一株高效脱氮除磷的反硝化聚磷菌及其应用

摘要

本发明涉及一株高效脱氮除磷的反硝化聚磷菌及其应用，属于环境微生物学领域。该菌株命名为Klebsiella sp.N14，属于克雷伯氏菌属，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.10290。该菌株为革兰氏阴性菌，无芽孢，有厚荚膜，粗短杆状，菌落呈奶白色，中凸，边缘整齐，表面湿润，透明，有光泽。该菌株具有同步脱氮除磷功能，可用于污水生物处理工艺，在含氮磷污水中好氧培养24h后，除磷率为81.79％，脱氮率为85.94％。该菌株反硝化的最终产物鉴定为N2，具有完全反硝化能力，使用该菌株处理含氮磷污水时，能够将水体中硝酸盐氮、亚硝酸盐氮等无机氮直接还原为无害的氮气排出水体，效果突出，成本低，无二次污染。

说明书

技术领域

本发明涉及环境微生物学领域，具体涉及一株高效脱氮除磷的反硝化聚磷菌及其应用。

背景技术

随着科技进步、工农业的发展及人口的增多，世界各国正面临着前所未有的水资源匮乏的危机。我国的人均水资源量不足世界人均水平的1/3，水资源的匮乏已经严重制约了我国工农业的发展，成为我国经济可持续发展的瓶颈。

与水资源短缺相对应的是水环境的污染与水体富营养化。研究表明，富营养化现象同水中氮、磷的含量密切相关，总氮含量大于0.2mg/L或总磷含量大于0.02mg/L时，水体就被视为富营养化。因此如何经济有效地降低废水中的氮磷含量成为当前污水处理研究中的一大热点。

反硝化聚磷菌(Denitrifying phosphorus accumulating bacteria，DNPB)是一类兼有脱氮和除磷特性的聚磷菌，它们能在缺氧条件下以硝酸盐作为电子受体进行同步反硝化(脱氮)和过量吸磷(除磷)过程。它们的发现成功解决了传统工艺中脱氮菌与聚磷菌竞争碳源的问题，同时为解决泥龄差异的矛盾提供了可能，使得脱氮除磷得以同步进行。然而此类菌及其特性的研究都处于初级阶段，没有系统的分离鉴定方法，也没有方便快捷的培养驯化方式。因此，筛选分离出更多的DNPB，并探明它们的种属及特性，明确它们的生长影响因子，是对生物反硝化除磷理论的丰富和补充，将有助于废水生物脱氮除磷工艺的研究、开发和应用。

近年来，国内外学者相继对反硝化聚磷菌的种属组成展开了研究。2008年许彦娟等分离到一株微小杆菌属和三株芽孢杆菌属的DNPB(反硝化聚磷菌的分离筛选及鉴定.河北农业大学学报，2008，31(3):60-63.)；2009年Cao Ngoc Diep等分离到一株假单胞菌属的DNPB(Isolation ofPseudomonas stutzeri in wastewater of catfish fish-ponds in the Mekong Delta and its application for wastewater treatment.Bioresource Technology，2009，100:3787-3791)；2011年HuiLiu等、Qiang Wang等分别分离到一株副球菌属和气单胞菌属的DNPB(Identification and Metabolic Mechanism of Non-fermentative Short-cut Denitrifying Phosphorus-removing Bacteria，Chinese Journalof Chemical Engineering，2011，21(3):332-340.；Screen  and characteristics of a denitrifying phosphorus-removal bacteria.Journal of Biotechnology，2011，136，690-696)；2012年张立成等分离到七株DNPB，分别为：葡萄球菌属、副球菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属、芽孢杆菌属、莫拉氏菌属(七种亚硝化反硝化聚磷菌的生长特性研究.工业用水与废水，2012，43(4):16-19)；CN102827787B于2012年12月19日公开了一株蜡状芽孢杆菌属的DNPB；CN102864098B于2013年1月9日公开了一株假单胞菌属的DNPB；CN103103153B于2013年5月15日公开了一株灿烂类芽孢杆菌属的DNPB；CN103114062B于2013年5月22日公开了一株假产碱假单胞菌属的DNPB。

