基于毛细管虹吸效应与苯硼酸识别原理的多羟基化合物快速检测方法

摘要

本发明涉及一种基于毛细管虹吸效应与苯硼酸识别原理的多羟基化合物快速检测方法，是基于功能化苯硼酸衍生物对糖类等多羟基化合物的特异识别原理以及毛细管虹吸效应建立的一种目视高度速测法，首先将功能化苯硼酸衍生物修饰于毛细管内壁，通过毛细管虹吸效应自动吸入样品，进而利用壁上苯硼酸与含有1,2-或1,3-二醇基团的单糖、多糖、肾上腺素、ATP、多巴胺等多羟基化合物形成复合物后发生溶胀，进而导致毛细管内壁的亲疏水性的改变，由此引起刻度毛细管内液面规律性上升或下降，通过刻度毛细管内样品的液面高度得到待测样品中多羟基化合物含量，具有用量少、成本低、快速、直观、灵敏等特点。

说明书

技术领域

    本发明属于化学与生物医学检测领域，涉及一种基于毛细管虹吸效应与苯硼酸识别原理的多羟基化合物快速检测方法。

背景技术

   糖类（如单糖和多糖）等多羟基化合物是自然界动植物体内、农产品以及化学产品中普遍存在的一类重要成分，具有独特的生物医学功能，例如，葡萄糖是一种含5个羟基和1个醛基的单糖，其在人体体液中浓度是人体健康状况的重要指标，尤其对于糖尿病人，其血糖的监控十分重要。同时，人体内含有1,2-或1, 3-二醇基团的肾上腺素、ATP、多巴胺等多羟基化合物也是与人类一些重大疾患（老年性痴呆、帕金森病、抑郁症等）息息相关的重要标志物。此外，糖类等多羟基化合物也是绿色天然产物、农产品以及重要化工产品与原料中有效成分，其速测分析对鉴定这些产品的组成以及监控其生产进程具有十分重要的意义。因此，糖类等多羟基化合物的检测将在化学、生物、环境、医药、农业以及化工产品分析中发挥重要作用。

目前，糖类等多羟基化合物的主要检测方法有高效液相色谱法﹑气相色谱法、分光光度法﹑旋光度法﹑生物传感器法等，这些方法尚存在种种局限性，例如，高效液相色谱法和气相色谱法虽然灵敏度高，但存在单个样品分析时间长、色谱柱易污染、不便携带、不适合现场速测等缺点；分光光度法需加入一些分析显色剂，并且检测的特异性较低；同时鉴于糖类等多羟基化合物的结构的复杂性，旋光度法仅能作为一种辅助检测方法；生物传感器法由于具有线性检测范围宽、灵敏度高、成本较低等优点, 在最近几年得到了蓬勃发展，但大多都采用相同的酶催化反应机理，应用上存在诸多缺点。例如，用于糖类分析的生物传感器大多依靠糖类氧化酶的作用，通过检测催化反应消耗的O₂浓度的降低或释放的H₂O₂浓度的升高来间接测定糖类，普遍存在酶的催化活性易受温度、湿度、pH 值和有毒物质的影响等问题。特别是，现有的糖类等多羟基化合物的检测手段，大多涉及贵重而大体积的光电仪器的使用、操作过程复杂、耗时、分析结果不直观、难以现场应用等一些问题。 

玻璃毛细管是内径等于或小于1.0 毫米的玻璃细管，因管径有的细如毛发故称毛细管。毛细管的一些特殊性质及成本低等优点而被应用于各种研究分析中。例如，毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道、以高压高直流电场为驱动力的常见液相分离分析技术，包含电泳、色谱及其交叉内容。此外，基于毛细管的传感器也被应用于光化学检测和电化学分析，例如《Determination of pyruvic acid by using enzymic fluorescence capillary analysis 》提出了一种基于酶催化反应的丙酮酸“荧光毛细分析法(FCA)”。该方法采用一个专用支架和常规医用毛细管，用以替代传统荧光池, 实现了对微量样品中丙酮酸的分析，但需要外来动力以吸取样品，并需使用大型荧光仪才能完成测定操作。最近，《Development of a long-life capillary enzyme bioreactor for the determination of blood glucose》构建了一种以毛细管为反应器的酶催化反应分析装置用于血糖的检测，该装置通过在毛细管壁表面固定葡萄糖氧化酶，实现对血液中葡萄糖的电化学测定。但是，目前这些分析方法中，毛细管仅是样品分离通道或活性物质（如酶）的固定化表面，样品的吸入尚需使用流动注射或泵等辅件，均未涉及毛细管的虹吸效应，同时，不仅涉及前述的活性物质（如酶）的使用局限性，而且尚需依赖外来信号检测仪器（如荧光仪和电化学仪）才能完成定量分析，不能快速、直观地获取定量分析结果。

