控制玉米穗行数和穗粒数的DNA片段、分子标记与应用

摘要

本发明属于玉米基因工程领域，涉及一种控制玉米穗行数和穗粒数的DNA片段、分子标记与应用。得到一个控制玉米穗行数的主效QTL KRN4基因，其序列如SEQ ID NO：1所示。同时得到主效QTL KRN4基因的等位基因，它们的序列如SEQ ID NO：2-5所示。KRN4位点位于玉米第4染色体上，该位点控制玉米雌穗的穗行数和穗粒数等重要产量性状。通过相关试验证实KRN4通过影响下游ZmSBP30基因的表达，进而影响玉米穗行数、穗粒数、轴粗、单穗产量等产量性状，可明显增加玉米的行粒数和穗粒数，达到增产目的。还开发出相关的分子标记引物，可用于玉米的标记辅助选择。

说明书

技术领域

本发明属于玉米基因工程技术领域。具体涉及一种控制玉米穗行数和穗粒数的DNA片段、分子标记与应用。所述的DNA片段，从玉米一种多效性QTL KRN4中克隆得到，位于玉米第4染色体上。该QTL控制玉米果穗的穗行数、穗粒数、轴粗及单穗产量等重要产量性状。本发明公开了一个控制穗行数QTL KRN4的分离克隆、功能验证及应用，本发明还涉及基于该QTL的分子标记开发与应用。

背景技术

粮食安全一直是关系到国计民生的重大问题。玉米(Zea may L.)是当今世界最重要的粮食、饲料、工业原料和能源作物，在保障世界粮食安全、经济发展及缓解能源危机等方面作用巨大。与1990年相比，我国2010年玉米总产量增加了1.83倍，但总产的增加主要依赖于种植面积的增加，单产提高对总产增加的贡献约35％～40％。由于土地供给的刚性制约，为满足我国国民经济持续发展对玉米的需求，提高玉米单位面积产量是遗传育种学科的重大课题。

玉米育种的理论和实践证明，自交系的产量与其杂交种的产量密切相关(Richey，1946)。从上世纪30年代到90年代，美国玉米杂交种的产量逐步提高，伴随玉米杂交种产量从1930S的5.9吨/公顷增长到1980S的9.1吨/公顷，自交系产量从2.1吨/公顷增长到4.5吨/公顷；自1949至1996年期间，我国玉米产量增加8.88倍，其中，播种面积增长1.25倍，而单位面积产量却提高了3.29倍。玉米产量的提高至少40％的增产因素归因于品种改良。在不同的种植密度下，杂交种产量与自交系产量平行增长的趋势是一致的(Duvick，1999)，这说明自交系产量的改善对提高杂交种产量至关重要。在特定种植密度下，单位面积的产量由玉米单穗籽粒产量与穗数组成，而单穗籽粒产量又由穗行数、行粒数和百粒重组成。可见，产量是一个非常复杂的性状，直接对产量性状进行遗传分析是一个非常复杂、困难的研究课题，而将产量性状分解成各个产量组成因子分别研究无疑是一个较好的选择。穗行数是一个重要的产量组成因子，与产量显著正相关(刘纪麟，2000)，探明穗行数形成的遗传机理有助于阐明玉米产量性状形成的遗传机理，也可为玉米产量性状的遗传提供理论指导和新的基因资源。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种控制玉米穗行数、穗粒数、轴粗及单穗产量的多效性QTLKRN4基因，根据KRN4位点中两个与穗行数显著关联的位点1.2-Kb PAV和S23，设计基于PCR的经济便捷的分子标记引物，这些标记引物可用于玉米产量的遗传改良。其中KRN4在近等基因系H21材料中的序列如SEQ ID NO：1所示，KRN4在H21^NX531(中国典型培养物保藏中心，CCTCC NO.P201504)中的序列如SEQ ID NO：2所示，S23在H21(来自国家农作物种质保存中心)中的序列如SEQ ID NO：3所示，S23在H21^NX531中的序列如SEQ ID NO：4所示，S23在玉米自交系W138(来自国家农作物种质保存中心)中的序列如SEQ ID NO：5所示。KRN4基因具有提高玉米穗行数、穗粒数、轴粗及单穗产量的功能。

