咪唑型两性离子毛细管整体柱的制备方法及其用于极性有机小分子的分离

摘要

咪唑型两性离子毛细管整体柱的制备方法，（1）先将石英毛细管依次用盐酸、蒸馏水、氢氧化钠、蒸馏水和甲醇冲洗后，用氮气将其吹干，将含γ-2-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液注入到上述毛细管内，在室温下静置反应后用甲醇冲洗，在氮气流下干燥备用；（2）将1-磺酸丁基-3-乙烯基咪唑内盐与甲酰胺振荡混匀，随后加入丙烯酰胺振荡混匀，再加入N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、二甲基亚砜、PEG-8,000、PEG-10,000和偶氮二异丁腈，混合均匀后注入经（1）步骤处理过的石英毛细管内，随后用硅橡胶塞紧毛细管两端，放入水浴加热反应后，冷却至室温待用。应用于极性有机小分子如三聚氰胺、核苷、碱基和有机酸的亲水作用色谱分离，分离效果和重现性较好，可广泛应用于各种极性有机小分子的分析。

说明书

技术领域

本发明涉及毛细管液相色谱固定相，特别是一种咪唑型两性离子液体亲水作用毛细管整体柱的制备方法及其对极性有机小分子的亲水分离作用。

背景技术

近年来，作为反相液相色谱的补充，亲水作用色谱（HILIC）在极性分子的分离得到了广泛地关注。HILIC采用正相色谱的极性固定相，以水-有机相作为流动相。其流动相与反相色谱的流动相相似，但是有机溶剂的含量比反相色谱的有机溶剂含量高，解决了极性样品的溶解性问题，提高了与质谱检测的兼容性。但是，极性固定相种类的有限性制约了HILIC对多种极性分子分离分析的需求。当前发展新型的亲水性固定相是极性分子研究的活跃领域，以拓宽极性分子的应用范围。

离子液体具有挥发性低、热稳定性和化学稳定性好、与水和有机溶剂可调的粘性和溶解性、以及对有机物与金属离子良好的萃取性能的优点，在分析化学领域得到了较快的发展。在液相色谱领域，除了作为流动相中的添加剂，离子液体修饰的硅胶填料展现了优异的分离性能。Pino等（V. Pino and A. M. Afonso, Anal. Chim. Acta, 2012, 714, 20-37）综述了二十几种离子液体修饰的硅胶填料，只涉及到一种两性离子液体修饰的硅胶填料，但是，该固定相未应用于HILIC分离。此外，许国旺研究组（L, Qiao, A. Dou, X. Shi, H. Li, Y. Shan, X. Lu and G. Xu, J. Chromatogr. A, 2013, 1286, 137-145）发展了一种咪唑两性离子核-壳型硅球色谱固定相并应用于HILIC的分离，得到了较好得分离效果。

以上发展的两性离子液体修饰的固定相，均是基于硅胶基质的。相对于装填硅胶填料的色谱柱而言，采用毛细管整体柱作为液相色谱分离柱，不仅省去了繁琐的填装过程，无需装填筛板或者烧结柱塞，而且整体材料中特有的穿透孔为液体的流动提供了大孔通道，以对流传质取代了缓慢的扩散传质，使得传质阻力明显减小，有利于分离效率的提高，因而得到了越来越多的关注。虽然，离子液体修饰的有机聚合物整体材料在电色谱分离方面有较多的报道，但是，在HILIC分离中，只涉及一种基于吡啶阳离子的两性离子整体柱（Z. Jiang, N. W. Smith, P. D. Ferguson and M. R. Taylor, J. Sep. Sci., 2009, 32, 2544 -2555），该整体柱以1-（3-磺酸丙基）-4-乙烯基吡啶鎓内盐为功能单体、N, N’-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂、甲醇和水作为致孔剂，由于高比例致孔剂水的存在，降低了交联剂的溶解性，导致其重现性较差。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种咪唑型两性离子液体亲水作用毛细管整体柱的制备方法，用于极性有机小分子如三聚氰胺、核苷、碱基和有机酸的（HILIC）分离。