目前，反硝化聚磷菌的优势种群主要集中在假单胞菌属和芽孢杆菌属，菌种较为单一，且多集中在降解基因和降解机理方面，实际应用研究有限。

发明内容

本发明的目的是提供一株高效脱氮除磷的反硝化聚磷菌，为降解污水中的氮磷污染物提供高效的菌制剂，能将水体中的NO_3--N转化为N₂而排出，具有完全反硝化作用，同时具有好氧吸磷能力。

本发明的另一个目的是提供该反硝化聚磷菌的应用，使该菌株表现出完全的反硝化及除磷活性。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一株高效脱氮除磷的反硝化聚磷菌，该菌株命名为Klebsiella sp.N14，属于克雷伯氏菌属，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2015年1月8号，保藏编号为CGMCC No.10290；

经鉴定所述反硝化聚磷菌Klebsiella sp.N14为革兰氏阴性菌，无芽孢，有厚荚膜，有运动性，能水解淀粉，能利用柠檬酸盐，过氧化氢酶、硝酸盐还原实验呈阳性；菌落呈奶白色，中间凸起，边缘整齐、光滑，表面湿润，透明，有光泽，易挑起；显微镜下观察多数单个排列，粗短杆状，大小为0.5μm×1.0μm。

本发明还提供所述反硝化聚磷菌Klebsiella sp.N14在污水处理中的应用。

所述反硝化聚磷菌Klebsiella sp.N14在污水处理中的应用，包括下述步骤：

①使用前用LB培养基活化菌株：挑取1环上述Klebsiella sp.N14接种于10mL新鲜富集培养基，在pH为8、温度为30℃条件下培养24h，转接种于200mL新鲜富集培养基，恒温培养48h，即可获得菌悬液；

②取活化后的菌悬液接种于待处理的含氮磷污水中，菌悬液接种量为污水体 积的5％，调整OD₆₀₀＝0.1±0.001，在pH为8、温度为30℃条件下摇床震荡培养，震荡频率为140r/min；

③分别于0、4、8、12、16、20、24h取待测水样，再将水样离心取上清液，检测上清液中PO₄^3--P、NO₃^--N、NO₂^--N的浓度变化，检测方法为：PO₄^3--P，钼锑抗分光光度法；NO₃^--N，酚二磺酸分光光度法；NO₂^--N，α-萘胺分光光度法。本发明具有以下优点：

①本发明菌株内含有poly-P颗粒，具有完全的反硝化酶系，能够将NO₃^--N还原为NO₂^--N，再还原为N₂，实现彻底脱氮且对空气无污染。

②本发明菌株具有高效同步脱氮除磷功能，在含氮磷污水中好氧培养24h后，除磷率为81.79％，脱氮率为85.94％。

附图说明

图1是Klebsiella sp.N14Albert染色的poly-P颗粒的显微镜图。

图2是Klebsiella sp.N14生长及脱氮除磷性能与pH的变化关系图。

图3是Klebsiella sp.N14生长及脱氮除磷性能与温度的变化关系图。

图4是Klebsiella sp.N14生长及脱氮除磷性能与碳源的变化关系图。

图5是Klebsiella sp.N14的生长曲线图。

图6是Klebsiella sp.N14在污水中的脱氮除磷性能图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1本发明菌株的富集培养、纯化、筛选及鉴定

(1)培养基

①富集培养基：CH₃COONa·3H₂O 5g/丙酸5mL；KNO₃2.0g；MgSO₄.7H₂O 0.2g；K₂HPO₄2.0g；微量元素2mL；双蒸水1000mL；pH 7.2。

②LB培养基：(液态)酵母浸膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，双蒸水1000mL，pH7.0～7.2；(固态)液态培养基中添加琼脂25g。

③LB-P培养基：LB培养基中添加2.5g K₂HPO₄和0.25gKH₂PO₄，pH7.0～7.2。

④1％BTB-反硝化培养基：CH₃COONa·3H₂O 5.0g；KNO₃2.0g；MgSO₄.7H₂O 0.2g；琼脂20g；1％-BTB 4mL；H₂O 1000mL；pH 7.6。

⑤反硝化缺磷培养基：KNO₃2g/L；CH₃COONa·3H₂O 5g/L；K₂HPO₄0.05g/L；MgSO₄·7H₂O 0.2g/L；CaCl₂0.5g/L；微量元素2mL/L。