本发明的另一个目的在于提供了一种基于KRN4基因的分子标记引物，针对H21及H21^NX531KRN4序列差异，设计基因标记引物，通过分子标记辅助选择方法，能够准确快捷的区分控制穗行数等性状等位基因型的优劣，即选择具有与H21^NX531相同的等位基因型的自交系作为优异的等位变异用于玉米的遗传改良。

本发明的最后一个目的在于提供了一种控制玉米穗行数、穗粒数、轴粗及单穗产量QTLKRN4基因及其分子标记引物在农作物增产中的应用，通过增加农作物穗行数、穗粒数、轴粗，不降低百粒重，达到增产的目的。

本发明的技术方案如下所述：

本发明通过关联分析和图位克隆技术分离与玉米第4染色体4.08bin控制玉米穗行数、行粒数、穗粗及穗粒重的主效QTL KRN4，我们将这个基因命名为KRN4基因或QTL KRN4基因，并对该候选基因KRN4进行生物学验证，对KRN4基因的功能位点1.2-Kb PAV和S23开发出相关分子标记引物，用于鉴别优良KRN4等位基因型，同时进行分子标记辅助选择用于玉米的遗传改良。

申请人提供了一种控制玉米穗行数和穗粒数的多效性QTL的制备方法，其步骤如下所述：

提取H21(来自国家农作物种质保存中心)及KRN4QTL近等基因系H21^NX531(我们将这个材料命名为玉米属玉米种Zea mays L.玉米自交系H21-NX531，于2015年1月6日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：P201504)植株叶片总DNA，根据对KRN4精细定位获得的KRN4的3Kb的基因范围，利用玉米B73参考基因组RefGen_v2设计引物扩展KRN4的引物KRN4primer，具体序列如下所示：

左端引物：5’AATGTAGCCCATAGTACACTCTATGA 3’

右端引物：5’AGTGGAGATAGAAAAGTTGCATTAGCCA 3’

另外，KRN4调控的基因ZmSBP30(GRMZM2G460544)启动子区的一个插入缺失S23和穗行数显著关联，该zmSBP30p3-3标记引物具体序列如下：

左端引物：5’TTGTAGACGCCAGGTACTTGCGCTTGT 3’

右端引物：5’GTCATGTATACCGTTTGGTTCTAGTG 3’

利用KRN4primer标记引物和zmSBP30p3-3标记引物PCR扩增玉米叶片DNA H21和H21^NX531，PCR扩增程序：94℃预变性5min，然后以94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸2min，进行35个循环，最后72℃延伸5min。扩增体系如表1：

表1 玉米H21和H21^NX531叶片DNA扩增体系

组分 体积(μL) 10×Buffer 2 MgCl₂1.5 dNTP(10mM) 0.4 Taq(5U/μL) 0.2 左端引物(5μM) 1 右端引物(5μM) 1 DNA(10ng/μL) 2 ddH2O 11.9 Total 20

其中KRN4primer引物在H21中可扩增出1.8Kb的核苷酸序列，而在H21^NX531中可获得3Kb的核苷酸序列。zmSBP30p3-3标记引物在H21中可获得500bp的核苷酸序列，在H21^NX531中可获得1.2Kb的核苷酸序列，在自交系W138中可获得800bp的核苷酸序列。将扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切胶回收，连接至pGEM-T Easy载体(购自Promega公司，pGEM-T Easy载体图见图6)，筛选阳性克隆送至Invitrogen公司进行测序，获得SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：5所示的序列。

