的SPG。尽管其他受体没有产生对一种或多种气味物混合物中的个体气味物显著响应，我们的主动响应导致大量OR激动子的发现。前12种OR代表SPGs，其他为6种CNVs；CAN代表碳数。

表6

18种对32种特定嗅觉丧失相关的气味物响应的嗅觉受体

在本检测方法中特定OR对任何测定气味物的响应缺失可能反映OR表达缺失，而不是缺少被检测气味的敏感性。在我们进一步的分析中仅选择对测试气味物中的至少一种响应的受体，并在我们的检测中评估为功能性。

每种气味物混合物刺激一个亚组的嗅觉受体，并且一些混合物比其他混合物激活更多受体。值得注意地是33％(6/18)的ORs由含有酮的混合物激活，22％(4/18)由醛激活，而16％(3/18)的OR对醇和麝香组响应，其中仅有11％(2/18)的受体对龙涎香和“混合”组响应。不论每种混合物中气味物的数量，8种酮和6种醛分别激活了5种SPGs、和1种CNV以及2种SPGs和2种CNV受体，而混合物组中仅3种气味物仅仅激活了2个SPGs受体，麝香组的2种气味物激活了3种CNV受体。22％(9/40)和17％(7/40)对酮和醛类气味物响应。10％(4/40)的响应由龙涎香组合混合物组激发。羧酸和醇类构成所有活性气味物中的15％(6/40)。仅有7％(3/40)的响应由麝香组引起。

B4.Ca-成像和CRE-荧光素酶：相似性和区别

尽管对嗅觉受体的大量研究，许多脊椎动物的ORs仍是孤儿受体。一个原因可能是重组表达体系需要用于在细胞膜上足够的OR蛋白表达的额外成分。此外，对于刺激细胞途径的气味物需要辅助因子与cAMP途径结合(因此，发展出检测如CRE-荧光素酶)。我们尝试通过CRE-荧光素酶检测确定Ca-成像结果。通过Ca-成像，6种ORs(OR1B1、OR2L8、OR4X2、OR8B4、OR8D2和OR10Q1)被去孤儿化作为特定气味物的受体。对于这6种ORs的相似实验通过CRE-荧光素酶检测进行并且使用通过Ca-成像确定的其配体激活它们。CRE-荧光素酶检测实验表明通过Gα15-介导Ca-成像和Gαs-介导cAMP评估测定的配体-响应性之间存在差异。OR1B1、OR4X2、OR8D2和OR8B4通过Ca-成像去孤儿化但是通过CRE-荧光素酶检测不产生相似响应。如图6所示OR10Q1在Ca2+检测中给出主动响应并在cAMP检测中同样给出主动响应，OR2L8在cAMP检测中产生弱响应。

(A)柱状图和折线图显示OR10Q1响应浓度为50μM、100μM、150μM、200μM和250μM的十五酸内酯的计量曲线图。pCI载体转染的细胞核和DMSO(0.2％)用作被动对比样，浓度为10μM的毛喉素(Forskolin，Fr)用作主动对比样。CRE-荧光素酶结果说明萤火虫与海肾的比例。中间的折线图示出通过Ca-成像OR10Q1对十五酸内酯的响应。

(B)柱状图示出OR2L8对浓度为50μM、100μM和150μM浓度的Yasamber的响应。DMSO用作被动对比样，浓度为10μM的毛喉素(Fr)用作主动对比样。根据作为对比的受体对DMSO的响应正常化报道了CRE-荧光素酶结果。右侧的折线图示出OR2L8通过Ca-成像对Yasamber(A)的响应。

B5.嗅觉受体的细胞表面表达

基于气味物刺激的活性测量对于研究ORs的气味编码十分重要。OR蛋白表达后的一个重要步骤是将蛋白转运至质膜。为了评估细胞表面表达和测定ORs的功能活化，在HEK293细胞中暂时表达辅助因子质粒包括RTP1、Myr-Ric8A、HSC70和Gα15。通过在活细胞中使用荧光免疫我们测定了ORs的细胞表面表达水平。

