水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2在小麦中的应用

摘要

本发明提供了水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2在小麦中的应用，通过将水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2利用基因枪介导法导入到普通小麦品种郑麦0856中，获得可稳定遗传与表达的转基因小麦植株。其具体通过以下步骤完成：OsPHR2基因线性表达载体的构建；将含有目的基因的线性载体转化小麦愈伤组织；抗性再生植株的PCR鉴定。利用基因枪介导法将水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2的线性表达载体导入到普通小麦品种郑麦0856中，获得可稳定遗传与表达的转基因小麦植株，为选育高产优质资源高效利用转基因小麦新品种提供技术和材料支撑。

说明书

技术领域

本发明属于转基因育种技术领域，具体涉及水稻低磷胁迫转录因 子OsPHR2在小麦中的应用。

背景技术

磷素是植物生长和发育所必需的大量元素之一，是核酸、磷脂和 ATP等生命大分子的重要组成成分，在植物的全生育期内起着极其 重要的作用，全国土壤普查结果表明，我国有近半数省(区)其总面 积的50％以上的土壤有效磷含量在5mg/kg以下，土壤有效磷含量在 10mg/kg以下的占到80％-90％，土壤缺磷是作物生产的主要限制因素 之一。当环境中磷匮乏时，植物形态发育上的变化主要是根构型的变 化，包括增加根茎比，侧根数目以及根毛的数目和长度等。度等(陈 磊等，2011；Abel et al,2011；Lopez-Bucio et al,2002；Ma et al,2001)。 生理生化方面的变化包括高亲和Pi转运体的诱导表达，土壤分泌有 机酸，內源磷酸酶和RNase的诱导表达，以及增加有机酸和质子的释 放，从而来增加磷的吸收和再循环能力。

MYB转录因子中的MYB-CC家族基因成员是参与植物对营养 成分饥饿胁迫调控过程的重要基因。Wykoff等通过图位克隆的方法 首先从拟南芥中克隆了AtPHR1基因，并证明该基因属于MYB-CC 家族成员，参与了磷酸盐饥饿应答信号传导途径。浙江大学吴平教授 课题组从水稻中克隆了2个拟南芥AtPHR1的同源基因OsPHR1和 OsPHR2，系统进化树分析表明，OsPHR1和OsPHR2与AtPHR1同 属于MYB-CC家族成员，两个基因都通过调节磷饥饿诱导基因的表 达而参与磷饥饿信号传导，具有相似的功能。但只有OsPHR2的超表 达株系能够在正常磷的环境下使水稻大量富集磷，且一些磷转运蛋白 也相应的上调。在低磷条件下，过量表达OsPHR2基因可提高植物根 系对低磷信号的响应，植株根构型的改变较野生型株系更为强烈，其 结果是根增长，根毛增多，磷吸收利用率显著提高。OsPHR2是水稻 磷信号调控体系的重要因子，在土壤缺磷条件下可显著提高植物对磷 的吸收。

本发明将OsPHR2基因导入到普通小麦品种郑麦0856中，创制 出了可稳定表达与遗传，无选择标记，且磷素吸收利用效率较受体郑 麦0856明显提高的转基因小麦材料，为选育节本高效优质转基因小 麦品种提供技术和材料支撑。

发明内容

本发明目的在于提供水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2在小麦中 的应用，通过构建了水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2的线性表达载 体，利用基因枪介导法将其导入到普通小麦品种郑麦0856中，创制 出了可稳定表达与遗传，磷素吸收利用效率较受体郑麦0856明显提 高的转基因小麦材料，为选育高产优质资源高效利用转基因小麦新品 种提供技术和材料支撑。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明提供了水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2在小麦中的应用， 通过将水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2利用基因枪介导法导入到普 通小麦品种郑麦0856中，获得可稳定遗传与表达的转基因小麦植株。 其具体通过以下步骤完成：

1)OsPHR2基因线性表达载体的构建；

2)将含有目的基因的线性载体转化小麦愈伤组织；

3)抗性再生植株的PCR鉴定。

进一步

步骤(1)具体为利用HindIII酶切含有OsPHR2基因的环状表达 载体pWMB003-OsPHR2，获得含有目的基因的线性载体，该片段长 3kb，是只含有玉米Ubiquitin启动子、OsPHR2基因和Nos终止子的 线性最小表达框。