申请人提供了一种基于KRN4在H21和H21^NX531间核苷酸序列的差异进行PCR分子标记的设计方法，具体步骤如下所示：

根据KRN4在H21和H21^NX531间核苷酸序列的差异，针对1.2-Kb PAV和S23位点的插入缺失，设计特异引物扩增目标片段，所述的引物序列如下：

针对1.2-Kb PAV的M7标记引物：

左端引物：5’TTAATACTTGCGTCATCTCTATTCTACG 3’，

右端引物：5’ATCTCTAAGCACTCTTGCGCAAATCAAT 3’，

针对S23位点的引物如上述公开的zmSBP30p3-3标记引物。 

用M7引物扩增H21基因组DNA可获得700bp的条带，扩增H21^NX531基因组DNA可获得1.9Kb的条带。用zmSBP30p3-3引物扩增H21基因组DNA中可获得426bp的条带，在H21^NX531中可获得1120bp的条带。上述两种条带可通过扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳(5V/cm的电压)20min，再通过溴化乙锭染色5min后，于紫外灯下可清晰地将条带分开，并区分来自H21和H21^NX531的不同等位基因型。表明根据KRN4在H21和H21^NX531间核苷酸序列的差异设计的分子标记具有便捷、可靠和实用的特点。

本发明控制玉米穗行数、穗粒数、轴粗及单穗产量QTL可以在农作物增产中进行应用，具体应用方法如下所述：

利用KRN4设计的分子标记引物M7和zmSBP30p3-3用于自玉米交系优良KRN4等位基因的筛选。步骤为：以玉米自交系基因组DNA为模板，用KRN4的分子标记引物M7和zmSBP30p3-3进行PCR扩增，对扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳(电压为5V/cm，电泳时间为20min)，然后经溴化乙锭染色后紫外灯下检测，其中M7标记引物可扩增出1.9Kb片段，zmSBP30p3-3标记引物可扩增出1120bp片段，筛选所得的自交系材料携带有KRN4优良等位基因。

将选取的携带KRN4优良等位基因的玉米自交系，与带有KRN4劣势等位基因的待改良的自交系进行杂交，将杂交后代通过和待改良的自交系进行回交，并利用分子标记引物M7和zmSBP30p3-3在每一个后代中进行检测，选取携带有优良等位基因的材料进行回交后代和待改良的材料进行回交，通过回交4代以上即可达到自交系分子标记辅助改良的效果。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明在玉米中克隆并证实了一个控制穗行数、穗粒数、轴粗及单穗产的主效QTL KRN4基因，证实了玉米中穗行数、穗粒数、轴粗及单穗产和KRN4的不同等位基因型相关。

(2)本发明为玉米产量改良提供了新的自然变异位点。

(3)本发明为玉米高产育种提供了功能标记引物，且本发明提供的分子标记高效、便捷、经济。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是H21中的KRN4基因的部分核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：2是H21^NX531中的KRN4基因的部分核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：3是H21中的S23基因的部分核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：4是H21^NX531中的S23基因的部分核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：5是W138中的S23基因的部分核苷酸序列。

图1：玉米穗行数主效QTL KRN4的关联分析的曼哈顿图及利用连锁分析验证KRN4位点。

附图标记说明：图1中的A图：x轴为玉米第四染色体4.08bin KRN4位点SNP的物理位置，y轴为利用混合线性模型且用群体结构控制下计算得到穗行数关联的-log10(P-value)。下方的热图指示关联到的9个SNP间的连锁不平衡的状态。图1中的B图：利用连锁群体NX531×YE107、TY6×Mo17和TY6×W138对KRN4位点进行连锁验证，多年多点结果证实，KRN4位点存在主效穗行数主效QTL。

图2：玉米穗行数主效QTL的精细定位。

附图标记说明：图2中的A图是KRN4位点的纯和重组单株的基因型和重组单株穗行数子代测验的表型及显著性水平。根据纯和重组单株子代测验结果可将KRN4定位于M6-M8间的3Kb范围内。图2中的B图表示的为M6-M8区段在精细定位群体亲本H21及H21^NX531间核苷酸序列的多样性，相对于H21，H21^NX531间存在两个片段共计1.2Kb的插入。