本发明采用以下技术方案实现上述目的：

咪唑型两性离子液体亲水作用毛细管整体柱的制备方法，包括以下步骤：

（1）先将石英毛细管依次用0.5 mol/L 盐酸、蒸馏水、0.5 mol/L 氢氧化钠、蒸馏水和甲醇冲洗后，用氮气将其吹干，将体积比为1：1的γ-2-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液注入到上述毛细管内，在室温下静置反应12小时，随后用甲醇冲洗，在70 °C的氮气流下干燥1小时备用。

（2）将1-磺酸丁基-3-乙烯基咪唑内盐与甲酰胺振荡混匀，随后加入丙烯酰胺振荡混匀，再加入N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、二甲基亚砜、PEG-8,000、PEG-10,000和偶氮二异丁腈，混合均匀后注入上述经（1）步骤处理过的石英毛细管内，随后用硅橡胶塞紧毛细管两端，放入70~80°C水浴加热反应18~20小时后，冷却至室温待用。

所述步骤（2）中的二甲基亚砜与甲酰胺的质量比例为1：2；PEG-10,000与PEG-8,000的质量比为1：0.27~1：1.8，或者分别单独使用；丙烯酰胺与1-磺酸丁基-3-乙烯基咪唑内盐的质量比为1：2~1：5；丙烯酰胺与N, N’-亚甲基双丙烯酰胺的质量比为1：1.4～1：2.8；致孔剂（甲酰胺、二甲基亚砜、PEG-8,000和PEG-10,000）与单体丙烯酰胺、1-磺酸丁基-3-乙烯基咪唑内盐和交联剂N, N’-亚甲基双丙烯酰胺的混合物的质量比为1：10～1：11.8。

将咪唑型两性离子液体亲水作用毛细管整体柱应用于极性有机小分子如三聚氰胺、核苷、碱基和有机酸的亲水作用色谱分离，显示较好的分离效果和较高的重现性。

本发明的优点和积极效果是：将咪唑型两性离子液体作为功能单体，一步法制备了咪唑型两性离子液体亲水作用毛细管整体柱，致孔剂甲酰胺可以较好的溶解功能单体，致孔剂二甲基亚砜增强交联剂的溶解性，提高了整体柱的重现性，制备方法简单，成本低廉，机械强度高，应用于极性有机小分子三聚氰胺、核苷、碱基和有机酸的亲水作用色谱分离，分离效果和重现性较好，可广泛应用于各种极性有机小分子的分析。

附图说明

图1为咪唑型两性离子液体亲水作用毛细管整体柱的制备方法的示意图；

图2为咪唑型两性离子液体亲水作用毛细管整体柱的截面扫描电镜图（×500）；

图3为三聚氰胺的HILIC分离色谱图，色谱峰：（0）甲苯，（1）三聚氰胺；

图4为三种有机酸的HILIC分离色谱图，色谱峰：（0）甲苯，（1）4-羟基苯甲酸，（2）3-羟基苯甲酸，（3）3，4-二羟基苯甲酸；

图5为五种核苷和碱基的HILIC分离色谱图，色谱峰：（0）甲苯，（1）腺苷，（2）尿苷，（3）胞核嘧啶，（4）肌苷，（5）胞苷。

具体实施方式

实施例所用原材料为市售化学纯或分析纯化学试剂，石英毛细管整体柱长30cm，内径150μm。

按照以下步骤制备咪唑型两性离子液体亲水作用毛细管整体柱。

（1）石英毛细管内的预处理

先将石英毛细管依次用0.5 mol/L 盐酸、蒸馏水、0.5 mol/L 氢氧化钠、蒸馏水和甲醇冲洗毛细管，用氮气将其吹干；将体积比1：1的γ-2-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液注入到上述毛细管内；在室温下静置反应12小时；随后，用甲醇冲洗，在70 °C的氮气流下干燥1小时备用。