⑥反硝化富磷培养基：KNO₃2g/L；CH₃COONa·3H₂O 5g/L；K₂HPO₄0.05g/L；KH₂PO₄0.2g/L；MgSO₄·7H₂O 0.2g/L；CaCl₂0.5g/L；微量元素2mL/L。

⑦微量元素溶液：FeCl₃·6H₂O 1.5g/L；H₃BO₃0.15g/L；CuSO₄·5H₂O 0.03g/L；KI 0.03g/L；Na₂MoO₄·2H₂O 0.06g/L；MnCl₂·4H₂O 0.12g/L；ZnSO₄·7H₂O 0.12g/L；CoCl₂·2H₂O 0.12g/L。

(2)菌株的富集培养、纯化

取污水处理厂好氧池尾水活性污泥，称量10g加入200mL富集培养基中，26℃、140r/min摇床厌氧/缺氧间歇培养，每4d为一周期(每一周期前2d以乙酸钠提供碳源，后2d以丙酸提供碳源，每次置换培养液的50％)，共培养10个周期。

培养结束后吸取0.5mL富集液，进行10^-1～10^-9浓度梯度稀释，从各梯度的稀释液取0.1mL分别涂布LB固体培养基，每个稀释度2个重复，于生化培养箱26℃下培养2-3d。选取形态清晰的单菌落划线分离培养，共挑出形态、大小、颜色不同的菌落48株。长成的单菌落再转接，重复划线培养6次，即得纯菌落。

(3)菌株筛选

①蓝白斑初筛：对已分离纯化的菌株取单菌落，分别点接于1％BTB-反硝化培养基上，于26℃培养2d，选择显蓝色的菌株作为初筛菌株。经挑选显蓝斑的共有23个菌落，此为反硝化菌，分别命名为N1～N23。

②Albert染色复筛：将菌株N1～N23缺氧培养12h后，进行Albert异染颗粒染色，选择具有异染粒染色的菌株即为聚磷菌。染色结果表明有8株菌体(N2、N3、N6、N9、N11、N13、N14、N21)含有poly-P颗粒，结合蓝白斑筛选与异染粒染色结果确定这8株菌为反硝化聚磷菌。LB培养基斜面接种，4℃保存备用。

③种子液培养：将筛选出的8株反硝化聚磷菌分别接入100mLLB液体培养基中，26℃，140r/min摇床培养24h，4000r/min离心20min收集菌体，调整OD₆₀₀＝1.0，无菌生理盐水保存，即为种子液。

④反硝化除磷率测定：分别取5mL种子液接入100mL缺磷培养基中，调整OD₆₀₀＝0.1±0.001，26℃、140r/min通氩气摇床培养12h进行厌氧释磷，4000r/min离心菌体20min，无菌生理盐水洗涤2次，重新悬浮于200mL反硝化富磷培养基中(调整OD₆₀₀＝0.1±0.001)，通氧气，26℃，140r/min摇床培养24h。取10mL培养液，离心后测定上清液中PO₄^3--P、NO₃^--N、NO₂^--N的吸光度。根据吸光度 的变化，按式(1)、式(2)分别计算该菌除磷率和反硝化率。

除磷率：η₁＝(C-C_t)/C×100％           (1) 

反硝化率：η₂＝(A-A_t-B_t)/A×100％       (2) 

式中：η₁—除磷率，％ 

C—PO₄^3-的初始吸光度，abs

C_t—一定时间后溶液中的PO₄^3-吸光度，abs

η₂—反消化率，％

A—NO₃^--N的初始吸光度，abs

A_t—一定时间后溶液中NO₃^--N的吸光度，abs

B_t—一定时间后溶液中NO₂^--N的吸光度，abs

筛选结果见表1。选取反硝化率和除磷率分别大于70％和50％的菌株N6、N11、N13、N14、N23为进一步的实验菌株。

表1好氧培养筛选结果

⑤硝酸盐还原产气试验

为探明N6、N11、N13、N14、N23的反硝化能力和特性，对菌株进行硝酸盐还原产气试验。挑取1环菌落接种于内含10mL灭菌后的反硝化缺磷培养基的小试管中，充分搅拌均匀，加入1mL灭菌后的液体石蜡封口。以未接种的试管作空白对照。将所有试管一同置于26℃恒温培养箱静置培养2d，观察石蜡与培养基之间是否有气泡生成。结果N6、N13为阴性，N11、N14、N23为阳性，说明菌株N11、N14、N23能够将NO₃^--N还原为NO₂^--N，再还原成N₂，具有完全反硝化能力。选取反硝化率和除磷率均最高的菌株N14为进一步研究的高效反硝化聚磷菌。