发明内容

     本发明针对现有技术存在的上述缺点，提供了一种基于毛细管虹吸效应与苯硼酸识别原理的糖类等多羟基化合物快速检测方法，用于血液、天然产物、农产品以及化工产品中单糖、多糖以及其它含有1,2-或1, 3-二醇基团的肾上腺素、ATP、多巴胺等多羟基化合物的直接速测分析。本发明检测方法借助毛细管的虹吸效应实现样品的吸入（无需使用流动注射或泵等辅件），进而通过目测刻度毛细管中虹吸样品液面的高度，直接读取样品中糖类等多羟基化合物含量，具有用量少、成本低、快速、直观、灵敏的特点，克服了现有技术在糖类等多羟基化合物的测定方面存在的诸多缺点，同时，相对于常见酶类活性识别体，本发明以苯硼酸及其衍生物作为糖类等多羟基化合物的识别体，还具有价格低廉、稳定不易失活等优点。

    本发明基于毛细管虹吸效应与苯硼酸识别原理的多羟基化合物快速检测方法，包括以下步骤：

（1）毛细管表面修饰功能化苯硼酸衍生物

    用2.0 mol/L NaOH-乙醇溶液清洗毛细管的内外管壁，再用超纯水清洗，40 ℃烘干，然后，依次用4.0～8.0wt%的十六烷基三甲基硅烷-乙醇溶液和4.0～8.0wt%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷-乙醇溶液分别浸泡12h，取出后用无水乙醇清洗，干燥，然后用2.0～4.0wt%戊二醛-水溶液浸泡毛细管30min，再用pH 6-12的PBS缓冲液清洗，干燥，将干燥后的毛细管中吸入2.0～6.0 mg/mL的功能化苯硼酸衍生物-PBS缓冲液溶液，静置12 h，再次用pH 6-12的PBS缓冲液清洗，干燥，得内部修饰了功能化苯硼酸衍生物的毛细管；

 （2）用内部修饰了功能化苯硼酸衍生物的毛细管检测多羟基化合物含量

ⅰ）建立标准曲线

配制浓度梯度含待测多羟基化合物的标准溶液， 将内部修饰了功能化苯硼酸衍生物的毛细管插入配制的标准溶液中，待毛细管中液面不再变化，记录毛细管中液面变化的高度差值，得多羟基化合物浓度-液面高度差值的标准曲线；

ⅱ）待测样品中多羟基化合物含量的测定

配制待测样品溶液，将内部修饰了功能化苯硼酸衍生物的毛细管插入待测样品溶液中，待毛细管中液面不再变化，测量毛细管中液面变化的高度差值，根据多羟基化合物浓度-液面高度差值的标准曲线确定多羟基化合物含量。

步骤1）中，所述的毛细管优选带刻度毛细管。

步骤1）中，所述的功能化苯硼酸衍生物-PBS缓冲液溶液优选浓度为4mg/mL，功能化苯硼酸衍生物优选氨基苯硼酸，如3-氨基苯硼酸等。  

步骤2）中，配制标准溶液及待测样品溶液时，优选浓度范围为0～50mM。

本发明方法中，若无特别指出，步骤1）中的溶液，溶剂均为乙醇；2）中的溶液，溶剂均为pH 6-12的PBS缓冲液。

本发明快速检测方法中，所述的多羟基化合物主要为糖类等多羟基化合物，包括血液、天然产物、农产品以及化工产品中单糖、多糖以及其它含有1,2-或1, 3-二醇基团的肾上腺素、ATP、多巴胺等。

本发明快速检测方法适用于无色和有色样品中多羟基化合物的速测，所述的无色样品为无色中草药、无色天然产物或无色烟草样品等，所述的有色动物样品为有色动物样品（如血液和尿液）、有色中草药（如三七）或有色天然产物（如紫薯）等；尤其适用于1,2-二醇基或1, 3-二醇基的单糖和二糖等糖类、ATP、多巴胺和肾上腺素等多羟基化合物的速测，如葡萄糖等。

