蛋内禽胚胎性别、活力和/或发育阶段确定

摘要

本发明涉及非破坏性的确定蛋内禽胚胎的性别、发育阶段和/或活力的方法，包括(a)在蛋开始孵育直至孵化的时间段内检测选自糖和/或氨基酸、其前体和代谢物的蛋内至少第一发育标志物化合物；(b)测量至少第一检测的发育标志物化合物的量，和(c)将所述量与确立的雌性和雄性、胚胎的发育阶段、和/或活的和死的或未发育胚胎的基准线比较，以确定胚胎是否是活的、雄性和/或雌性、和/或胚胎的发育阶段。

说明书

技术领域

本发明涉及确定蛋内禽胚胎性别、发育阶段和/或活力的方法，通过测 定蛋内，更具体地说是尿囊液中发育标志物的存在。本发明方法进一步涉 及确定禽胚胎活力、和选择雄蛋和雌蛋、以及应用这些选择的蛋生产疫苗 和/或雏禽(chick)的方法。

背景技术

大多数禽类的受精卵，尤其是那些商业饲养的禽类的受精卵，如家鸡 (Gallus gallus domesticus)、鸭、鹅及火鸡倾向于最终孵化出大致均等分布的 雄性和雄性雏禽。在孵化场管理中，可能期望在各种特性尤其是性别的基 础上分离禽类。举例来说，可能期望给雄性和雌性禽类接种不同的疫苗， 或者在雄禽和雌禽的生长速率以及营养需求存在差异的情况下分离群体以 获得饲养效率、提高处理均一性并降低生产成本。而且更进一步，对于商 业化的蛋生产，雄性雏禽的孵育和饲养是极不可取的，导致每年扑杀数十 亿雄性雏禽。

此外，有部分蛋没有受精，或在孵育阶段开始便不含活的胚胎，这大 大降低孵化场的孵化箱的能力。到目前为止，活的胚胎的确定通常采用一 种称为“透光检验”的技术进行，如EP-A-2369336和US7950349中所公开。

其中，用光源检查蛋，所述光源发射能够至少部分通过蛋的波长的光。

尽管这可以鉴定蛋是否含有活的胚胎，然而，为了得到可靠的结果， 需要所述蛋发育到至少第11天，或甚至是其发育更后期。并且，虽然这种 技术可以区分活的和无活力的蛋，它不能可靠地确定未孵化鸟类的性别和 其他特征。

因此，目前所需要的雏禽农场的孵化能力是有早期性别选择，能够仅 主要选择雌性雏禽胚胎所需的至少两倍大。

相应地，通过减少所需能源和其他资源的量，将对环境将有很大价值， 但同样对消除不必要的雄性雏禽扑杀，以及减少新孵化禽类的压力也有很 大价值，如果有早期方法允许在孵育期之前确定禽胚胎的性别，也能大大 增加孵化场的能力。

如果该方法还能够在未受精和/或其他无活力的蛋中选择活的胚胎的 话，另一益处是将进一步提高孵化过程的效率。

Y.Feng等人在Appl.Magn.Reson.(2007),32,257-268公开了通过900 MHz超高场强NMR波谱分析第9天鸡蛋尿囊液中的代谢物。

Gu D.-C.等人，Chinese Journal of Animal Science,Vol.7,23-25公开了通 过HPLC分析蛋养殖孵育期间尿囊液及羊水中游离天冬氨酸、谷氨酸、精 氨酸和亮氨酸浓度。但是，该公开方法未超出产生一个基准线，用于比较 非特定产蛋日期的蛋，仅简单建立四种氨基酸的基准线。此外，该公开的 检查方法是破坏性的，因为有活胚胎的蛋在检查后不能成熟至孵化，或用 于其他用途，例如疫苗生产。

US-A-2003/0096319和WO-A-2006124456公开了通过测定胚胎流体 样品如来自禽类蛋的尿囊液或血液中雌激素类固醇化合物的存在确定蛋内 禽胚性别的方法。虽然不用破坏蛋是可行的，但雌激素类固醇的量很少， 而且只有生殖腺发育后测试才会成功，即在胚胎发育的一个相对较晚的点。 更进一步，WO-A-2006124456的方法似乎也需要对每个种类及其亚类的荧 光标记进行修饰，或对这些种类进行遗传修饰。

