MicroRNA26b-3p抑制剂在制备人脐带来源间充质干细胞中的应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，本发明提供了MicroRNA26b-3p抑制剂在制备促进人脐带来源间充质干细胞增殖的试剂中的应用，所述试剂包括但不限于：1)MicroRNA26b-3p抑制剂；2)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组载体；3)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组病毒；4)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组病毒载体。本发明实验证明，MicroRNA26b-3p抑制剂可以增加雌激素受体的表达，显著提高人脐带来源间充质干细胞的增殖速度。本发明为人脐带来源间充质干细胞快速增殖以及更快获得再生医学中间充质干细胞的临床应用的细胞提供了新的思路和方式。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及—种MicroRNA26b-3p抑制剂在制 备人脐带来源间充质干细胞中的应用，也即一种促进人脐带来源间充质干 细胞增殖的方法，及其将该方法应用于制备组织工程细胞。

背景技术

间充质干细胞(MSC)是残留在成体组织内的干细胞，具有无限扩增 及多向分化能力，由于MSC细胞的方便获取、较低的免疫原性、没有伦理 争议以及分泌的营养因子，能够抑制免疫反应、促进血管形成、营养周边 细胞，而有望成为再生医学中一种令人振奋的种子细胞。在2011年NIH官 网的一项数据，列举了19364例细胞治疗案例，其中206例是MSC细胞相 关的，用于治疗多种临床病变，部分实验已经到达临床试验III期。(Wang  S,Qu X,Zhao RC.Clinical applications of mesenchymal stem cells[J].J  Hematol Oncol，2012，5:19.)但是，人间充质干细胞体内含量少，即使在 骨髓中，也只占据单核细胞的0.001-0.01％，体外扩增培养会导致跟细胞增 殖阻滞剂相关的衰老，且超过5代后细胞的部分治疗特性会丧失，目前用 于治疗应用的MSC细胞需求量基本都在1.0-2.0×106MSCs/kg，这些都极大 限制了其在临床治疗中的应用。(Ikebe C,Suzuki K.Mesenchymal Stem Cells  for Regenerative Therapy:Optimization of Cell Preparation Protocols[J]. Biomed Res Int，2014，951512.)。间充质干细胞可以从多种组织中分离得 到，其中就包括脐带来源的间充质干细胞，已有许多研究报道其在伤口愈 合、缺血性脑损伤及神经变性性疾病中取得不错的疗效，加之其取材方便、 对人体无伤害是较好的再生治疗细胞，拥有更好的增殖能力，同其他类型 间充质干细胞一样，也面临着有限的增殖能力及体外培养细胞干性进行性 丢失的问题。

miRNA，是一群内源性的小短、单链非编码RNA分子，大约由22个核 苷酸组成，能够通过非完全性碱基互补与靶mRNA特异性的结合而致靶 mRNA降解或抑制蛋白翻译，从而调控基因的表达(Eulalio A,Huntzinger  E,Izaurralde E.Getting to the root of miRNA-mediated gene silencing[J].Cell, 2008,132(1):9-14.)。microRNA调控了体内约60％的蛋白编码序列的表达， 而且一个microRNA分子可以靶向几个mRNA，且目前越来越多的证据表明， microRNA在动物及人体内参与调控MSC分化、增殖、存活、迁移等许多生 理过程(Clark EA,Kalomoiris S,Nolta JA,et al.Concise review:MicroRNA  function in multipotent mesenchymal stromal cells[J].Stem Cells,2014,32(5): 1074-1082)。最近研究报道miR-26b在肝癌、肺癌等许多肿瘤细胞的表达量 下调(Liu XX,Li XJ,Zhang B,et al.MicroRNA-26b is underexpressed in human  breast cancer and induces cell apoptosis by targeting SLC7A11[J].FEBS  Lett，2011，585(9):1363-7.)，并且miR-26b在乳腺癌里可以通过靶向PTGS2、 CDK8等分子抑制癌细胞的增殖(Li J,Kong X,Zhang J,Luo Q,et al. MiRNA-26b inhibits cellular proliferation by targeting CDK8in breast Cancer、 MiRNA-26b inhibits proliferation by targeting PTGS2in breast cancer[J]. Cancer Cell Int，2013，13(1):7.)。