图3：KRN4位点通过影响ZmSBP30基因的表达而控制穗行数。

附图标记说明：图3中的A图是在H21和H21^NX531间，位于KRN4两侧的两个候选基因在穗行数发育时期的差异表达分析。图3中的B图是利用纯和的重组家系对ZmSBP30和GRM541进行差异表达分析。图3中的C图是随机选取38个玉米自交系，根据KRN4的基因型分组，即和H21^NX531KRN4一致的自交系(H组，N＝12)以及和H21KRN4一致的自交系(L组，N＝26)，对其在穗行发育时期的小穗进行ZmSBP30基因表达量进行的检测结果。图3中的D图是38个自交系中ZmSBP30基因表达量和穗行数的相关性分析。

*P<0.05；**P<0.01

图4：KRN4和ZmSBP30基因区段的关联分析结果。

附图标记说明：图4中的A图是通过重测序和基因型分析，在KRN4以及ZmSBP30基因区域检测到的和穗行数关联的4个位点，以及由S23和1.2-Kb PAV组成的单倍型的关联情况。图4中的B图是S23位点和1.2-Kb PAV在玉米自交系群体里组成的六种单倍型及单倍型的穗行数。

图5：KRN4位点分子标记检测不同自交系的凝胶图。

附图标记说明：图5中的A图是根据S23位点和KRN4在H21及H21^NX531间核苷酸的差异位点开发的分子标记zmSBP30p3-3；图5中的B图是根据S23位点和KRN4在H21及H21^NX531间核苷酸的差异位点开发的分子标记引物M7；利用分子标记检测24份玉米自交系的琼脂糖凝胶电泳图。其中Marker为DL2000Marker，所指示的条带大小从上到下依次为2Kb、1Kb、750bp、500bp、250bp和100bp。

图6：是本发明应用的pGEM-T Easy载体图(显示多克隆位点，载体购自Promega公司)。

具体实施方式

以下实施方式进一步定义本发明，描述了KRN4的精细定位、克隆、作用机理和分子标记开发的方法及应用。根据以下的描述和实例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出适当的完善和修改，以使其适用各种用途和条件。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规分子生物学技术。

实施例1：KRN4的精细定位

利用申请人所在的华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室构建的513份具有广泛遗传变异的自交系群体，以及全基因组(48962个和557893个)的SNP标记信息和2年5点的穗行数表型，采用群体结构控制下的混合线性模型，对玉米穗行数进行全基因组关联分析。本发明涉及的513份关联群体以及标记信息可参见Li，Q在《PLoS ONE》(公共科学图书馆)2012年第5期第7卷e36807页发表的《Genome-Wide Association Studies Identified Three Independent Polymorphisms Associated withα-Tocopherol Content in Maize Kernels》(全基因组关联分析检测到三个独立的多态性位点和玉米籽粒的α-生育酚显著关联)一文，以及Li，H等人发表在《Nature Genetic》(自然遗传)2013年第1期43～50页的《Genome-wide association study dissects the genetic architecture of oil biosynthesis in maize kernels》(利用全基因组关联分析解析玉米籽粒油份含量的遗传基础)一文。在第四染色体4.08bin位置检测到一个和穗行数显著关联的位点，如图1中的A图所示，我们将该位点命名为KRN4，该位点KRN4位于玉米第四染色体198.8Mb-200.1Mb。选择2个高穗行数的自交系NX531(国家农作物种质保存中心)和TY6(国家农作物种质保存中心)，以及三个低穗行数的自交系YE107(国家农作物种质保存中心)、Mo17(国家农作物种质保存中心)和W138(国家农作物种质保存中心)，组建了三套F₂连锁群体：NX531×YE107、TY6×Mo17和TY6×W138，分别选取在KRN4区间内有 多态性的标记zmSBP30p3-3对三套连锁群体进行基因型分析，对F_2:3家系进行穗行数表型分别在2011年河北保定、2012年湖北武汉和2012年河北邢台进行表型的测定，通过单标记分析，三个群体均在KRN4检测到主效QTL，加性效应最高可达1.01，如图1中的B图所示，表明该位点为穗行数主效QTL。