Ohta Y.等人，Poultry Science,Vol.80,Nr.10,1430-1346公开了蛋内施加 氨基酸的效应，以观察这如何影响胚胎的氨基酸浓度和来自肉鸡种蛋的其 他蛋内容物。然而，这不是一种确定性别、活力和/或禽蛋的发育阶段的方 法。

发明概述

因此，本发明涉及确定蛋内禽胚胎的性别、发育阶段和/或活力的方法， 包括(a)在从开始孵育蛋直至孵化的时间段内检测蛋内选自糖和/或氨基 酸、其前体和代谢物的至少第一发育标志物化合物；(b)测量至少第一被检 测的发育标志物化合物的量，和(c)将所述量与确立的雌性和雄性、胚胎 的发育阶段、和/或活的和死的或未发育胚胎的基准线比较，以确定胚胎是 否是活的、雄性和/或雌性、和/或胚胎的发育阶段。

另一方面，本发明的方法还涉及确定蛋内禽胚胎的性别和/或活力的方 法，包括(a)在从开始孵育蛋到孵化的时间段内检测蛋内选自糖和/或氨基 酸、其前体和代谢物的至少第一发育标志物化合物；(b)测量至少第一被检 测的发育标志物化合物的量，和(c)将所述量与确立的雌性和雄性、和/或 活的和死的或未发育的胚胎的基准线比较，以确定胚胎是否是活的、雄性 和/或雌性。

更进一方面，本发明涉及根据以上任一项确定蛋内禽胚胎发育阶段的 方法，包括(a)检测蛋内选自糖和/或氨基酸、其前体和代谢物的至少第一发 育标志物化合物；(b)测量至少第一被检测的发育标志物化合物的量，和(c) 将所述量与确立的从产蛋直至孵化的发育阶段的基准线比较，以确定胚胎 的发育阶段和直至可能发生孵化的时间。

附图说明

图1描述了基于¹H NMR中检测到的实验组鸡蛋的所有代谢物，对分 组样品的¹H NMR数据的偏最小二乘法建模，一种无监督多变量数据分析。 F代表雌性，M代表雄性。

图2描述了基于¹H NMR中检测到的商业化鸡孵化场的较大测试组的 所有代谢物，对分组样品的¹H NMR数据的偏最小二乘法建模，一种无监 督的多变量数据分析。F代表雌性，M代表雄性。

发明详述

现在参考附图在下文更充分地描述本发明，其中示出本发明的优选实 施方案。然而，本发明可以以不同形式实施，不应理解为局限于这里列出 的实施例；更确切地说，提供这些实施方案使得该公开详尽和完整，并向 本领域技术人员充分传达本发明的范围。除非另有定义，本文使用的所有 技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员一般所理解的相 同的含义。本发明说明书中使用的术语仅是为了说明特定实施方案，而非 意在限制本发明。

本文使用的术语“禽(avian)”和“鸟(bird)”包括任何雄性或雌性禽类， 但主要意在包含为获取蛋或肉类的商业化饲养家禽。因此，术语“鸟”和 “禽”特别意在涵盖鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和雉鸡。

本文中术语”孵育”指鸟孵化它们的蛋的过程，以及离开了雌禽生殖道后 蛋内胚胎的发育。本文的孵育阶段指不间断的时间，其间特定的蛋被置于 模拟孵蛋的条件中直到孵化，即鸟出现，包括任何操作或从例如孵化器至 孵化单元的转移，假如鸟的发育不停滞的话。

本文使用的“蛋内”指孵化前包含在蛋内的鸟胚胎。本发明可用任意 类型鸟蛋实施，包括但不限于(家)鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉鸡蛋。

本文中术语“注射(injection)”和“注射(injecting)”包含向蛋或胚胎内 插入装置(通常是延长装置)的方法，包括向蛋或胚胎内递送或释放物质的方 法，从蛋或胚胎去除物质(即样品)的方法，和/或向蛋或胚胎内插入探测器 装置的方法。