miR-26b位于宿主基因CTDSPs的内含子区，经转录生成miR-26b-5p 及miR-26b-3p两种microRNA分子(http://www.mirbase.org/)。虽然 microRNA与细胞功能的研究越来越多，但目前尚无MicroRNA26b-3p与人 脐带来源间充质干细胞相关的研究及应用的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供MicroRNA26b-3p抑制剂的新用途，本发明的另 一目的在于提供一种促进人脐带来源间充质干细胞增殖的方法，本发明的 第三目的在于提供MicroRNA26b-3p抑制剂或者利用MicroRNA26b-3p抑制 剂促进人脐带来源间充质干细胞增殖的方法在制备组织工程细胞中的应 用。

本发明为了克服人脐带来源间充质干细胞体外培养(制备)中增殖缓 慢的缺陷，提高人脐带来源间充质干细胞在再生医学中的临床应用效果， 提供了借助MicroRNA—具体为MicroRNA26b-3p抑制剂促来实现人脐带来 源间充质干细胞快速增殖的新方法。

本发明所述的MicroRNA26b-3p(MIMAT0004500)，经查找miRBase 数据库，其序列如下：CCUGUUCUCCAUUACUUGGCUC(SEQ ID NO:1)。

本发明的第一方面，提供了MicroRNA26b-3p的新用途，即 MicroRNA26b-3p在制备促进人脐带来源间充质干细胞增殖的试剂中的应 用。

进一步地，本发明提供了MicroRNA26b-3p抑制剂在制备促进人脐带来 源间充质干细胞增殖的试剂中的应用。

本发明所述的促进人脐带来源间充质干细胞增殖的试剂，是指能够抑 制或下调MicroRNA26b-3p表达量的试剂。

所述的能够抑制或下调MicroRNA26b-3p表达量的试剂，包括但不限于 以下任一：

A)MicroRNA26b-3p抑制剂；

B)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组载体；

C)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组病毒；

D)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组病毒载体。

在本发明的一个优选实施例中，所述的MicroRNA26b-3p抑制剂，具体 序列如下：

GAGCCAAGUAAUGGAGAACAGG(SEQ ID NO:2)。

本发明所述的促进人脐带来源间充质干细胞增殖，是指体外培养的条 件下，通过质粒转染或慢病毒感染的方式抑制或下调人脐带来源间充质干 细胞中的MicroRNA26b-3p表达量。

本发明经实验证明，和阴性对照相比，MicroRNA26b-3p低表达的人脐 带来源间充质干细胞增殖速度加快。

本发明的第二方面，提供一种促进人脐带来源间充质干细胞增殖的方 法，该方法包括：构建一种抑制或下调MicroRNA26b-3p表达量(也称为 MicroRNA26b-3p低表达)的人脐带来源间充质干细胞。

较佳地，该方法包括Ⅰ)和Ⅲ)、或者Ⅱ)和Ⅲ)：

Ⅰ)人工合成MicroRNA26b-3p的抑制体，经脂质体转染，获得 MicroRNA26b-3p低表达的的人脐带来源间充质干细胞；

Ⅱ)构建含有MicroRNA26b-3p抑制体的编码基因的重组载体、构建含 有MicroRNA26b-3p抑制体的编码基因的重组病毒，或构建含有 MicroRNA26b-3p抑制体的编码基因的重组病毒载体(简称为 GFP-MIR-26b-3p)；

将获得的重组载体、重组病毒，或重组病毒载体转染人脐带来源间充 质干细胞，获得MicroRNA26b-3p低表达的人脐带来源间充质干细胞；

Ⅲ)步骤Ⅰ)或Ⅱ)得到的MicroRNA26b-3p低表达的人脐带来源间充 质干细胞，放入37℃5％二氧化碳培养箱静置培养，所用培养基同未做处 理的人脐带来源间充质干细胞，均为10％胎牛血清，高糖DMEM。

本发明在人脐带来源间充质干细胞培养时，采用Edu掺入法(Peng F,Wu  H,Zheng Y,et al.The effect of noncoherent red light irradiation on proliferation  and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J].

