hsa-miR-1260b在非小细胞肺癌转移中的作用及其应用

摘要

本发明公开了一种hsa-miR-1260b在非小细胞肺癌淋巴转移诊断中的作用及其应用。本发明旨在利用microRNA芯片技术筛查与NSCLC侵袭转移相关的microRNA，探讨其在肿瘤侵袭和转移中的作用，并预测可用于血清检测，评估其作为临床上NSCLC转移的早期诊断、恶性分级和预后评估的可行性。

说明书

技术领域

本发明涉及miRNA在癌症诊断中的应用，以及其用作非小细胞肺癌淋巴转 移的诊断用途。

背景技术

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均位于恶性肿瘤之 首。非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)约占其80％，近些 年疗效虽有提高，但长期生存率仍较偏低，绝大多数患者确诊时已是癌症晚期， 只能采取姑息性治疗，预后较差。

侵袭和转移是癌细胞从原发性部位转移到远端部位形成肿瘤的过程，它是 一个多步骤、多因素参与的复杂生物学过程，是导致NSCLC复发和影响预后 的重要因素，也是导致患者死亡的主要原因，目前对NSCLC的侵袭和转移机 制尚不清楚。一直以为肿瘤的发生是由一系列致癌基因和抑癌基因突变逐步形 成的，但随着非编码RNA的发现，此传统观念被改变。最近的研究表明，非编 码RNA中的成员microRNA分子广泛参与了肿瘤侵袭和转移过程中的基因表达 调控，这一发现为肿瘤转移的诊断和治疗提供了新的思路。

microRNA是由内源基因编码，长约19-24nt的非编码小RNA，可通过形成 RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC)与靶基因3’端 非翻译区(untranslated region,UTR)互补结合，诱导mRNA的切割降解，翻译 抑制或其他形式的调节机制抑制靶基因的表达。目前已发现的人类microRNA 已达1000多种，超过50％的microRNA基因定位于肿瘤相关的染色体座位或其 易感位点，并证实部分microRNA异常表达与特定的肿瘤有着密切的关系，并 参与了恶性肿瘤发展的多个过程，包括细胞分化、增殖、侵袭和转移。

microRNA在NSCLC的侵袭和转移中起至关重要的作用。Grawford等将 miRNA-126转染入肺鳞癌细胞系，与空白对照组及转染入无序pre-microRNA 的细胞相比，前者细胞的侵袭和转移能力下降。Yu等将高危险性(死亡危险 比>1)的microRNA前体和保护性(死亡危险比<1)的microRNA前体分别转 染入低侵袭性和高侵袭性的肺癌细胞系中，发现转入高危险性microRNA的肺 癌细胞系渗入基质胶膜的侵袭性增强，而转染保护性microRNA的肺癌细胞系 侵袭性降低，表明这些microRNA与肺癌的侵袭转移相关。Zhang等利用茎环 状反转录实时PCR方法(stem-loop qRT-PCR)对20对NSCLC和癌旁组织的 miR-21进行了定量，并利用western blot技术检测了miR-21的靶基因PTEN的 表达情况，发现miR-21在NSCLC中有较高的表达，而抑癌基因PTEN的蛋白 表达情况则相反，接着将载有miR-21转录抑制子的质粒转染NSCLC细胞，结 果显著降低了细胞的生长和侵袭作用，表明miR-21的表达降低了抑癌基因 PTEN的表达，促进了NSCLC细胞的生长和侵袭。Zhu等的研究也发现，miR-21 通过靶向多个肿瘤转移抑制基因，调控乳腺癌、肺癌的侵袭和转移。Wang等用 microRNA芯片技术筛选出了在肺癌和癌旁两种细胞中有显著表达差异的 miR-183，并发现miR-183与肺癌细胞的转移潜能负相关，推测其为潜在的转移 抑制因子，进一步的研究发现，miR-183的过表达抑制了肺癌细胞的转移和侵 袭。

microRNA的研究不仅为肿瘤发生发展机制的探明提供了新的思路和方 法，而且在临床诊疗和预后评估方面显示了很高的应用价值。microRNA参与了 肿瘤发生发展的各个阶段，每一个阶段都有相应的microRNA发生变化。而且， microRNA具有很好的组织特异性，经筛查检测48个microRNA确定肿瘤的组 织来源准确率达90％。同时，microRNA又具有肿瘤发生的阶段特异性，同一 种肿瘤在发生发展不同分期阶段具有不同的microRNA表达谱。因此，microRNA 可以作为一种有效的肿瘤标志物用于癌症的早期诊断、恶性分级、个性化诊疗 和预后判断等，甚至可以作为肿瘤治疗的靶点，指导临床用药。