优选地，本发明的确定以非破坏性的方法进行，即允许如此测试的禽 胚胎生长，如果需要的话，或让它接受其他步骤，例如蛋内疫苗生产，假 如胚胎是活的话。

本文中术语“尿囊液”包含有或没有其他蛋材料存在的尿囊液。例如， 术语尿囊液可包括血液和尿囊液的混合物。本发明的实施方案并不局限于 从尿囊液或从蛋的上表面附近区域提取材料。本文所述的从尿囊液去除材 料，仅作为本发明可能实施方案的一个例子提供。如下所述，各种材料， 包括但不限于羊膜、蛋黄、壳、蛋清、组织、膜和/或血液，可从蛋中提取 并测定，以鉴定一个或多个发育标志物。材料可取自具有几乎任何定向的 蛋。

本文中术语“预先确定的位置”指蛋内固定的位置或深度。例如，装 置可被注射入蛋内至蛋内固定的深度和/或固定位置。在替代实施方案中， 注射可基于从蛋获得的信息进行，例如关于蛋内胚胎或胚下腔的位置。

有利地，“比较所述量”一词可包括被测量代谢物的单变量或优选多变 量分析，和确定禽胚胎与某一群体的相关性。该步骤可包括通过质谱、NMR 或其他测得的合适数据的多变量统计分析，确定样品中分析物即代谢物的 存在。多变量统计分析程序优选包括主成分分析的程序，和/或偏最小二乘 回归分析程序。因此本发明还涉及确定蛋内禽胚胎性别、发育阶段和/或活 力的方法、装置和系统，其包括多变量统计分析程序，以及植入了其确定 方法的微处理器。

本发明实施方案的方法和装置可用于在胚胎发育阶段又称为孵育期间 的任意时间鉴定蛋的一或多个特征。本发明的实施方案并不限于胚胎发育 阶段的特定一天。

在本发明方法中，可优选侵入性或非侵入性分析发育标志物。

如果分析是侵入性进行的，这通常包括提取蛋材料样品。该样品优选 从胚胎流体提取，优选取自尿囊液，因为这将最少损害胚胎。尿囊液通常 是禽胚胎含氮代谢物的排泄媒介。尿囊液从大约孵育第3天开始形成，如 Hamburger V和Hamilton HL(1951).“A series of normal stages in the  development of the chick embryo”.Journal of Morphology 88(1):49-92.所公 开。

在此指出尿囊在孵育65小时后可辨识为短的厚壁袋，还不是囊状的。 72小时后，尿囊为囊状，尺寸各异；平均中脑大小，表明尿囊和尿囊液在 第3天出现。

其在孵育的大约第13天达到最大体积，接着随着孵育继续由于湿度损 失和流体吸收而体积变小，但是在孵育第18天依然以明显体积存在。

尿囊液和蛋壳被内层和外层壳膜和绒毛尿囊膜隔开。尽管尿囊液包围 胚胎化蛋的整个周边，尿囊液通常在蛋的顶部紧挨着覆盖于气腔上的膜下 累积。

尿囊液在蛋的顶部累积是由于紧密胚胎和蛋黄囊的重力和位移导致 的。当蛋垂直时，试图从蛋顶部精确取样尿囊液可能比较困难，因为蛋与 蛋之间的气室是不同的。可使用重力在局部位置收集尿囊液。当蛋延纵轴 转动时，尿囊液将聚集在蛋的顶部，直接位于壳的下方。沿纵轴放置蛋使 得尿囊液有利于提取样品。

从蛋中提取材料如尿囊液可以以多种方式进行，包括穿透蛋壳，并插 入穿过膜的采样插管。接着可以提取待取样的流体样品，而膜和/或壳用合 适的密封胶有效密封，或允许其自身密封。

例如US-A-20070137577、WO-A-00/22921或WO-A-99/34667公开了用 于穿透蛋和侵入性取样蛋材料的合适的方法和装置。如此提取的样品优选 用于合适的方法以检测发育标志物，以及分析存在的发育标志物的相对和/ 或绝对量。