Lasers Med Sci,2012,27(3):645-53.)测量人脐带来源间充质干细胞的增 殖速度，发现过表达MicroRNA26b-3p抑制剂的人脐带来源间充质干细胞， 比转染阴性对照的人脐带来源间充质干细胞，增殖速度显著加快。

本发明的第三方面，提供了MicroRNA26b-3p抑制剂在制备组织工程细 胞中的应用，以及或者一种促进人脐带来源间充质干细胞增殖的方法在制 备组织工程细胞中的应用。

本发明获得了一种MicroRNA26b-3p低表达的人脐带来源间充质干细 胞(也称为重组人脐带来源间充质干细胞)，所述的重组人脐带来源间充 质干细胞进一步应用于制备组织工程细胞。

本发明的第四方面，提供了一种具有促进人脐带来源间充质干细胞增 殖的产品(试剂)，所述的活性成分为以下任一：

A)MicroRNA26b-3p抑制剂；

B)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组载体；

C)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组病毒；

D)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组病毒载体。

本发明经实验证明，MicroRNA26b-3p抑制剂过表达后，可抑制ESR1 的表达。ESR1，Estrogen receptorα，可以介导17β-雌二醇的促细胞增殖生 物学效应。本发明中过表达MicroRNA26b-3p抑制剂后，通过抑制ESR1的 表达，可显著促进人脐带来源间充质干细胞的增殖。因此说明， MicroRNA26b-3p抑制剂与人脐带来源间充质干细胞增殖有关， MicroRNA26b-3p抑制剂可用于制备人脐带来源间充质干细胞、促进人脐带 来源间充质干细胞增殖。本发明克服人脐带来源间充质干细胞体外培养中 增殖缓慢的缺陷，使人脐带来源间充质干细胞可以大量地、低成本地在再 生医学中得到广泛的临床。

附图说明

图1为RT-PCR检测MicroRNA26b-3p mimicus及Inhibitor的过表达效率；其中 A为人脐带来源间充质干细胞过表达MicroRNA26b-3p mimicus(简称为 ov26b-hUMSC)中MicroRNA26b-3p的表达量；B为人脐带来源间充质干细 胞过表达MicroRNA26b-3p Inhibitor(简称为in26b-hUMSC)中 MicroRNA26b-3p的表达量。

图2为免疫荧光显微镜下观察ov26b-hUMSC、in26b-hUMSC中EdU掺入 率情况；其中A为ov26b-hUMSC掺入率下降；B为in26b-hUMSC升高； C为对照组EdU掺入情况；ABC分别有三幅图，从左至右分别为100倍视 野下染核DAPI、EdU、DAPI与EdU合并的荧光图；D为ov26b-hUMSC、 in26b-hUMSC及对照组nc组中EdU的掺入率的计量图。

图3为RT-PCR和western-blot检测ov26b-hUMSC、in26b-hUMSC中ESR1的表 达；其中A为ov26b-hUMSC中ESR1mRNA表达量下降；B为in26b-hUMSC 中ESR1mRNA表达量上升；C为ov26b-hUMSC及in26b-hUMSCwestern-blot 中的观察结果，变化趋势同RT-PCR。

图4为293T细胞双荧光素酶报告基因实验来检测MicroRNA26b-3p与ESR1的 靶向结合作用。结果显示ov26b组的荧光素酶活性下降而in26b则升高。

图5为明视野下观察在ov26b-hUMSC、in26b-hUMSC分别加入ESR1受体的 激动剂17-β-Estradiol(简称为E2)及抑制剂Fulvestrant(简称为F)后的细 胞生长状态；其中图A为过表达MicroRNA26b-3pmimicus；B为过表达 MicroRNA26b-3p mimicus24h后加入激动剂17-β-Estradiol；C为不做什么处 理的空白对照组；D为过表达MicroRNA26b-3p Inhibitor；E为过表达 MicroRNA26b-3p Inhibitor24h后加入抑制剂Fulvestrant。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限 于此。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未 注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆： 实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述 的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。

实施例中所用的人脐带来源间充质干细胞(hUMSC)来源：取自经过 书面同意的足月产脐带，采用组织分离爬片法分离而来。(Drela  K1,Sarnowska A1,Siedlecka P,et al.Low oxygen atmosphere facilitates  proliferation and maintains undifferentiated state of umbilical cord  mesenchymal stem cells in an hypoxia inducible factor-dependent manner[J]. Cytotherapy,2014,16(7):881-92.)