根据关联分析检测的KRN4位点及该位点SNP的基因型选择具有穗行数高且具有KRN4增效等位基因的玉米自交系NX531为供体亲本，穗行数低且具有KRN4减效等位基因的自交系H21为受体亲本，通过回交四代构建KRN4位点近等基因系H21^NX531。利用H21^NX531以及H21构建的超过10000株的分离群体筛选得到在KRN4位点的31个重组单株，其中13个代表性的重组单株发展了纯和的重组家系以及针对每一个重组单株发展了纯和重组家系及纯和非重组家系的分离群体，并在2013年海南三亚、2014年湖北武汉及2014年河北保定进行了三点的表型鉴定，并针对目标区段开发新的分子标记引物，最终将KRN4精细定位到ZmSBP30下游～60Kb的一个3KB的区段内，如图2中的A图所示。在H21和H21^NX531间，KRN4位点存在两个片段共1.2Kb的插入缺失(1.2-Kb PAV)，如图2中的B图所示。

实施例2：KRN4通过调控ZmSBP30基因的表达影响玉米穗行数

通过精细将KRN4缩小到3Kb的基因间区段，位于GRM541(GRMZM2G001541)和ZmSBP30(GRMZM2G460544)基因间。对H21和H21^NX531雌穗穗行发育时期的小穗，分别为花序分生组织和成对小花分生组织发育时期(Ear S1)以及小花分生组织发育时期(Ear S1)进行取样，并采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取总RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板，对通过GRM541和ZmSBP30进行相对表达量测定，结果显示相对于H21^NX531，H21幼穗中ZmSBP30表达量显著提高了3倍，而对GRM541表达量并未表现出明显变化，如图2中的A图所示。表明KRN4不调控GRM541的表达，而是影响ZmSBP30的表达。为进一步验证KRN4调控ZmSBP30，选取重组家系RL4、RL5、RL6、RL7、RL8和RL12及H21和H21^NX531的幼穗的表达分析，结果显示，当重组家系携带KRN4^H21时，ZmSBP30表达量相对于携带KRN4NX531的材料显著上调，而穗行数降低，而GRM541基因的表达量并未一致性改变，如图3中的B图所示，证实KRN4作为顺势作用原件调控了ZmSBP30的表达。且ZmSBP30的表达量和穗行数呈负相关。为进一步证实KRN4位点不同等位基因型对ZmSBP30表达的影响，随机选取38个玉米自交系材料，根据KRN4位点基因型可分为含有KRN4^H21(L)的自交系和含有KRN4^NX531(H)的自交系，对38个自交系Ear S1时期ZmSBP30相对表达量进行了测定，结果显示有KRN4^H21(L，N＝26)的自交系的ZmSBP30的表达量显著高于KRN4^NX531(H，N＝12)的自交系， 如图3中的C图，且ZmSBP30的表达量和穗行数呈显著负相关，如图3中的D图所示。

因此根据表达分析证实，KRN4影响ZmSBP30基因的表达，且根据Chuck，GS等发表在《Proc Natl Acad Sci USA》(美国国家科学院院刊)2014年的《Maize SBP-box transcription factors unbranched2and unbranched3affect yield traits by regulating the rate of lateral primordia initiation》(玉米的SBP-box转录因子unbranched2和unbranched3通过调控侧向原基的起始影响产量性状)中，ZmSBP30负调控的玉米的穗行数。因此证实KRN4是影响玉米穗行数的重要自然变异位点，其调控模式是通过调控下游基因ZmSBP30的表达量，进而影响玉米的穗行发育。