样品可通过任意适合于检测和定量单个发育标志物的方法进行分析。 优选地，通过包括核共振法的磁共振成像法、包括红外或拉曼光谱的光谱 共振法、和/或例如与合适探测器偶联的GC或HPLC的分析方法、荧光光 谱、和/或酶联酶联免疫吸附试验(包括湿法和干法，例如使用试纸法)进行 分析。尽管侵入性的方法允许直接取样，并将取样的流体进行分析，但由 于非侵入性分析方法的效率，以及蛋壳和其中的膜保持未穿孔，优选以非 侵入性进行分析。

任何合适的方法可用于进行该非侵入性分析。通常，可以采用定量光 谱共振方法，包括红外或拉曼光谱法，优选采用二次光谱确定存在于蛋内 的发育标志物的存在以及绝对和/或相对量。虽然一些出版物已公开了非侵 入性的方法的使用，例如US-A-2011/144473和US-A-7950349，但是这些出 版物仅含糊描述总的发射光谱；这在实践中不能够选择胚胎的发育阶段、 活力和/或性别。本发明方法与已公开方法的不同特别在于确定蛋内特定组 分的存在，这可以有利地通过使用二次微分光谱完成，二次微分光谱允许 有选择地寻求一个或多个发育标志物化合物的绝对和相对量。

特别地，微分二阶导数傅里叶转换红外线(FTIR)和FT-拉曼光谱，或其 组合，可以有利地用于实现所需的精度和可重复性，而核磁共振方法可以 适当地用于确定发育标志物的性质，并建立基准线以校准系统。

本发明的方法有利地允许确定胚胎的活力和/或性别，和/或优选从蛋开 始孵育直至孵化的发育阶段。

优选地，确定在开始孵育后1至15天期间执行，更优选2至14天， 还更优选3至13天，再更优选4至12天，例如步骤a)优选在开始孵育蛋 后6至12天期间进行。

这能够避免孵育无活力的和/或不期望性别的蛋涉及的费用。此外，可 以确定蛋的实际发育阶段。对于比家鸡具有更短或更长孵育时间的种类， 可采用适合的其他阶段。

本发明的发育标志物优选选自糖、氨基酸、以及它们各自的代谢物和/ 或前体。

其中，特别重要的发育标志物包括葡萄糖、胆碱和缬氨酸，其中每一 种对禽胚胎性别确定具有统计学显著影响。

不希望受限于任何特定的理论，胆碱和其氨基酸衍生物三甲基甘氨酸， 被认为是特别用于支持胎儿发育中的神经系统。发现胆碱和三甲基甘氨酸 (甜菜碱)的比率在雄性和雌性胚胎之间显著不同，同时胆碱的绝对量在雌性 胚胎的尿囊液中也较高。一般来说，胆碱及其代谢产物为三个主要生理用 途所需：细胞膜的结构完整性和信号功能，胆碱能神经传递(乙酰胆碱合成)， 以及通过其代谢物三甲基甘氨酸(甜菜碱)作为甲基基团的主要来源，三甲基 甘氨酸(甜菜碱)参与S–腺苷甲硫氨酸(SAMe)的合成途径。另一方面也发现 缬氨酸和葡萄糖在雄性和雌性胚胎之间显著不同。

当禽类物种是家鸡时，优选第一或其他发育标志物是葡萄糖，其在雌 性胚胎尿囊液中的绝对量为30μΜ/ml-70μΜ/ml，雄性胚胎尿囊液中的绝对 量为1μΜ/ml-30μΜ/ml。

家鸡胚胎另一第一或其他优选的发育标志物是胆碱，其在雌性胚胎尿 囊液中的绝对量为110μΜ/ml-130μΜ/ml，雄性胚胎尿囊液中的绝对量为 90μΜ/ml-110μΜ/ml，但不包括110μΜ/ml。

家鸡胚胎另一第一或其他发育标志物优选缬氨酸，其在雌性胚胎在尿 囊液中的绝对量为110μΜ/ml-130μΜ/ml，雄性胚胎尿囊液中的绝对量为 90μΜ/ml-110μΜ/ml，但不包括110μΜ/ml。

优选地，本发明方法中在步骤(a)检测至少一个第二标志物，其中分析 所述至少第一和第二标志物，与基准线比较，并彼此比较以建立发育标志 物比率。

通过关联两个或三个标志物的分析，可有利地进一步改进活力和性别 确定的选择性。因此，优选检测和分析至少一个第一和一个第二和/或其他 发育标志物，其中，第一与第二和/或其他标志物的绝对量和比率用于确定 性别和/或活力。