（2）石英毛细管柱内的合成物

实施例一，将33.4 mg的1-磺酸丁基-3-乙烯基咪唑内盐与408 mg甲酰胺振荡混匀，随后加入10 mg丙烯酰胺振荡混匀，再加入20 mg N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、204 mg 二甲基亚砜、22.5 mg PEG-8,000、40.5 mg PEG-10,000和1.0 mg 偶氮二异丁腈，混合均匀后注入步骤（1）处理过的内径毛细管中，用硅橡胶塞紧毛细管两端，在70 °C水浴恒温中加热20小时后冷却至室温。

实施例二，将33.4 mg的1-磺酸丁基-3-乙烯基咪唑内盐与453.3 mg甲酰胺振荡混匀，随后加入10 mg丙烯酰胺振荡混匀，再加入20 mg N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、226.7 mg 二甲基亚砜、25 mg 的PEG-8,000、45 mg的PEG-10,000和1.0 mg 偶氮二异丁腈，混合均匀后注入步骤（1）处理过的毛细管中，用硅橡胶塞紧所述毛细管两端，在80 °C水浴恒温加热18小时后冷却至室温。

表1所示比例制备的咪唑型两性离子液体亲水作用毛细管整体柱，依次用甲醇和水冲洗整体柱，以便除去未反应的试剂及致孔剂待用。所述6个实施例分别进行了三聚氰胺的理论踏板数，从表1所列实施例一的三聚氰胺理论踏板数最高为最好组合，现选用实施例1中的比例制备的整体柱的扫描电镜图如图2所示。

表1、咪唑型两性离子液体亲水作用毛细管整体柱合成实例

*理论踏板数测定条件：以乙腈：甲酸缓冲盐（10 mmol/L，pH 9.0）=92：8为流动相，流速1.2 μL/min的条件下，检测波长214 nm，进样0.2微升，整体柱长30厘米，内径150微米。

具体应用实施例：

实施例三，为了验证所研制的咪唑型两性离子液体亲水作用毛细管整体柱对三聚氰胺的分离性能，应用以上实施例1中的比例制备的整体柱，整体柱长30厘米，内径150微米，以乙腈：甲酸缓冲盐（10 mmol/L，pH 9.0）=92：8为流动相，流速1.2 μL/min的条件下，检测波长214 nm，进样0.2微升，死时间标记物甲苯和三聚氰胺在整体柱上得到了较好的分离效果（图3），洗脱峰依次为：（0）甲苯；（1）三聚氰胺。

实施例四，为了验证所研制的咪唑型两性离子液体亲水作用毛细管整体柱对有机酸的分离性能，应用以上实施例1中的比例制备的整体柱，整体柱长30厘米，内径150微米，以乙腈：甲酸缓冲盐（20 mmol/L，pH 3.0）=94：6为流动相，流速1.2 μL/min的条件下，检测波长214 nm，进样0.2微升，死时间标记物甲苯和三个样品在整体柱上达到了基线分离（图4），洗脱峰依次为：（0）甲苯；（1）4-羟基苯甲酸；（2）3-羟基苯甲酸；（3）3，4-二羟基苯甲酸。

实施例五，为了验证所研制的咪唑型两性离子液体亲水作用毛细管整体柱对核苷和碱基的分离性能，应用上述例1中的比例制备的整体柱，整体柱长30厘米，内径150微米，以乙腈：甲酸缓冲盐（20 mmol/L，pH 4.0）=92：8为流动相，流速1.2 μL/min的条件下，检测波长214 nm，进样0.2微升，死时间标记物甲苯和五个样品在整体柱上达到了基线分离（图5），洗脱峰依次为：（0）甲苯；（1）腺苷；（2）尿苷；（3）胞核嘧啶；（4）肌苷；（5）胞苷。

在如上相同的分离条件下，验证了所研制的咪唑型两性离子液体亲水作用毛细管整体柱的分离重现性，同一整体柱运行三次保留时间的相对标准偏差（RSDs）为0.18%～0.46%；同一批次三根整体柱保留时间的相对标准偏差（RSDs）为2.33%～4.20%；三个批次整体柱保留时间的相对标准偏差（RSDs）为3.07%～6.50%。

上述三组的相对标准偏差小于10%都符合要求，尤其是同一整体柱运行三次保留时间的相对标准偏差（RSDs）值很小，表明其重现性很好，可以用于重复多次分离实验。