本发明基于毛细管虹吸效应与苯硼酸识别原理的多羟基化合物快速检测方法的速测原理：本发明是基于功能化苯硼酸衍生物对糖类等多羟基化合物的特异识别原理以及毛细管虹吸效应建立的一种直接、快速定量检测方法，即目视高度速测法，首先将功能化苯硼酸衍生物修饰于毛细管内壁，通过毛细管虹吸效应自动吸入样品，进而利用壁上苯硼酸与含有1,2-或1, 3-二醇基团的单糖、多糖、肾上腺素、ATP、多巴胺等多羟基化合物形成复合物后发生溶胀，进而导致毛细管内壁的亲疏水性的改变，由此引起刻度毛细管内液面规律性上升或下降，从而通过目测刻度毛细管内样品的液面高度，实现了对待测样品中糖类等多羟基化合物含量的速测分析。例如，以葡萄糖的速测为例，其与苯硼酸结合反应式如下：

                                                

由上述反应式可知，功能化苯硼酸衍生物是疏水单体，其苯硼酸在水溶液中以带负电的解离态和不带电的非解离态两种形式存在, 两种状态之间存在解离平衡。其中只有带电荷的形式可以与具有1,2-或1, 3-二醇基团的多羟基化合物形成可逆的五元或六元环酯。当葡萄糖与解离态苯硼酸形成稳定的复合物后，会引起解离平衡的移动, 致使解离态苯硼酸增加，进一步与葡萄糖反应。根据以上理论，在非葡萄糖环境中，苯硼酸基团的疏水作用占主导，随着环境中葡萄糖浓度的升高， 解离的苯硼酸基团与葡萄糖反应而导致亲水性增强，由此引起管内液面上升，通过目测刻度毛细管内样品的液面高度，实现对葡萄糖含量的直接测定。

本发明一种基于毛细管虹吸效应与苯硼酸识别原理的多羟基化合物快速检测方法，与现有技术相比其有益效果在于：

    （1）本发明快速检测方法通过在刻度毛细管内壁修饰具有特异识别糖类等多羟基化合物功能的苯硼酸衍生物，进而借助被测样品中糖类等多羟基化合物与管壁上苯硼酸结合引起其亲水程度的变化，导致刻度毛细管内虹吸的液体高度的变化进行定量分析，不涉及复杂的光电换能器的使用；同时，利用毛细管的虹吸效应实现样品的吸入，无需使用流动注射或泵等辅件；

    （2）本发明采用的刻度毛细管具有廉价、便携、并呈现一体化设计特点，既是被测液容器和反应容器，又是功能识别分子的固定化载体；其定量方式直观、快捷，目视高度即可，通过刻度毛细管中虹吸液面的高度变化来直接定量被测液中糖类浓度，检测结果与经典比色法的定量结果相一致；

（3）本发明操作简单、检测时间短、灵敏度高（0.0016～40 mmol/L糖类）、试样用量少（20μL），真正实现了微量样品的微量分析，并适于对各种样品体系中糖类等多羟基化合物含量的快速、灵敏、微量化以及可现场应用的速测。

附图说明

图1为本发明基于毛细管虹吸效应与苯硼酸识别原理的多羟基化合物快速检测方法示意图，（其中1为十六烷基三甲基硅烷，2为(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，3为戊二醛，4为氨基苯硼酸）；

图2为不同多羟基化合物样品溶液吸入毛细管内高度变化；

图3为不同多羟基化合物样品溶液吸入毛细管内的亚甲基蓝的吸光度；

图4为不同浓度葡萄糖标准溶液对应的毛细管内液面高度；

图5为葡萄糖浓度-液面高度的标准曲线和葡萄糖浓度-吸光度标准曲线；

图6为实施例1血糖浓度-液面高度差值的标准曲线；

图7为实施例2甜菊糖中糖类浓度-液面高度差值的标准曲线；

图8为实施例3乙二醇浓度-液面高度差值标准曲线；

图9为实施例4金银花样品的糖类浓度-液面高度差值标准曲线。

具体实施方法

下面结合具体实施例进一步描述本发明，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均包括在本发明的范围内。

一、本发明基于毛细管虹吸效应与苯硼酸识别原理的多羟基化合物快速检测方法可行性验证： 

    载玻片疏水角见表1，表1中，A为未经处理的载玻片，B为6.0wt %的十六烷基三甲基硅烷-乙醇溶液和6.0wt %的3-氨基丙基三乙氧基硅烷-乙醇溶液处理的载玻片，C为2.5wt%戊二醛-水溶液和4 mg/mL的3-氨基苯硼酸-PBS缓冲液溶液处理的载玻片，D-I分别为C载玻片经过浓度为的0.0016 mM、0.016mM、0.08 mM、0.4 mM、2 mM和5 mM的葡萄糖溶液处理后疏水角的变化。