虽然肿瘤组织microRNA表达谱与肿瘤发病及预后相关，但是检测技术复 杂、创伤大，难以真正用于临床诊断，而外周血血清较易获得和检测，临床应 用便捷，利于推广，并且microRNA在血清中能够长期稳定存在，不易被RNA 酶降解，煮沸、反复冻融、酸碱环境、长期保存等极端条件均不会造成血清 microRNA的损失。更重要的是，血清中microRNA表达谱的变化与肿瘤的组织 密切相关，能够提示肿瘤的状态。Chen等的研究显示，在非小细胞肺癌血清中， miR-25和miR-223表达显著上调。Ng等以血清miR-92作为分子标志物，可以 诊断Ⅰ～Ⅳ期的结直肠癌，灵敏度可达89％，特异性达到70％。这充分体现了 血清microRNA在肿瘤诊疗中的应用价值。

随着microRNA研究的深入，必将为NSCLC的侵袭和转移机制研究提供新 的策略和方案。但迄今为止，发现的与NSCLC侵袭和转移相关的microRNA数 量有限，且这些microRNA的功能和作用机制尚不清楚。

因此，本发明旨在利用microRNA芯片技术筛查与NSCLC侵袭转移相关的 microRNA，探讨其在肿瘤侵袭和转移中的作用，并进行血清学验证，评估其作 为临床上NSCLC转移的早期诊断、恶性分级和预后评估的可行性。

发明内容

本发明通过建立NSCLC患者病理和术后随访资料库，建成组织样本库和 血清样本库200余例。其中有30例已经取得术前、术后和复发后血清，每三个 月进行回访，并记录相应随访资料。在已完成10对NSCLC癌及癌旁标本的 microRNA芯片分析的基础上，本研究将筛选具有差异表达的microRNA，并基 于生物信息学分析以及RIP实验技术确定其靶基因，探明microRNA在NSCLC 侵袭和转移中的调控机制，同时，筛查NSCLC患者不同的病理阶段时，血清 中NSCLC转移特异的microRNA标志物，为NSCLC转移提供早期有效的监控 手段。

本发明将为NSCLC的侵袭和转移控制提供科学依据，获得临床上快速、 便捷的转移早期诊断和预后判断方法，提高NSCLC患者的治愈率和生存率。 研究成果对提高我省在NSCLC转移的早期诊断和靶向治疗的基础理论研究水 平及其临床应用都具有重要意义。

本发明的目的在于提供一种miRNA，即hsa-miR-1260b，其可用于在非小 细胞肺癌转移的检测。

本发明的技术方案如下：

(1)筛选NSCLC组织与对应癌旁组织差异表达的microRNA；

(2)生物信息学预测并鉴定microRNA的靶基因；

(3)考察差异microRNA对细胞生长的影响；

(4)研究差异microRNA及其对应靶基因在NSCLC肿瘤侵袭和转移 中的作用。

(5)验证NSCLC血清与非癌对照血清差异表达的microRNA，评估 其作为血清NSCLC候选标志物，用于NSCLC早期转移诊断、疗效监控的 可能性。

更进一步地，本发明的技术方案如下：

(1)巩固和完善NSCLC数据库

A 建立和整理NSCLC患者病理资料和术后随访资料数据库，收集和 整理患者的病理档案、术后治疗方案及效果、术后生存情况等数据；

B 建立和整理NSCLC组织样本库(已完成200例NSCLC组织样本 收集)；

C 建立和整理NSCLC患者及对照人群的血液样标本库。

(2)NSCLC及癌旁组织差异microRNA的筛选

A 样本收集：选取临床确诊的NSCLC患者10例，取癌及对应的癌 旁组织，共20例标本；

B 样本总RNA提取：采用总RNA提取方法提取20例标本的总RNA；

C 利用microRNA提取试剂盒分离提取总RNA中的microRNA；

D 利用哺乳动物microRNA芯片(Affymetrix)，对收集到的20例标 本的microRNA样品进行筛选实验，共做20张芯片；

E 应用芯片统计分析软件，分析癌组织和癌旁组织差异的 microRNA。

(3)扩大样本实验验证和microRNA的进一步筛选

A 利用Real-timePCR技术验证芯片实验中癌与癌旁组织差异显著的 microRNA结果，对这些microRNA进行生物信息学分析，选取8-10个与 肿瘤侵袭和转移相关的microRNA，扩大肺癌组织样本到100对进行验证；