实施例1：人脐带来源间充质干细胞过表达MicroRNA26b-3p mimicus及 Inhibitor

一、复苏人脐带来源间充质干细胞

从液氮储存罐中取出hUMSC，置于37℃水浴锅中摇晃直至溶解。 1000rpm条件下离心5min，弃上清，加入含FBS的DMEM(L)培养液1ml 悬浮细胞,并转移至T25培养瓶中，加培养液至5ml。置于37℃，5％CO₂培 养箱中孵育，每3天换一次培养液。

二、细胞转染

1.转染MicroRNA26b-3p mimicus及Inhibitor。(购自上海吉玛基因化学 技术有限公司，为能上调或下调hUMSC中MicroRNA26b-3p表达量的RNA 小片段)，转染试剂采用Invitrogen公司的RNAimax Reagent， 根据该公司指南转染细胞。

MicroRNA26b-3p模拟物(mimicus)序列为：

正义链(sense)：CCUGUUCUCCAUUACUUGGCUC(SEQ ID NO:1)

反义链(antisense)GCCAAGUAAUGGAGAACAGGUU(SEQ ID NO:3)

MicroRNA26b-3p抑制剂(inhibitor)序列为：

GAGCCAAGUAAUGGAGAACAGG(SEQ ID NO:2)

1).将生长良好的从步骤一得到的hUMSC于转染前一天接种到12孔板中 (正常培养，37度，5％CO2培养箱)，转染时细胞密度在50％左右。

2).根据Invitrogen公司提供的RNAimax Reagent操作步骤转 染hUMSC。

3).37度，5％CO2培养箱继续培养48小时后，得到ov26b-hUMSC及 in26b-hUMSC，以及其对照组nc-hUMSC、innc-hUMSC。

2.RT-PCR检测细胞中MicroRNA26b-3p的表达，

利用RNAiso Reagent(TAKALA)提取上述获得的四组细胞的总RNA， 并以总RNA为模板，MicroRNA26b-3p引物(杰李公司合成)，进行 QRT-PCR，以U6为内参(杰李公司合成)，以nc-hUMSC、innc-hUMSC 作为对照。结果如图1所示。

实验结果显示，ov26b-hUMSC的相对表达率为20，nc-hUMSC的相对 表达率为1；in26b-hUMSC的相对表达率为0.25，innc-hUMSC的相对表达 率为1。可以看出MicroRNA26b-3p在ov26b-hUMSC表达量上升而 in26b-hUMSC中下降。

引物序列如下：

U6的引物：

U6的逆转录引物：5'AACGCTTCACGAATTTGCGT3'(SEQ ID NO:4)

通用引物：5'CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3'(SEQ ID NO:5)

正向引物：5'GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3'(SEQ ID NO:6)

MicroRNA221-3p的引物：

MicroRNA26b-3p的逆转录引物：

5'GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGA ATTGCACTGGATACGACGAGCC3'(SEQ ID NO:7)

通用引物：5'CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3'(SEQ ID NO:8)

正向引物：5'GGCCTGTTCTCCATTACTTGG3'(SEQ ID NO:9)

实施例2：利用EdU掺入实验研究ov26b-hUMSC及in26b-hUMSC的增殖 特性

取生长状态良好的hUMSC铺于48孔中，待细胞长至50％聚合度时， 按上述方法转染hUMSC后，培养箱孵育48小时后，用EdU试剂盒来检测 细胞的增殖，其中EdU试剂盒购自锐博生物科技有限公司，所有步骤严格 按照此产品的说明书进行。

荧光显微镜下观察，实验结果如图2所示。

实验结果显示，相对于图C对照组(nc组)的EdU掺入荧光量，图A结 果显示ov26b-hUMSC EdU掺入率明显减少，图B结果显示in26b-hUMSCEdU 掺入率明显升高。图D为ov26b-hUMSC、in26b-hUMSC及对照组nc组中EdU 的掺入率的计量图