步骤(2)具体为以郑麦0856的幼胚为受体材料，在MS诱导培 养基暗培养4-5d后，置于高渗培养基渗透处理4-6h，将含有目的基 因线性载体和含有bar基因线性载体，利用基因枪介导法共转化小麦 愈伤组织，在高渗培养基上继续处理16h，转至愈伤诱导培养基，培 养2周后转至草丁膦抗性筛选再生培养基，连续筛选2代，筛选的抗 性苗转至生根培养基，生根、壮苗后移栽，获得抗性再生植株。

步骤(3)具体为提取再生植株的基因组DNA，根据OsPHR2基 因序列设计了一对特异性引物PHR2P1：5'-AATATGGAGGCTTTGA ACC-3'和PHR2P2：5'-TAACACACCCTTGGGAGTA-3'，扩增程序为： 95℃2分钟；95℃20秒，58℃30秒，72℃30秒，38个循环；72 ℃10分钟，目的片段长度为476bp；PCR反应体系为：10-50ng/ul 基因组模板；10μM的PC1和PC2各0.5μl；2.5μl 10×Reaction Bu  ffer；4μl dNTP mix(2.5mM)；0.5μl Taq酶，加水至25μl。

所述的MS诱导培养基为：MS+2mg/L 2,4-D+0.4％琼脂+3％ 蔗糖，pH6.2；

所述的高渗培养基为：MS+2mg/L 2,4-D+0.7％琼脂+甘露醇+ 3％蔗糖，pH5.8；

所述的草丁膦抗性筛选再生培养基为：1/2MS+0.5mg/L NAA+ 2.0mg/L KT+0.4％琼脂+3％蔗糖+4％PPT，pH6.2；

所述的生根培养基为：1/2MS+0.2mg/L NAA+0.4％琼脂+3％蔗 糖，pH6.5。

本发明还提供了一种含有目的基因OsPHR2的线性表达载体，该 片段长3kb，是只含有玉米Ubiquitin启动子、OsPHR2基因和Nos 终止子的线性最小表达框。

本发明的有益效果为：长期以来，国内外将小麦近缘种属和其它 物种的磷高效基因导入普通小麦的主要技术途径为通过远缘杂交方 法，但一直未获得突破性进展。其主要原因为近缘种属和其它物种与 小麦之间存在着生殖隔离。本发明技术方案可以打破物种之间的生殖 隔离，实现基因在不同物种中的交流，因此已成为解决农作物重要性 状遗传改良瓶颈问题的主要技术途径。、

附图说明

图1是植物表达载体pWMB003-OsPHR2结构示意图；

图2是转OsPHR2基因小麦植株基因组DNA扩增电泳图；1： OsT5-1；2,3,4,5：阴性植株；6：OsT5-7；7：OsT5-28；8：OsT5-167； 9：OsT5-183；10：受体郑麦0856；11：阳性对照；M：Marker；

图3是转基因小麦株系目的基因OsPHR2的Southern杂交分析； M：1Kb DNALadder；+：阳性对照(质粒)；1,2,3：受体郑麦0856； 4,5,6：转基因株系OsT5-28；1,4—BamHI酶切；2,5—KpnI酶切；3,6 —SacI酶切；

图4是转基因小麦OsPHR2基因的RT-PCR检测；,2,3：转基因 株系OsT5-28；CK：未转化对照(郑麦0856)；A为OsPHR2基因 的扩增产物，B为actin基因的扩增产物；

图5是转基因小麦株系OsT5-28旗叶Western杂交结果；1：转 基因株系OsT5-28；2：阳性对照水稻；WT：未转化对照(郑麦0856)；

图6是不同条件下转基因小麦株系和对照的最长根长比较；

图7是不同条件下转基因小麦株系和对照的根鲜重比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本 发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉 本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变 化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实 质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保 护范围内。

实施例1

实验用质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自百 泰克公司，Prime Star TaqDNA聚合酶、大肠杆菌(Escherichia coli)菌 株DH5α感受态细胞制备试剂盒均为TaKaRa公司产品，限制性内切 酶为MBI公司产品，氨苄青霉素为Amersco公司产品,其余试剂为 进口或国产分析纯。