B 根据上述NSCLC病例的病理学资料，对选取的8-10个microRNA 进行分析，考察在不同的病理分期的NSCLC患者中的表达量分布情况。

(4)RIP技术确定差异microRNA的靶基因，生物信息学查询并参照 文献报道，预测microRNA的功能，选取1-2个与NSCLC侵袭和转移相关 的microRNA进行后续研究。

(5)microRNA的lentivirus过表达载体系统/反义寡核苷酸抑制 micorRNA表达实验及NSCLC细胞试验

A 构建microRNA的Lentivirus过表达载体，其中设计有报告基因。

B 采用稳转技术将microRNA过表达载体转染入NSCLC细胞。 transwell技术监控各细胞株的表型变化；Real-timePCR技术分析microRNA 和对应靶基因的表达量情况；Western实验考察靶基因的蛋白表达变化；

C 修饰后的反义寡核苷酸使用Lipofectamine转染NSCLC细胞， transwell技术监控各细胞株的表型变化；Real-timePCR技术分析microRNA 和对应靶基因的表达量情况；Western实验考察靶基因的蛋白表达变化。

(6)动物模型实验

A Lentivirus过表达的microRNA载体转染后的NSCLC细胞皮下接 种裸小鼠；

B 观察接种细胞后的小鼠体内细胞成瘤情况及肿瘤转移情况。

(7)microRNA的血清检验，评估差异microRNA作为NSCLC转移 早期血清标志物的可能性

A 收集病人相应术前、术后和复发后外周血样本；

B 一小时内分离出血清；

C Real-timePCR技术检测血清中游离microRNA的表达量；

D 对血清microRNA变化情况与相应病理随访资料进行关联分析， 考察患者在不同的病理阶段，血清内相应的microRNA的表达量变化情况。 确认候选microRNA作为NSCLC转移早期血清标志物的可能性，及应用 于临床NSCLC监控的实用性。

本发明的有益之处在于：

1.microRNA可以作为一种有效的肿瘤标志物用于癌症的早期诊断、恶性分 级、个性化诊疗和预后判断等，甚至可以作为肿瘤治疗的靶点，指导临 床用药。

2.hsa-miR-1260b在非小细胞肺癌转移和非转移中具有显著性差异，可以有 效进行检测，具有较好的应用前景和推广价值。

3.虽然肿瘤组织microRNA表达谱与肿瘤发病及预后相关，但是检测技术 复杂、创伤大，难以真正用于临床诊断，而外周血血清较易获得和检测， 临床应用便捷，利于推广，并且microRNA在血清中能够长期稳定存在， 不易被RNA酶降解，煮沸、反复冻融、酸碱环境、长期保存等极端条 件均不会造成血清microRNA的损失。

附图说明

图1为NSCLC患者RNA质量检测电泳图。

图2为microRNA芯片扫描图。

图3为不同病理分期远端正常组织之间的差异表达microRNA。

A：Ia期和IIa期的比较；B：IIa期和IIIa期的比较；C：Ia期和IIIa期的 比较。

图4为不同病理分期癌旁组织之间的差异表达microRNA。

A：Ia期和IIa期的比较；B：IIa期和IIIa期的比较；C：Ia期和IIIa期的 比较

图5为不同病理分期癌组织之间的差异表达microRNA。

A：Ia期和IIa期的比较；B：IIa期和IIIa期的比较；C：Ia期和IIIa期的 比较。

图6为远端正常组织，癌旁组织和癌组织之间的差异表达microRNA。

A：远端正常组织和癌旁组织的比较；B：癌旁组织和癌组织的比较；C： 远端正常组织和癌组织的比较。

图7为远端正常组织，癌旁组织和癌组织之间的差异表达microRNA的聚 类分析。

图8为淋巴结转移组和非淋巴结转移组之间的差异表达microRNA的火山 图。

图9为淋巴结转移组和非淋巴结转移组之间的差异表达microRNA的聚类 分析图。

图10为miRNA1260b在淋巴结转移和淋巴结未转移敏感性和特异性方面的 比较。

具体实施方式

实施例1：

完善NSCLC组织样本和血浆标本库，收集和整理病人病理资料和术 后随访资料；

(1)建立了120例NSCLC患者的临床病理资料和部分患者的术后随访资 料数据库；

(2)建立了120例NSCLC患者的组织样本库；

(3)建立了NSCLC患者及部分复发患者的外周血浆样本库30例。

实施例2：

NSCLC组织样本的microRNA芯片实验

(1)microRNA芯片实验用样本的筛选

为保证芯片筛选用样本的组织病理资料的均一性，从已经建立的NSCLC 组织样本库中选择满足以下入选标准的病例9例：男性；50岁-70岁；腺癌； 每例病例均包括远端正常组织，癌旁组织和癌组织。其中临床分期分别为Ia期 3例(样本编号分别是511587，541056，492827)，IIa期3例(样本编号分别 是435942，575901，473871)和IIIa期3例(样本编号分别是399409，399514， 509185)。每例病例分别取其远端正常组织，癌旁组织和癌组织进行microRNA 芯片检测，分别标记为N，P，C。同时，该9例病例包括4例非淋巴结转移标 本(样本编号435942，492827，511587，541056)和5例淋巴结转移标本(样 本编号399409，473871，509185，399514，575901)。