本发明方法进一步有利地包含确定蛋内的胚胎是否是活的和雄性的， 或者是活的和雌性的，并且从活的雌性蛋群组(multitude)中分离出活的雄性 蛋群组，以形成雄性为主或者雌性为主的蛋选择物。

如此形成的活的雌性或者雄性蛋选择物可有利地进行孵育和孵化过 程，以形成雌性或雄性为主的雏禽群体(population)。

本发明方法进一步优选包含注射病毒或病毒样材料至鉴定为含活的胚 胎并且是雄性或雌性的每个蛋中，并且优选地，在孵育后包含从孵育的蛋 分离获得的疫苗。

用种子病毒注射后，含有活的胚胎的蛋优选被转移至孵育箱孵育预定 的时间段。在这一时间段结束时，所述蛋被转移至疫苗收集站，在那里从 每个蛋中提取材料，例如羊水。

相应地，本发明方法优选还包括以下步骤：处死感染的蛋中胚胎，并 从每个处死的蛋收集羊水，其中羊水包含疫苗；优选从羊水分离疫苗。病 毒优选包括人流感病毒，这样收集的羊水包含人流感疫苗。

本发明的发育标志物优选也可用于确定胚龄，或者其他标志物可合适 地使用。

用于测定胚龄的发育标志物优选选自氨基酸，以及它们各自的代谢物 和/或前体。申请人发现，氨基酸，更优选三甲基甘氨酸，也被称为甜菜碱， 天冬氨酸和天冬酰胺，谷氨酸和谷氨酰胺和脯氨酸的绝对和相对量尤其能 够直接与蛋内禽胚胎发育阶段相关。这是高度相关的，因为很少有特征允 许确定禽类胚胎的发育阶段或胚龄，特别是在发育的早期阶段。

本发明的方法因此还优选能够选择基本上相同的发育阶段、或实际胚 龄的蛋，并组合基本上相同胚龄的蛋群组，以使这些蛋进行受控制的孵育。 所得孵化阶段更均一，从而导致更均匀的雏禽群体，由于压力缓解，雏禽 群体质量更高，并减少提早孵化的禽的数量，提早孵化的禽要长时间暴露 于人工孵育条件。

得到的孵化禽群将呈现更高质量，从而得到更高产率，并减少雏禽群 体后续需求，例如通过降低的处理量。

类似地，胚龄选择蛋群的使用也将能够更有效地制备疫苗，因为此处 禽胚胎的发育阶段与注射病毒和收获疫苗最有效的时间点相关。

本发明也涉及蛋选择物，以及孵化后，所述方法可获得的雏禽或雏禽 群体。

以下提供非限制性实施例以说明本发明。

实施例1

蛋内代谢谱方法

家鸡蛋在MS Broedmachines V.O.F.市售的50型号孵化器中，37.8℃孵 育，每一小时翻转。

一组12只蛋孵育9天，第二组12只蛋孵育10天，第三组12只蛋孵 育11天。

从孵化器中取出蛋，置于纸质固定器中，显微镜下，气囊(air sack)向上。 在气囊周围穿刺并打开壳和膜，保持内膜完整。用光线定位在内壳膜上延 伸的血管，避开所述血管，做小穿刺透过内膜和外膜进入尿囊腔。

倾斜蛋，用1ml移液器吹气进入腔内，之后用移液器提取1.5-2ml尿囊 液。尿囊液转移至冷冻管中，立即投入液氮。接着取出样品并保存于-80℃。

通过切去膜并用小勺从蛋中取出胚胎。胚胎置于充满96％乙醇的离心 管中，放置于冰上，保存于室温黑暗环境中。

从-80℃取出尿囊液，解冻并取出1ml样品，置于玻璃管中。

使用玻璃巴斯德吸液器将1ml氯仿和1ml乙醇和水的混合物(1：1)加至 样品中。用盖封闭管，接着摇晃20秒，然后置于4℃，10分钟。使用玻璃 巴斯德吸液管取出1ml上部混合物，并转移至冷冻管。穿刺该冷冻管的盖， 冷冻干燥过夜。该冷冻干燥产物用作NMR样品。