(4)菌株的鉴定 

①本发明菌株N14的菌落形态特征：在LB培养基上生长2d后菌落呈奶白色， 中间凸起，边缘整齐、光滑，表面湿润，透明，有光泽，易挑起。

②本发明菌株N14的菌体形态特征：显微镜下观察多数单个排列，粗短杆状，大小为0.5μm×1.0μm。

③本发明菌株N14生理生化鉴定：N14为革兰氏阴性菌，无芽孢，有厚荚膜，有运动性；能水解淀粉、能利用柠檬酸盐、过氧化氢酶、硝酸盐还原实验阳性；产氨、产H₂S、V-P、甲基红、氧化酶、产吲哚阴性，初步鉴定本发明菌株N14为克雷伯氏菌(Klebsiella)。

④本发明菌株N14的16S rDNA基因片段的PCR扩增及种属分析：以细菌基因组DNA为模板扩增16S rDNA，采用一对通用引物为扩增引物，用PCR仪(GeneAmp 9700Applied Biosystems公司)进行扩增反应。

上游引物(7F)：5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’；

下游引物(1540R)：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。

PCR反应体系(25μL)：Template 0.5μL，5×Buffer(with Mg²⁺)2.5μL，dNTPs1μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，双蒸水20μL。

PCR程序：98℃预变性3min；98℃变性25s，55℃复性25s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min；4℃终止反应。1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并委托中国生工(上海)生物技术有限公司进行测序。

测序后得到菌株N14的16S rDNA长度为1485bp的序列，如SEQ IDNO：1所示。将菌株序列提交到NCBI进行blast检索，发现菌株N14与克雷伯氏菌属的多个物种相似性在97％以上，确定其属于克雷伯氏菌属，进一步认定其为克雷伯氏菌，命名为Klebsiella sp.N14。

实施例2本发明菌株Klebsiella sp.N14的培养

(1)培养基

选择性培养基母液：CH₃COONa·3H₂O 5g/L；K₂HPO₄0.05g/L；KH₂PO₄0.2g/L；MgSO₄·7H₂O 0.2g/L；CaCl₂0.5g/L；微量元素溶液2mL/L；pH 7.0～7.6。

反硝化富磷培养基：KNO₃2g/L；CH₃COONa·3H₂O 5g/L；K₂HPO₄0.05g/L；KH₂PO₄0.2g/L；MgSO₄·7H₂O 0.2g/L；CaCl₂0.5g/L；微量元素2mL/L。

(2)本发明菌株的培养条件优化

①不同pH值

配制pH值分别为5、6、7、8、9的选择性培养基母液100mL，取5mL菌悬液接种，调整OD₆₀₀＝0.1±0.001，摇床(26℃、140r/min)震荡培养24h，测定OD₆₀₀及上清液中PO₄^3--P、NO₃^--N、NO₂^--N的浓度，计算反硝化率和除磷率，结果见图2。由图2可知，本发明菌株在pH为5～8范围内OD₆₀₀、脱氮率、除磷率逐步上升，在pH为8时生长最好，此时OD₆₀₀为1.26，脱氮除磷效能最佳，除磷率为79.6％，脱氮率为86.5％；但pH为5时OD₆₀₀仅为0.28，脱氮除磷率最低，脱氮率为20.5％，除磷率为32.8％，显示此条件下菌株生长缓慢，脱氮除磷效果不理想；菌株在pH为9的条件下也能较好的生长，此时OD₆₀₀为0.95，脱氮率除磷率依然保持在71％、65％左右。本发明菌株Klebsiella sp.N14脱氮除磷的适宜pH为7～9，最佳pH为8。菌株在pH为5～9范围内生长吸光度与脱氮除磷率呈简单的正态分布，表明菌株脱氮除磷效能与生长代谢呈正相关。