(2)样本total RNA抽提

采用mirVana^TMmiRNA Isolation Kit(Cat#AM1560,Ambion,Austin,TX, US)，根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的total RNA抽提，抽提所得 total RNA经Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US) 电泳质检，其中A260/A280>1.8,RIN值>5.0，28S/18S>＝0.7的RNA样本方可 进入下一轮实验。经检测，本研究所需的27例RNA样本均满足后续实验要求。

结果如附图1所示。

实施例3：

芯片实验

项目所用芯片为Agilent human miRNA(8*60K)V16.0芯片(design ID： 31181)，共有27个标本，需要完成27张上述芯片，委托生物芯片上海国家工 程研究中心完成。具体步骤包括：

1)样品RNA的标记

实验样品RNA采用Agilent miRNA芯片配套的试剂盒，miRNA Complete  Labeling and Hyb Kit(Cat#5190-0456,Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)， 按照标准操作流程的标记部分对样品中的miRNA分子进行荧光标记。

2)芯片杂交

按照Agilent miRNA芯片配套提供的标准操作流程和配套试剂盒，miRNA  Complete Labeling and Hyb Kit(Cat#5190-0456,Agilent technologies,Santa Clara, CA,US)的杂交部分，进行样品的杂交实验。在滚动杂交炉中，Hybridization  Oven(Cat#G2545A,Agilenttechnologies,Santa Clara,CA,US)，55℃，20rpm，滚 动杂交20小时。杂交完成后在洗缸staining dishes(Cat#121,Thermo Shandon, Waltham,MA,US)中洗片，洗片所用的试剂为Gene ExpressionWash Buffer Kit (Cat#5188-5327,Agilenttechnologies,Santa Clara,CA,US)。

3)结果扫描

芯片结果采用Agilent Microarray Scanner(Cat#G2565BA，Agilent  technologies,Santa Clara,CA,US)进行扫描，用Feature Extraction software 10.7 (Agilenttechnologies,Santa Clara,CA,US)读取数据，软件设置Scan resolution＝5 μm,PMT 100％,5％最后采用Gene Spring Software 11.0(Agilent technologies, Santa Clara,CA,US)进行归一化处理，所用的算法为Quantile。

结果如附图2所示。

实施例4：

芯片实验质控情况

所有27张芯片的技术重复的变异系数(CV值)均<10，说明该芯片检测体系 稳定；各芯片检出率范围为20％-40％，符合正常检出率要求；各芯片杂交数据 的箱线图分析说明分布和分散程度较好。以上各质控标准说明芯片结果稳定性 好，灵敏度高，结果可靠。

实施例5：

1)不同病理分期远端正常组织之间的差异表达microRNA

比较IaN，IIaN，IIIaN 3组之间的差异表达microRNA，发现IaN和IIaN 之间未发现差异表达microRNA；IaN+IIaN组和IIIaN组之间有11个差异表达 的microRNA，包括hsa-miR-205，hsa-miR-34b，hsa-miR-34b*，hsa-miR-34c-3p， hsa-miR-376a，hsa-miR-429，hsa-miR-449a，hsa-miR-449b，hsa-miR-495， hsa-miR-500a，hsa-miR-650。初步研究说明Ia和IIa期病人的远端正常组织未 出现显著的microRNA变化，但是IIIa期病人的远端正常组织已经开始出现 microRNA表达量的改变。

结果如附图3所示。

2)不同病理分期癌旁组织之间的差异表达microRNA

比较IaP，IIaP，IIIaP 3组之间的差异表达microRNA，发现IIaP和IIIaP之 间有3个microRNA差异表达；但是IaP和IIaP之间有9个microRNA差异表 达，与IIIaP之间有23个microRNA差异表达；初步研究说明与Ia期病人相比， IIa期和IIIa病人的癌旁组织已经开始出现microRNA表达量的改变。