1)OsPHR2基因线性表达载体的构建

分别用BamHI和KpnI分别双酶切pWMB003载体和含有 OsPHR2基因的表达载体，琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的条带 和表达载体片段，22℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞， 经PCR和双酶切鉴定为pWMB003-OsPHR2(图1)。

利用HindIII酶切含有OsPHR2基因的环形表达载体pWMB003- OsPHR2，电泳、回收3kb左右的目的片段，该片段是只含有启动子 (玉米Ubiquitin启动子)、目标基因(OsPHR2基因)和终止子(Nos 终止子)的线性最小表达框。

2)OsPHR2基因导入郑麦0856及PCR鉴定

以小麦品种郑麦0856的幼胚为受体材料。取开花后12-14d的穗 中部、大小一致的未成熟种子，用70％的酒精表面消毒1min，无菌 水冲洗3次后用0.1％的HgCl₂消毒10min，无菌水冲洗3-4次。无菌 条件下剥出幼胚(1mm左右)，于MS诱导培养基(MS+2mg/L 2,4-D +0.4％琼脂+3％蔗糖，pH6.2)上暗培养4-5d后，置于高渗培养基 (MS+2mg/L 2,4-D+0.7％琼脂+甘露醇+3％蔗糖，pH5.8)上渗透 处理4-6h，将含有目的基因线性载体(Ubiquitin启动子+OsPHR2基 因+Nos终止子)和含有bar基因线性载体，利用基因枪介导法共转 化小麦愈伤组织，基因枪轰击后在高渗培养基上继续处理16h，转至 愈伤诱导培养基。培养2周后转至草丁膦抗性筛选再生培养基(1/2 MS+0.5mg/L NAA+2.0mg/L KT+0.4％琼脂+3％蔗糖+4％PPT， pH6.2)，连续筛选2代，每代2周，经过筛选的抗性苗转至生根培养 基(1/2MS+0.2mg/L NAA+0.4％琼脂+3％蔗糖，pH6.5)中，至再 生苗根系较健壮时，即可进行炼苗1-2天。生根、壮苗后移入花盆中， 最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵，获得抗性再生植株 146株。

提取所有再生植株的基因组DNA，根据OsPHR2基因序列设计 了一对特异性引物PHR2P1：5'-AATATGGAGGCTTTGAACC-3'和 PHR2P2：5'-TAACACACCCTTGGGAGTA-3'，扩增程序为95℃2分 钟；95℃20秒，58℃30秒，72℃30秒，38个循环；72℃10分 钟。目的片段长度为476bp。，利用该引物对再生植株进行PCR检测， 以鉴定阳性植株。PCR反应体系为：10-50ng/ul基因组模板；10μM 的PC1和PC2各0.5μl；2.5μl 10×Reaction Buffer；4μl dNTP  mix(2.5mM)；0.5μl Taq酶，加水至25μl。PCR产物经1％琼脂糖凝 胶电泳检测。有36株可以扩增出476bp的目的条带，鉴定为阳性植 株(图2)。

实施例3转基因小麦的拷贝数分析

Southern杂交试剂盒为罗氏公司产品，杂交探针采用地高辛标 记。Southern杂交结果显示(图3)，采用BamHI、KpnI和SacI三种 酶对转基因株系OsT5-28的总DNA进行酶切，通过与探针杂交，结 果显示OsT5-28株系含有2个拷贝的目标基因，目的基因OsPHR2 探针序列与PCR鉴定序列相同。标记方法及杂交过程如下：