实施例3、MicroRNA26b-3p可以负调控ESR1的表达

1.RT-PCR检测ESR1mRNA的表达水平

利用RNAiso Reagent(TAKALA)提取上述获得的四组细胞的总RNA, 逆转录为cDNA。设计引物，检测ESR1mRNA表达水平。GAPDH作为检 测用内参。以nc-hUMSC、innc-hUMSC作为对照。

引物序列如下：

ESR1的引物如下：

正向引物:5'ATGAAAGGGATACGAAAAGACCG3'(SEQ ID NO:10)

反向引物:5'TTGGCAGCTCTCATGTCTCC3'(SEQ ID NO:11)

GAPDH的引物如下：

正向引物：5'GGCCTCCAAGGAGTAAGACC3'(SEQ ID NO:12)

反向引物：5'AGGGGTCTACATGGCAACTG3'(SEQ ID NO:13)

结果如图3所示，可见ov26b-hUMSC中ESR1的mRNA表达降低而 in26b-hUMSC中增加。

2.western-blot检测ESR1蛋白的表达水平

(1)去上述RNAiso Reagent(TAKALA)抽提总RNA后的样品来抽提其中的 总蛋白，操作流程参照相应说明书。

(2)用1％SDS溶解蛋白，加入适量的4×Loading Buffer后，在EP管中煮沸 10min.

(3)待样品恢复到室温后上样。

(4)电泳、转膜。

(5)浸没于5％脱脂奶粉封闭液中室温缓慢摇荡一小时。一抗4℃孵育过夜。

(6)根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择辣根过氧化物酶 (HRP)标记的抗体，按相应比例稀释(1:1000～1:10000)，室温轻摇一小 时。

(7)洗涤，使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法。

实验结果如图3图A结果显示同对照组nc-hUMSC相比，ov26b-hUMSC 组ESR1的mRNA表达量显著降低；图B结果显示in26b-hUMSC组相对 innc-hUMSC，ESR1的mRNA表达量显著升高；图C为上述处理过的人脐带来 源间充质干细胞中ESR1蛋白水平的表达量变化。图3结果说明MicroRNA26b -3p可以在ESR1mRNA及蛋白同时抑制ESR1的表达。

实施例4：293T中双荧光素酶报告基因系统检测MicroRNA26b-3p与ESR1 的靶向结合

1.准备质粒以下两种质粒，如下：

(1)pRL-TK质粒，作为拉平转染影响的内参质粒

(2)构建pMIR-Report质粒中带有ESR1CDS序列中MicroRNA26b-3p靶向结 合附近各300bp片段的重组载体(简称为pMIR-ESR1)

(3)将上述两种质粒摇菌并去内毒素抽提试剂盒(购自Axygen公司)抽提， 用于转染细胞。

2.准备细胞

实验采用易繁殖同时转染效率高的工具细胞HEK-293T，以每孔1x10⁴个细胞 每ml的密度铺余96孔板中，设2个复孔。待细胞70-80％融合度时，按上述方 法进行转染。

3.双荧光素酶报告基因实验

试剂盒购自promega公司，并严格按照相应说明书来进行实验。测定完 成后，将Excel表格拷出并进行实验结果整理。

实验结果如图4所示，ov26b组荧光素酶降解的底物减少，说明 pMIR-ESR1表达量下降，也说明MicroRNA26b-3p可以通过DNA碱基配对 ESR1，而in26b组没有预期中的升高，可能是与293T中MicroRNA26b-3p的 本地表达量不高。图4结果显示MicroRNA26b-3p可以通过碱基互补结合 ESR1mRNA,从而抑制ESR1的表达.

实施例5：ov26b-hUMSC、in26b-hUMSC分别加入E2、F后观察细胞增殖 状态

将过表达MicroRNA26b-3p mimicus、Inhibitor及加入激动剂17-β-Estradiol、 抑制剂Fulvestrant后的hUMSC置于倒置显微镜下观察并拍照记录。

实验结果如图5所示，相对于不做任何处理组(blank组)，100×明视野 下ov26b-hUMSC、in26b-hUMSC的细胞数目分别减少、升高，而在加入相 应E2及F后，细胞数量分别有所增加及减少。更加说明，MicroRNA26b-3p 是通过ESR1来起到调控hUMSC细胞增殖。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并 不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前 提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在 本申请权利要求所限定的范围内。