B6.嗅觉受体的宽-精调整

在嗅觉研究中，由于缺少用于测定气味物相似性的协议比例尺，没有评估受体为宽或精调整的定量标准，但是传统上根据激动子的受体数以及这些激动子之间的相似性测定。根据目前的研究，在由混合物激活的18种SPGs和CNVs中，66.6％(18种中的12种)仅对一种含有结构相关的气味物的混合物响应。在亚组中，18种去孤儿化受体(22.2％)中的4种仅对一种气味物响应，其他66.7％(18种中的12种)对混合物中的至多3种气味物响应，而18种种仅有2种(11.1％)对多于三种气味物响应，没有对混合物中所有气味物响应的受体。在大多数情况下通过嗅觉受体识别的气味物具有相关的化学官能团。一些实例是OR1B1，其对酮组混合物的三种气味物响应，包括3-羟基-甲基-吡喃、西瓜酮和雄甾烯酮。OR8D2对C6醇和铃兰醇，以及醇混合物中的两种气味物响应，或者OR2L8对Yasamber和Timbrol，龙涎香组的两种气味物响应。通常在本实验中我们确定单一OR可以识别多种气味物。18种ORs中有14种对多于一种的气味物响应。类似结果示于其他研究中，重组体系中单一嗅神经元或嗅觉受体可以对多种气味物响应。

我们的结果显示SPGs和CNVs是精调整的以识别根据化学结构归入特定组中的相对少量的气味物。此外，结果显示有一些能够被多种受体识别的单一气味物(8/32)。Yasamber由OR2L8(SPG组)和OR4K5(CNV组)。同样铃兰醇和C6醇由OR8D2和OR10A6识别。

B7.嗅觉体系中气味物和响应变异之间的差距

为了测定两种气味物之间的差距，我们通过计算碳原子数(CANs)和官能团使用不同的指标。为了预测与CAN相关的响应模式，气味物被限于仅CAN改变而所有其他特征如官能团固定。根据CANs我们将去孤儿化的气味物分为9组。可以看出在这些组中具有8-9个碳原子数的气味物构成了最大一组，为9个。具有低CANs(2-5之间)和高CANs(16-19)的气味物表现出对嗅觉受体最弱的响应。根据我们的结果，所有反应气味物的40％(16/40)的CAN为5至9。该结果示于表7，表明具有少于5个或多于12个碳原子数的气味物与含有5至12个CANs的气味物相比激活更少数量的ORs。

表7

去孤儿化气味物数量与碳原子数之间的关系

CAN 去孤儿化气味物数量 2-3 2 4-5 3 6-7 7 8-9 9 10-11 6 12-13 4 14-15 5 16-17 3 18-19 1

同样为了找出可被OR识别的可识别结构特征，我们考察了仅被单一OR识别的多种气味物的结构特征。如在表3.4中所见，一些受体对具有相近碳原子数的气味物响应。例如OR2L8或OR4K5对CANs为15至17的气味物响应，OR4E2对CANs为9至11的气味物响应，而OR8B4为6至8。一些响应受体识别测定的所有长度的气味物(即C2–C19)；这些结果与之前的观察一致。然而应当注意，有些ORs对具有相当不同CANs的气味物响应。例如OR1B1对6个CANs的3-羟基-2-甲基-4-吡喃以及19个CANs的雄甾烯酮响应。

其他可以作为嗅觉受体和气味物连接点观察的因素是化学官能团。如之前研究中报道的气味物官能团在ORs识别中同样重要。在实例中没有一种识别气味物的ORs属于测试气味物的所有5组(醇、酸、酮、醛、龙涎香)，61.1％(11/18)的ORs仅识别一类气味物。酮构成了这类具有6 个亚组的气味物的绝大部分，且包括酸、龙涎香、醛和醇的其他组。表7涉及对具有相似官能团的气味物响应的ORs。