                      表1载玻片疏水角

未经处理的载玻片倾向于亲水，B载玻片，与未处理的A载玻片相比疏水性增强，C载玻片，因修饰上了苯硼酸而获得最强疏水性。同时，从D-I可以看出，葡萄糖浓度越大，苯硼酸反应越多，亲水性越强，疏水角越小，从而证明了本发明方法的可行性。

二、本发明基于毛细管虹吸效应与苯硼酸识别原理的多羟基化合物快速检测方法选择性测试：

将内部修饰了氨基苯硼酸的毛细管分别插入不同的多羟基化合物样品溶液中，样品溶液预先加入亚甲基蓝等有色溶液，多羟基化合物样品溶液为1.0 mM 的L-苯丙氨酸、赖氨酸、酪氨酸、抗坏血酸、壳聚糖、多巴胺、蔗糖、果糖和葡萄糖等，待毛细管中液面不再变化，记录毛细管中吸入的液面变化的高度差值，结果如图2所示，由此可知，检测样品不同，其液面上升的高度差值也不相同，该方法不仅对葡萄糖有响应，对果糖，蔗糖等糖类和多巴胺等多羟基化合物也有不同程度的响应；同时，采用经典比色法进行对照测定，将有色溶液从刻度毛细管中吹出，稀释到20μL采用比色法测其吸光度（亚甲基蓝662 nm处），结果如图3所示，可见，本发明通过直接高度目测定量的快速测量方法与经典比色法测定的结果相一致；因此，本方法不仅可以用来测人体内血糖和尿糖的含量，还可应用于其它天然产物（如紫薯）、中草药（如三七）、烟草类（烟碱）、以及化工体系产品（如二醇）中糖类等多羟基化合物的速测。

三、本发明基于毛细管虹吸效应与苯硼酸识别原理的多羟基化合物快速检测方法与经典比色法结果对照：以检测样品中葡萄糖为例。

    采用本发明方法，通过目视高度速测实现对样品中葡萄糖类多羟基化合物的速测，配制不同浓度的葡萄糖标准溶液，然后将内部修饰了氨基苯硼酸的刻度毛细管分别插入不同浓度的葡萄糖标准溶液中以反应结合其中的葡萄糖，然后待刻度毛细管中虹吸的液面不再变化，目测并记录刻度毛细管中虹吸的液面变化的高度差值（如图4所示），得到葡萄糖浓度-液面高度差值的标准曲线（方程式y = 3.1107+1.0954x）（如图5所示）；然后配制待测样品溶液，将内部修饰了氨基苯硼酸的刻度毛细管插入待测样品溶液中，根据读取样品在刻度毛细管中虹吸的液面高度差值，代入葡萄糖浓度-液面高度差值的标准曲线，计算得到待测样品中葡萄糖浓度。

采用比色法进行对照测定（验证），将内部修饰了氨基苯硼酸的刻度毛细管分别插入不同浓度的葡萄糖标准溶液，待刻度毛细管中液面不再变化，将有色溶液从刻度毛细管中吹出，用PBS缓冲液稀释到20μL，在662nm（亚甲基蓝）处测其吸光度，通过比色建立葡萄糖浓度-吸光度标准曲线；然后将内部修饰了氨基苯硼酸的刻度毛细管插入待测样品溶液中，用与标准溶液同样方法测其吸光度，并根据葡萄糖浓度-吸光度的标准曲线方程式y = 0.4261+0.1530x（如图5所示），计算待测样品中葡萄糖浓度。

结果比较表明，本发明快速检测方法与经典比色法测定的结果相一致。

实施例1：血液中葡萄糖含量的速测

     1）毛细管表面修饰功能化苯硼酸衍生物

    用2.0 mol/L NaOH-乙醇溶液清洗毛细管的内外管壁，再用超纯水清洗，40 ℃烘干，然后，依次用6wt%的十六烷基三甲基硅烷-乙醇溶液和6wt%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷-乙醇溶液分别浸泡12h，取出后用无水乙醇清洗，干燥，然后用3wt%戊二醛-水溶液浸泡毛细管30min，再用pH 7的PBS缓冲液清洗，干燥，将干燥后的毛细管中吸入4mg/mL的3-氨基苯硼酸-PBS缓冲液溶液，静置12 h，再次用pH 7的PBS缓冲液清洗，干燥，得本实施例内部修饰了功能化苯硼酸衍生物的毛细管；