结果如附图4所示。

3)不同病理分期癌组织之间的差异表达microRNA

IaC，IIaC，IIIaC 3组之间的差异表达microRNA并不比远端正常组织和癌 旁组织组间差异表达的microRNA多，其中IIaC和IIIaC之间仅hsv2-miR-H7-3p 表达有差异；hsa-miR-23a*在IIaC和IIIaC中的表达量远高于IaC。

结果如附图5所示。

4)远端正常组织，癌旁组织和癌组织之间的差异表达microRNA

远端正常组织和癌旁组织之间几乎没有出现microRNA表达量的改变，仅 发现hsa-miR-338-5p在癌旁组织的表达量显著低于远端正常组织；但是癌旁组 织和癌组织之间有36个microRNA的表达量发生了显著变化；远端正常组织和 癌组织之间的差异表达的microRNA有55个，说明癌组织与远端正常组织相比 microRNA的表达量发生了广泛的变化。以上述筛选出的55个microRNA为对 象，对27个样本进行聚类分析，结果显示根据该差异表达的microRNA表达谱 可以将27个样本很好地分为癌组织和非癌组织两大类。

结果如附图6和附图7所示。

5)淋巴结转移组和非淋巴结转移组之间的差异表达microRNA

发现在淋巴结转移组中表达量发生显著变化的microRNA3个，包括 hsa-miR-1260b，hsa-miR-423-3p，hsa-miR-23a-5p。

其中hsa-miR-1260b的序列为：5’-AUCCCACCACUGCCACCAU-3’

以上述筛选出的3个microRNA为对象，对9个癌组织样本进行聚类分析， 结果显示根据该差异表达的microRNA表达谱可以将9个样本很好地分为淋巴 结转移组和非淋巴结转移组两大类。

图8为淋巴结转移组和非淋巴结转移组之间的差异表达microRNA的火山 图。

图9为淋巴结转移组和非淋巴结转移组之间的差异表达microRNA的聚类 分析。

实施例6：

扩大肿瘤样本验证microRNA芯片实验结果

(1)RNA抽提及质量控制

选择78例NSCLC患者组织标本对hsa-miR-145，hsa-miR-182和 hsa-miR-213进行microRNA芯片的验证工作，RNA抽提及质量控制方法同上。

(2)反转录和Real-PCR

使用ReverAid First cDNA strand kit(Fermentas)进行反转录。取1ug total  RNA，加入1ul random hexamer primer，补水到12ul，在65℃水浴5min后，立 即放于冰上。加入4ul 5*reaction buffer，RiboLock Rnase inhibitor 1ul，10mM  dNTPMix 2ul，ReverAid M-MuLVReverse Transcriptase 1ul。25℃5min后，42℃ 60min，70℃5min后结束反应，反转录反应在ABI 9700PCR仪上进行。产物放 于-20℃短期保存或-70℃长期保存。使用时，将cDNA产物稀释20倍。microRNA 引物由ABI公司合成。系统反应体系：2ul cDNA，10ul Premix Ex  TaqTM II(2×)，0.4ul 10uM上下游引物，0.4ulROX II,加水至20ul。在ABI 7900 荧光定量PCR仪上进行扩增反应，95℃10sec后40个循环的95℃5s,60℃ 34sec。

(3)实验结果

分别定量分析3个microRNA在78例NSCLC患者的远端正常组织、癌旁 组织和癌组织中的表达量；研究发现hsa-miR-21在66例远端正常组织和癌旁 组织中的表达量显著低于癌组织中的表达量，hsa-miR-145在75例远端正常组 织和癌旁组织中的表达量显著高于癌组织中的表达量，该研究结果与芯片结果 基本相符，因此我们计划选择这2个microRNA进行后续研究。

实施例7：

miR-1260b在淋巴结转移组和非转移组之间的差异表达如表1所示。

表1

19例淋巴结转移的非小细胞肺癌组织及其癌旁组织，32例淋巴结未转移的 非小细胞肺癌组织及其癌旁组织。淋巴结转移组的miR-1260b表达变化倍数显 著高于淋巴结未转移组。

miRNA-1260b在淋巴结转移和淋巴结未转移敏感性和特异性方面的比较 (19例淋巴结转移32例淋巴结未转移)，AUC＝0.72，最佳临界点时的敏感度为 63.2％，特异性为81.2％，如图10所示。

因此，可以通过检测组织miR-1260b的量来诊断非小细胞癌的淋巴转移。

实施例8：

对血清miR-1260b变化情况与相应病理随访资料进行关联分析，考察患者 在不同的病理阶段，血清内相应的miR-1260b的表达量变化情况，预测 miR-1260b可以作为NSCLC转移早期血清标志物。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局 限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本 发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护 范围之内。