实施例3：S23位点和1.2-Kb PAV位点组合的单倍型和穗行数显著关联，并指示可用于区分KRN4位点优良单倍型及劣势单倍型

为进一步检测KRN4位点以及ZmSBP30区段可能与玉米穗行数显著相关的自然变异位点，我们设计引物扩增KRN4区段以及ZmSBP30位点，对“实施例1”所述的关联分析群体进行PCR重测序，根据所获得不同自交系的序列，进行SNP和InDel的抽提，并利用混合线性模型进行关联分析，结果显示共有4个位点和穗行数显著关联，分别是KRN4全段内的1.2-Kb PAV，ZmSBP30基因启动子区的插入缺失S23，ZmSBP30第三个外显子的SNP S35和ZmSBP303’端非翻译区的SNP S45，如图4中的A图所示。且S35和S45高度连锁不平衡，因此可用更为显著的S35代替S45。选取1.2-Kb PAV、S23、S35进行单倍型分析，结果显示：S23和1.2-Kb PAV(S23-1.2-Kb PAV)组成的单倍型和穗行数显著关联(P-value＝2.37E^-13,N＝441)，且显著性远高于S23-S35(P-value＝2.28E^-08,N＝430)、S35-1.2-Kb PAV(P-value＝2.41E^-09,N＝430)和S23-S35-1.2-Kb PAV(P-value＝8.64E^-11,N＝410)。而且S23-1.2-Kb PAV和S23-S35、S35-1.2-Kb PAV、S23-S35-1.2-Kb PAV、S35呈现高度的连锁不平衡(R²>0.74)，如图4中的A图所示。因此，在广泛的自交系群体中S23-1.2-Kb PAV，可充分代表KRN4高行单倍型(即优良等位基因)和低行单倍型(即劣势等位基因)。对与玉米自交系群体，利用S23-1.2-Kb PAV组合，可检测到六种单倍型(Hap1-Hap6)，其中仅有包含Hap1的自交系呈现较高的穗行数(P＝6.4E^-18,Student’s t-test)，因此Hap1是KRN4位点的优良单倍型，即H21^NX531或是NX531所携带的单倍型，如图4中的B图所示。

实施例4：通过分子标记辅助选择KRN4优良等位基因，进行玉米自交系穗行数的遗传改良

根据上述实施例3的结果可见，KRN4位点的1.2-KB PAV和ZmSBP30启动子区的S23位点 为和穗行数显著相关的位点。因此本发明对这两个多态性位点开发了分子标记M7和zmSBP30p3-3，通过随机选取24个自交系材料，利用M7和zmSBP30p3-3进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳检测，可将24个自交系KRN4的等位基因进行很好的划分，如图5中的A图为zmSBP30p3-3标记凝胶电泳图，图5中的B图为M7凝胶电泳图。其中玉米自交系NX531-TY7携带为KRN4优良等位基因，其标记条带大小如图5所示，M7标记条带大小为1.9Kb，zmSBP30p3-3条带大小为1.1Kb。本实例选取的24个自交系如表1所示。

选取穗行数低的自交系H21作为改良对象，选取穗行数高且携带优良KRN4的自交系NX531为供体材料。通过H21×NX531后不断和H21回交，且每个世代用M7和zmSBP30p3-3鉴定，选取携带KRN4^NX531的回交后代继续和H21回交，连续回交四代，并自交至BC₄F₂，在分离群体中，比较携带纯和的KRN4^NX531单株和纯和的KRN4^H21单株的产量性状表型，得到如表2和表3所示的结果。

表2 分子标记M7和zmSBP30p3-3所检测的条带大小及对应自交系的穗行数

上述自交系材料均为公开释放的自交系，可从国家农作物种质保存中心(北京)获取。

表3 通过分子标记回交导入优良KRN4等位基因的遗传效应

结果显示，导入优良KRN4等位基因可以显著改良H21的穗行数、穗粗、轴粗、穗粒数、单穗产量。且在增加穗行数的同时并不影响百粒重。因此通过导入优良KRN4等位基因具有提高玉米产量的效果，例如通过将穗行数提高2行，即可增加25.7％的单穗产量。

主要参考文献 

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Li H,Peng Z,Yang X,Wang W,Fu J,Wang J,Han Y,Chai Y,Guo T,Yang N,Liu J,Warburton ML,Cheng Y,Hao X,Zhang P,Zhao J,Liu Y,Wang G,Li J,Yan J.Genome-wide association study dissects the genetic architecture of oil biosynthesis in maize kernels.Nat Genetics,2013,45(1):43-50. 

Chuck GS,Brown PJ,Meeley R,Hake S.Maize SBP-box transcription factors unbranched2 and unbranched3 affect yield traits by regulating the rate of lateral primordia initiation.Proc Natl Acad Sci USA,2014,111(52):18775-18780。