表7

具有相同官能团的OR和气味物

剩下的ORs识别属于两种或三种化学类别的气味物。ORs这种识别性能的差异可能对识别和辨别各种结构不同的气味物的气味物系统非常重要。

B8.类似气味物结构，类似响应？

如表7所示，大多数的ORs对具有相似官能团但不具有相似化学结构的气味物有响应。为了理解结构相似性和相似响应形式之间的关联，我们选择OR10Q1、OR4K2、OR4P4和OR1B1。根据我们的数据文件，OR10Q1和OR4K2对十五酸内酯响应，OR4P4和OR1B1分别对环十五烯内脂和雄甾烯酮响应。OR10Q1、OR4K2和OR4P4使用具有相似化学结构的麝香气味物(十五酸内酯、灵猫酮、麝香酮、Globanon和环十五烯内酯)测定。但是对麝香气味物响应的ORs对图7中给出的其他具有相似化学结构的麝香气味物没有显著响应。

例如灵猫酮近似于麝香中发现的主要香味化合物麝香酮，因为两种化合物都是大环酮。十五酸内酯和环十五烯内酯已知为内酯麝香，和麝香酮、灵猫酮以及globanone属于酮麝香组。结构相关的气味物分别通过Ca-成像测定其激活OR4P4、OR10Q1和OR4K2的能力。柱状图显示出Ca-成像测定中对不同麝香物响应的细胞。在三次测定中筛选出约2000个细胞。

如前所示，OR1B1是用于雄甾烯酮的去孤儿化受体。为了理解结构相似性和相似响应形式之间的关联，我们使用睾酮作为具有与雄甾烯酮相似化学结构的化学物质筛选OR1B1。Ca-成像结果显示OR1B1对睾酮和雄甾烯酮响应。睾酮是雄激素组的类固醇激素并在哺乳动物中发现。它是主要的雄性激素和合成代谢类固醇。

图8涉及通过Ca-成像技术产生相似响应的具有相似化学结构的类固醇激素。OR1B1对雄甾烯酮和睾酮(200μM)响应。在本研究中已知OR1B1也对西瓜酮和3-羟基-2-甲基-4-吡喃(200μM)响应。在用于比较相似化学结构之间响应的第二种方法中使用睾酮作为与睾酮具有相似化学结构的雄性激素。与对比样中3个和1个细胞响应，OR1B1分别引起总共13个和12个细胞对雄甾烯酮和睾酮响应(柱状图)，p-值<0.05评价为显著响应。使用辅助因子和不含ORs的pCI质粒转染对比HEK293细胞。折线图示出雄甾烯酮和睾酮测定中的响应曲线。在三次测定中筛选出约2000个细胞。

B9.气味特性和受体序列之间的关联

使用氨基酸性质的相似性，构建在本研究中筛选的74种ORs的系统树图，从而示出具有已知配体的ORs在OR类别和家族中的分布。图9描述该系统树图。

为了本发明的目的大量ORs去孤儿化，随后气味特性和ORs序列配对。一个一般的假设是由相同气味物激活的ORs将在一个潜在的结合口袋(binding pocket)具有相似的蛋白质序列或氨基酸。为了测试这一假设 构建基于TM3-TM6区域蛋白质的系统树图，ORs中一个特别可变的区域已经被认为参与OR-气味物反应。在该系统树图中(图10)呈现了新确定的配体图。该系统树图比较了响应32种气味物的18种ORs的TM3-TM6区域。对于我们的一些新配体，发现相同气味激活源自相同分支的密切相关的受体，而不激活对于其他来自不同分支的受体。例如，OR4P4和OR4C3位于相同分支并由酸激活。这一序列可能不必对应于ORs的结合位点。发现在识别与特定嗅觉丧失相关的18种ORs中确定了TM3-TM6序列。红色数字是分支支撑数据，作为基于分支相邻的可能比例。使用Phylogeny.fr在线程序比较ORs的可变区域。