2）血糖的速测：

    将内部修饰了氨基苯硼酸的刻度毛细管分别插入含有浓度依次为2.5 mM、2.8 mM、3.5 mM、4.7 mM、5.5 mM、6.3 mM、7.4 mM、7.9 mM、8.3 mM和9 mM的葡萄糖的血液中，待刻度毛细管中液面不再变化，记录刻度毛细管中虹吸的液面变化的高度差值，得到血糖浓度-液面高度差值的标准曲线及其定量方程式y = 3.2609 + 0.1121 x（如图6所示）；

然后将内部修饰了3-氨基苯硼酸的刻度毛细管插入待测葡萄糖浓度的血液中，待刻度毛细管中液面不再变化，记录刻度毛细管中虹吸的液面变化的高度差值，将高度差值带入方程式y = 3.2609 + 0.1121 x中，计算得各待测血液样品中的血糖浓度，例如，当毛细管虹吸高度差值为3.9 cm时，得到的葡萄糖浓度为5.7 mM。

实施例2：农产品样品中糖类的速测

以甜糖菊样品中糖类测定为例，采用超声辅助水提取方法，将农产品甜糖菊样品在50℃烘箱中干燥10 h，在研钵中研碎，准确称取0.50 g，置于烧杯中，加入超纯水20 mL，超声提取30 min，放置至室温，定容至25 mL，用0.45 μL微孔滤膜过滤后得样品准备液，将不同糖类含量的样品准备液用PBS缓冲液稀释至1.0 mL，制得已知糖类含量的具有浓度梯度的甜糖菊样品溶液。

    1）毛细管表面修饰功能化苯硼酸衍生物

步骤同实施例1；

    2）甜糖菊样品中糖类速测

   将内部修饰了氨基苯硼酸的刻度毛细管分别插入已知糖类含量的具有浓度梯度的各甜糖菊样品溶液中，待刻度毛细管中液面不再变化，记录刻度毛细管中虹吸的样品液面变化的高度差值，建立甜菊糖样品的糖类浓度-液面高度差值标准曲线和定量方程y = 3.2092 + 0.1286 x（如图7所示）；

    然后将内部修饰了氨基苯硼酸的刻度毛细管插入待测甜糖菊样品溶液中，待刻度毛

细管中液面不再变化，记录刻度毛细管中虹吸的液面变化的高度差值，将高度差值带入标准曲线的定量方程式y = 3.2092 + 0.1286 x 中，计算得各待测甜糖菊样品中糖类含量。

实施例3：化工产品中乙二醇含量的速测

    1）毛细管表面修饰功能化苯硼酸衍生物

步骤同实施例1；

2）乙二醇含量的速测

    将内部修饰了氨基苯硼酸的刻度毛细管分别插入已知浓度梯度的乙二醇标准溶液中，待刻度毛细管中虹吸液面不再变化，记录刻度毛细管中虹吸的标准溶液液面变化的高度差值，建立乙二醇浓度-液面高度差值标准曲线和定量方程y = 3.7363 + 0.0424 x（如图8所示）；

 将内部修饰了氨基苯硼酸的刻度毛细管插入待测乙二醇样品溶液中，待刻度毛细管中液面不再变化，记录刻度毛细管中虹吸的液面变化的高度差值，将高度差值值带入标准曲线的定量方程式y = 3.7363 + 0.0424 x 中，计算得各待测乙二醇样品浓度。

实施例4：中草药中糖含量的速测

以金银花中糖类等多羟基化合物的测定为例：采用实施例2同样的超声辅助水提取方法，制得已知糖类含量的具有浓度梯度的金银花样品溶液；

    1）毛细管表面修饰功能化苯硼酸衍生物

步骤同实施例1；

2）糖类含量速测

将内部修饰了氨基苯硼酸的刻度毛细管分别插入已知糖类含量的具有浓度梯度的各金银花样品溶液中，待刻度毛细管中液面不再变化，记录刻度毛细管中虹吸的样品液面变化的高度差值，建立金银花样品的糖类浓度-液面高度差值标准曲线和定量方程y = 3.3673 + 0.0953 x（如图

9所示）；

将内部修饰了氨基苯硼酸的刻度毛细管插入待测金银花样品溶液中，待刻度毛细管中液面不再变化，记录刻度毛细管中虹吸的液面变化的高度差值，将高度差值代入标准曲线的定量方程y = 3.3673 + 0.0953 x 中，计算得各待测金银花样品中糖类含量。

按照本实施例4金银花样品的提取方法和检测方法，分别测定淡竹叶、大青叶、蒲公英、黄连和秦皮等中草药样品中糖类含量，结果如表2所示。

             表2不同中草药样品中糖类含量的测定结果