②不同温度 

取5mL菌悬液分别接种于100mL选择性培养基母液，调整OD₆₀₀＝0.1±0.001，pH值为8。分别在20、25、30、35、40℃下，摇床(140r/min)振荡培养24h，测定OD₆₀₀及上清液中PO₄^3--P、NO₃^--N、NO₂^--N的浓度，计算反硝化率和除磷率，结果见图3。由图3可知，菌株在好氧培养24h后，在20～30℃范围内OD₆₀₀、脱氮率、除磷率逐步上升，20℃时OD₆₀₀为0.89，脱氮率、除磷率分别为70.5％、50.2％，可见此温度下菌株能较好的生长，且维持较高的脱氮除磷率，暗示N14可耐受低温生长，可作为耐冷反硝化聚磷菌备选菌种；25℃时除磷率最高，为82.2％；30℃时OD₆₀₀、脱氮率达最高值，OD₆₀₀为1.32，脱氮率为86.9％，除磷率为80.1％；35℃时OD₆₀₀、脱氮除磷率略有下降；40℃时明显降低，OD₆₀₀为0.47，脱氮除磷率分别为40.8％、37.6％。本发明菌株Klebsiella sp.N14的适宜生长温度在20～35℃之间，最佳生长温度是30℃。

③不同碳源 

分别以质量体积比为1％的乙酸钠、丙酸、柠檬酸钠、酒石酸钾钠为唯一碳源，接种于100mL不含碳源的选择性培养基母液，调整OD₆₀₀＝0.1±0.001，在pH为8，30℃条件下，摇床(140r/min)振荡培养24h，测定OD₆₀₀及上清液中PO₄^3--P、NO₃^--N、NO₂^--N的浓度，计算反硝化率和除磷率，结果见图4。由图4可知，当碳源为乙酸钠时本发明菌株Klebsiella sp.N14生长最好，脱氮除磷效能最佳，OD₆₀₀为1.37，脱氮率为88.5％、除磷率为85.6％；其次是丙酸，OD₆₀₀为 1.11，脱氮率为86.4％、除磷率为82.9％；再次为酒石酸钾钠、柠檬酸钠。菌株在以柠檬酸钠为唯一碳源的培养基中生长最差，OD₆₀₀为0.58，脱氮率为30.8％、除磷率为44.7％。

(3)本发明菌株Klebsiella sp.N14的生长曲线测定

挑取1环Klebsiella sp.N14接种于10mL新鲜反硝化富磷培养基，在30℃，pH为8条件下培养24h后转接于200mL新鲜富集培养基，即可得菌悬液；每隔4h取样，分光光度计600nm波长处测定菌体吸光度，结果以OD₆₀₀表示。以培养时间为横坐标，OD₆₀₀为纵坐标绘制该菌株的生长曲线，结果见图5。由图5可知菌株的对数生长期约为10-20h，生长迅速。

实施例3本发明菌株Klebsiella sp.N14在污水处理中的应用

取自江苏省徐州国祯水务运营有限公司调节池的污水200mL，进行脱氮除磷试验，具体步骤如下：

取10mL菌悬液接种于200mL待测污水中，调整OD₆₀₀＝0.1±0.001，在pH为8，温度为30℃条件下，摇床震荡好氧培养，震荡频率为140r/min；分别于0、4、8、12、16、20、24h取检测水样，离心后取上清液，测量上清液中PO₄^3--P、NO₃^--N、NO₂^--N的浓度变化，结果见图6。由图6可见好氧培养过程中上清液磷、硝酸盐氮亚硝酸盐氮的含量逐渐降低，磷的浓度从起始的2.8mg/L降到0.51mg/L，硝酸盐氮的浓度从起始的31.7mg/L降到5.4mg/L，亚硝酸盐氮的浓度从起始的2.95mg/L降到0.23mg/L，24h内本发明菌株对氮、磷的去除率分别达81.79％、85.94％。

Klebsiella sp.N1416S rDNA基因序列表

<110>徐州工程学院 

<120>一株高效脱氮除磷的反硝化聚磷菌及其应用

<160>1

<210>1

<211>1485

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1