实施例2

蛋内代谢物谱方法

家鸡蛋在Petersime NV市售的工业化孵化器中，37.8℃孵育，每一小时 翻转。一组50只蛋孵育8天，第二组50只蛋孵育9天，第三组50只蛋孵 育10天。

从孵化器中取出蛋，置于纸质固定器中，显微镜下，气囊向上。

在气囊周围穿刺并打开壳和膜，保持内膜完整。用光线定位在内壳膜 上延伸的血管，避开所述血管，做小的穿刺透过内膜和外膜进入尿囊腔。

倾斜蛋，用1ml移液器吹气进入腔内，之后用移液器提取1.5-2ml尿囊 液。尿囊液转移至冷冻管中，立即投入液氮。接着取出样品并保存于-80℃。

通过切去膜并用小勺从蛋中取出胚胎。放于充满96％乙醇的离心管中， 置于冰上，保存于室温黑暗环境中。

从-80℃取出尿囊液，解冻，并将0.5ml样品置于冷冻管中。穿刺该冷 冻管的盖，冷冻干燥过夜。该冷冻干燥产物用作NMR样品。

性别确定-验证：

从乙醇中取出雏禽胚胎，置于室温干燥10分钟。切下左肢的一小部分， 用于使用DNA提取试剂盒(商用Qiagen DNeasy试剂盒)提取DNA，之后使 用nanodrop装置测定DNA量。

使用可商购于Sigma的引物对1271H和1237L的PCR用于确定胚胎性 别。所用的PCR程序为：95℃，5分钟，接着95℃45秒，56℃45秒，72℃ 1分钟，循环36次，之后72℃，5分钟一次。基于得到的PCR产物确定胚 胎性别，通过使用2％凝胶鉴定。

NMR样品制备

如上所述获得的50-100mg样品材料进行二维(2D)-¹H-¹H-J分辨NMR 测定，使用3-(三甲硅烷基)丙酸-2,2,3,3-D4酸(TSP)作为内标，如Nature  Protocols，Vol.5,No.3,2010,536-549页和Phytochemistry 71,2010,773-784 所公开。

实施例1获得数据显示于表1：

表1：雌性和雄性胚胎测量数据

多变量数据分析

基于¹H NMR中检测到的实验组鸡蛋的所有代谢物，偏最小二乘法模 型，一种无监督多变量数据分析应用于对分组样品的¹H NMR数据。所获 得的最重要的信息是两个数据集之间的相关性，即测得的¹H NMR信号(代 谢物)和样品分类(组信息)。

所述分析不仅显示了雄性或雌性胚胎的发育标志物的绝对量，也显示 了相对量。当第二标志物和第三标志物分别加入时，测试的选择性进一步 增加。图1和图2分别显示了实施例1和2的多变量分析结果，与性别确 定重叠。

实施例3

胚龄测定

重复实施例1，但是分析如下已发现与胚胎发育阶段或胚龄确定相关的 发育标志物

表2：第9-11天的测量数据

以上数据清晰显示胚胎的发育阶段能够由一个或多个发育标志物得以 确定。

基于¹H NMR中检测到的实验组鸡蛋的所有代谢物，偏最小二乘法模 型，一种无监督多变量数据分析应用于对分组样品的¹H NMR数据。所获 得的最重要的信息是两个数据集之间的相关性，即测得的¹H NMR信号(代 谢物)和样品分类(组信息)。

多变量模型显示了胚胎性别、胚龄和/或活力与存在的代谢物相对量之 间的相关性。采用替代分析方法，例如GCMS，给出了类似结果，因此确 证了该结果。

分析不仅显示了发育阶段的发育标志物的绝对量，也显示了相对量。 当第二、第三和第四标志物分别加入，测试的选择性进一步增加。

以上实施例清晰显示本发明方法和材料的优势。尽管在以上详细说明 中描述了本发明的几个特定实施方案，该说明并非旨在限制本发明于本文 公开的特定形式或实施方案，应认为它们是说明性的而非限制性的，并且 显而易见，对于本领域技术人员来说本发明并不限定于这些实施例。