B10.单核苷酸多态性和气味物响应：OR1B1和OR10Q1-突变体的功能分析

根据报道的在对给定气味的强度和愉悦度上大的感知变化，人类的嗅觉感知个体间差异巨大。雄甾烯酮(5α-雄甾-16-烯-3-酮)，一种源自睾酮的有气味的类固醇，由不同个体感受不同，如讨厌的(“汗味，尿骚味”)，好闻的(“甜味，花香”)或无味。个体间气味感知变化的机理基础。如先前所示雄甾烯酮感知取决于人类气味受体基因的遗传变异。尝试研究是否是OR1B1中的遗传变异对气味感知有影响。在此我们示出人类气味受体OR1B1在体外由雄甾烯酮和睾酮激活。

在SNP数据库中对OR1B1多样性的搜索确定了在该受体中发生率大于25％的3个非-同义SNPs。我们指的是最常用的受体等位基因，即OR1B1-574、OR1B1-688和OR1B1-789。这种受体的三种不同常规变体包含非同义单一核苷酸多态性(MAF>0.25)，在体外产生严重损害功能的三种氨基酸取代。使用Ca-成像筛选用于雄甾烯酮和睾酮-介导刺激并产生带有各个SNPs的气味受体，发现OR1B1-574不能再次产生对浓度为200μM的雄甾烯酮和睾酮的响应。

图11示出通过对HEK293细胞中异源表达的受体进行的Ca-成像测试检测OR1B1-574与OR1B1WT相比对雄甾烯酮和睾酮的响应。细胞响应使用对比样中雄甾烯酮和睾酮的非特定活性进行量化。作为对比样的HEK293细胞使用所有辅助因子和不含ORs的pCI质粒转染。两种气味物以200μM施用20秒。柱状图示出SEM(根据统计卡方测试*p<0.05)。在三次测定中筛选出约2000个细胞。

OR1B1-688和OR1B1-789与OR1B1WT相比没有示出任何显著的响应。

如图12所示对HEK293细胞中异源表达的受体进行的Ca-成像测试检测时，OR1B1-688和OR1B1-789与OR1B1相比，对雄甾烯酮和睾酮没有 显著不同的响应。细胞响应使用作为对比样的未转染细胞的雄甾烯酮和睾酮的非特定活性进行量化。两种气味物以200μM施用20秒。柱状图示出SEM。对比细胞对雄甾烯酮和睾酮响应(分别为3个和1个细胞)。

十五酸内酯已知为人群中特定嗅觉丧失为12％的气味物。通过观察十五酸内酯孟德尔遗传模式推测该特定嗅觉丧失是由于嗅觉受体蛋白之一的遗传缺陷。

进一步研究作为对于新型去孤儿化十五酸内酯受体的OR10Q1中的遗传变异是否在气味感知中起作用。

在SNP数据库中对OR10Q1多样性的搜索确定了在该受体中发生率大于0.05％的一种非-同义SNPs。我们指的是最常用的受体等位基因，即OR10Q1-614。这种受体的一种常规变体包含非同义单一核苷酸多态性(MAF为14.88％)，产生替代Arg的Cys取代氨基酸。为了评价SNP的作用，针对PCR驱动重叠延伸的定点突变并克隆至表达载体。这一常见SNP的突变被认为影响受体对十五酸内酯的响应。

OR10Q1-变体被瞬时转染至HEK293细胞并随后通过Ca-成像功能定性。使用十五酸内酯刺激OR10Q1的一个突变体，在与OR10Q1-WT的响应相比没有示出任何变化。

图13示出示出通过对HEK293细胞中异源表达的突变WT受体进行的Ca-成像测试检测OR10Q1-614与OR10Q1WT相比对雄甾烯酮和睾酮的响应。气味物以200μM施用20秒。柱状图示出SEM(根据统计卡方测试*p<0.05)。十五酸内酯不响应。OR10Q1WT和OR10Q1-614之间没有显著的响应差异。在三次测定中筛选出约2000个细胞。