1)基因组DNA提取采用CTAB法；

2)DNA酶切：100μl体系加DNA20μg水浴酶切12-16小时；

3)酶切体系电泳:0.7％琼脂糖凝胶1*TAE电泳液35V/12小 时；

4)转膜过程采用常规向上转膜或真空向下转膜法；

5)杂交过程：

A：将适量体积的杂交缓冲液提前预热到杂交温度(37-42℃)。

将膜反面贴紧杂交管，加入5-10ml杂交液，在杂交炉中温和振 荡30-60分钟进行预杂交；

B：变性地高辛标记的DNA探针(在地高辛杂交液中浓度大约 为25ng/mL，使用前进行探针标记效率检测)将探针放入沸水浴中煮 5分钟后快速放入冰水混合物中冷却；

C：将变性的地高辛标记探针加入到预热的地高辛杂交缓冲液 (每100cm2的膜加入5ml杂交缓冲液)中，充分混合但要避免产生 泡沫(气泡容易产生背景)；

D：倒出预杂交液，立即向杂交管内加入探针杂交液的混合物。 温和振荡孵育10-16小时。

6)洗膜过程

A：严禁洗涤

a.用20ml的2×SSC 0.5％SDS连续振荡洗涤两次，每次5分钟；

b.65-68℃，用足够的0.5×SSC 0.5％SDS(提前预热到洗涤温度) 连续振荡洗涤两次，每次15分钟。

B：免疫检测

a.15-25℃，用洗涤缓冲液冲洗膜1-5分钟；

b.在100ml封阻液中孵育30分钟；

c.在20ml抗体溶液中孵育30分钟；

d.用100ml洗涤缓冲液洗涤两次，每次15分钟；

e.在20ml检测缓冲液中平衡2-5分钟；

f.将膜上带有DNA的一面朝上，放在平铺的保鲜膜上，向膜上 加入1ml的随时即用的CSPD。立即用保鲜膜盖到膜上，均匀的铺平 底物，且膜上不能有气泡。15-25℃中孵育5分钟；

g.除去多余的液体，将折叠夹的边缘都封好，注意在暴露过程 中膜干了会导致黑背景的产生；

h.将膜放在37℃条件下孵育10分钟，以增强发光反应；

i.在15-25℃条件下，采用图像仪曝光大约5-20分钟，或者用X 光片曝光15-25分钟，注意化学发光持续至少48小时。在检测反应 开始后的几个小时里信号是不断增强的，将达到一个阈值，这时的信 号强度几乎可以持续到接下来的24-48小时。

7)探针标记及标记效率效率的确定(DIG-High Prime DNA  Labeling and Detection Starter Kit II，Roche公司，货号11585614910) (探针标记区域见基因序列)。

a.分别从标记的探针和标记对照DNA的2-9号管中取出1μl 点在尼龙膜上；

b.通过紫外交联的方法将核酸固定在膜上；

c.将膜转移到一个装有20ml马来酸缓冲液的杂交管中15-25℃ 中振荡孵育2分钟；

d.在10ml封阻液中孵育30分钟；

e.在10ml抗体溶液中孵育30分钟；

f.用10ml洗涤缓冲液洗涤两次，每次15分钟；

g.在10ml检测缓冲液中平衡2-5分钟；

h.将膜上带有DNA的一面朝上，放在平铺的保鲜膜上，向膜上 加入1ml的随时即用的CSPD。立即用保鲜膜盖到膜上，均匀的铺平 底物，且膜上不能有气泡。15-25℃中孵育5分钟；

i.除去多余的液体，将折叠夹的边缘都封好，注意在暴露过程中 膜干了会导致黑背景的产生；

g.将膜放在37℃条件下孵育10分钟，以增强发光反应；

k.在15-25℃条件下，采用图像仪曝光大约5-20分钟，或者用X 光片曝光15-25分钟，注意化学发光持续至少48小时。在检测反应 开始后的几个小时里信号是不断增强的，将达到一个阈值，这时的信 号强度几乎可以持续到接下来的24-48小时。

实施例4转基因小麦的转录情况分析

提取对照和转基因小麦植株的总RNA，反转录成cDNA，将 cDNA模板均稀释10倍，分别进行OsPHR2基因和actin基因的 RT-PCR扩增。以actin基因调整模板用量，当扩增产物的亮度基本一 致时，可确定模板浓度一致，以用于OsPHR2基因扩增。

扩增结果如图4所示，对照植株没有扩增出目的条带，而转基因 小麦植株均扩增出476bp的目标条带，表明OsPHR2基因在小麦基因 组中得到了正确转录。

实施例5转基因小麦的表达分析

1)样品处理

A：对蛋白样品用BCA试剂盒进行蛋白定量；

B：根据SDS-PAGE上样量需要，用水及5×loading buffer调整 蛋白浓度，100℃煮沸变性5min。

2)SDS-PAGE

A：根据目的蛋白的分子量，配制8％分离胶凝胶，浓缩胶浓度 为5％；

B：待检测蛋白样品上样量：上样30μg；

C：电泳条件：浓缩胶恒压80V，约20min；分离胶恒压100V， 电泳至溴酚蓝到凝胶底部。

3)转膜

A：转膜方法：半干法；

B：转膜条件：采用半干法时，按照电流1.2mA/cm2膜面积，恒 流转膜；0.45μm孔径NC膜，转膜时间1h；

C：转膜后用丽春红染色试剂(Cat#：CW0057)对膜染色，观 察转膜效果。

4)Western blot检测目的蛋白

A：封闭：将膜浸没在5％脱脂奶粉(TBST溶解的，pH7.5)中 室温轻摇1h(封闭液须覆盖整张膜，且膜在其中能够摇动为宜)；

B：一抗孵育：用封闭液稀释一抗，室温孵育30min，放4℃过 夜；

C:洗膜：TBST洗膜3次，每次10min；

D：二抗孵育：用Western blot封闭液Ⅱ稀释二抗，羊抗兔-HRP 1:5000，室温轻摇40min；

E：洗膜：TBST洗膜3次，每次3min；

F：ECL反应、胶片曝光：一张8cm×6cm大小的膜用1ml ECL (500μlA液+500μlB液)反应3min，曝光1min(曝光时间随不同 光强度而调整)，显影2min，定影；

G：洗膜：TBST洗膜3次；

H：封闭：将膜浸没在Western blot封闭液中室温轻摇30min；

I：孵育内参：加Beta-actin鼠单抗，用Western blot封闭液稀释 抗体，1：3000稀释，12ml体系，室温孵育30min后放于4℃过夜；

J：洗膜：TBST洗膜5次，每次3min；

K：二抗孵育：用Western blot封闭液稀释二抗，羊抗小鼠-HRP 1:5000，室温轻摇40min；

L：洗膜：TBST洗膜5次，每次3min；

M：ECL反应、胶片曝光：一张8cm×6cm大小的膜用1ml ECL (500μl A液+500μl B液)反应3min，曝光10s(曝光时间随不同 光强度而调整)，显影，定影。

转基因小麦旗叶Western杂交分析结果(图5)显示OsT5-28株 系出现了阳性条带，而非转基因小麦未出现阳性条带，表明目的基因 OsPHR2在小麦转基因植株中得到了稳定正确表达。

实施例6转基因小麦磷素吸收利用特性分析

1)根系特性分析

通过水培实验，设置全磷(磷浓度为0.2mmol/L)、低磷 (0.1mmol/L)和缺磷(0mmol/L)三个处理，每个处理3次重复， 在营养液中培养20天后取样，利用根系扫描仪测定转基因小麦和对 照的根长(L)。从图6和图7中可以看出，转基因小麦的最长根长在 低磷和缺磷条件下均明显高于对照，全磷条件下与对照差异不明显。 转基因小麦的根鲜重在低磷和缺磷条件下略高于对照。表明OsPHR2 基因可以改善小麦的根部特征，从而提高转OsPHR2基因小麦的磷素 吸收利用效率。

2)农艺特性调查分析

郑麦0856与其转基因系相比，田间长势无明显差异，表现为： 半冬性中熟品种，幼苗半匍匐，苗期叶片稍窄，叶色浅绿，长势壮， 冬季抗寒性好；成株期株型松紧适中，旗叶偏大上举，穗下节短，株 行间通风透光性好；平均株高75.4cm，茎秆粗壮，弹性较好，较抗 倒伏；纺锤型大穗，长芒，穗层整齐；籽粒角质，大小均匀，黑胚少， 饱满度好，籽粒外观商品性较好；产量试验结果表明(表1)：郑麦 0856转OsPHR2基因小麦新品系OsT5-28、OsT5-167、OsT5-306较 野生型对照增产显著，分析其产量构成因素发现，穗粒数和千粒重的 提高是其增产的主要因素。

表1：转基因小麦新品系与对照产量试验结果