雌二醇适配体片段及其在雌二醇检测中的应用

摘要

本发明公开了雌二醇适配体片段及其在雌二醇检测中的应用。本发明提供了一种适配体组合物，由适配体片段1和适配体片段2组成；所述适配体片段1的核苷酸序列为序列表中序列1；所述适配体片段2的核苷酸序列为序列表中序列2。本发明的实验证明，本发明将雌二醇配长适配体断裂为2个片段P1和P2，将二者组合使用依然具有和雌二醇特异结合能力，且建立了基于P1和P2的雌二醇比色检测方法，而且相比利用原始的长适配体，利用片段化后的P1和P2检测雌二醇，灵敏度提高10倍。

说明书

技术领域

本发明涉及检测技术领域，尤其涉及雌二醇适配体片段及其在雌二醇检测中的应 用。

背景技术

雌二醇作为一种天然雌激素，也是一种很重要的内分泌干扰物存在于环境污水中， 能够通过食物链进入动物和人体，引发各种生理异常，比如诱发雄性生殖系统畸形生 长和功能异常，除此之外还可以诱发肿瘤等。因此研究建立环境污水中雌二醇的检测 方法对于保护环境和保障人民健康具有重要的意义。

传统的雌二醇检测方法主要是仪器分析法，借助HPLC或GC/MS等分析仪器，可以 准确灵敏的检出样品中的雌二醇，但是该方法分析时间长，操作复杂，需要大型精密 仪器，不宜广泛推广。目前雌二醇的快速检测方法主要包括化学或生物传感器法，其 中包括基于受体的雌激素类物质检测方法，该方法可以检测所有具有雌激素活性的物 质，灵敏度较高，但无法区分哪一种雌激素。基于抗体的ELISA法虽然具有较好的灵 敏度和特异性，但操作过程中需要多个洗涤步骤，操作繁琐；基于抗体的胶体金免疫 层析试纸操作简单方便，但该方法对抗体要求高，且抗体用量大，由于高亲和力雌激 素抗体较贵，导致检测成本高；而且由于抗体需要低温保存，对保存和运输条件要求 较高。因此急需开发更为简单方便成本低廉的雌二醇快速检测方法。

核酸适配体作为一种新型识别分子，是通过SELEX技术从10¹⁴-10¹⁸文库中筛选出 来的，具有极高的亲和力和特异性，与抗体相比，具有易于合成制备，性能稳定，便 于修饰等优点，已被用于多种物质的检测。雌二醇的适配体为一段76核苷酸的单链 DNA，可以与雌二醇高特异性高亲和力结合。目前已经利用适配体可以保护纳米金免于 高盐浓度引起的团聚原理，开发了基于适配体纳米金比色法的雌二醇检测方法(牛书 操等，2014年，分析测试学报)，但是该方法灵敏度较低。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种适配体组合物。

本发明提供的适配体组合物，由适配体片段1和适配体片段2组成；

所述适配体片段1的核苷酸序列为序列表中序列1；

所述适配体片段2的核苷酸序列为序列表中序列2。

上述的适配体组合物中，所述适配体片段1和所述适配体片段2的摩尔比为1：1。

上述的适配体组合物在检测雌二醇中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述检测雌二醇采用纳米金比色法。

上述应用中，所述纳米金比色法中适配体组合物的反应终浓度为0.1-1μM；

上述应用中，所述纳米金比色法中纳米金的粒径范围为5-40nm；

所述纳米金比色法中纳米金、适配体组合物和NaCl的浓度比为 2-8nM:0.1-1μM:0.1-0.5M。

本发明的实验证明，本发明将雌二醇配长适配体断裂为2个片段P1和P2，将二 者组合使用依然具有和雌二醇特异结合能力，且建立了基于P1和P2的雌二醇比色检 测方法，而且相比利用原始的长适配体，利用片段化后的P1和P2检测雌二醇，灵敏 度提高10倍。

附图说明

图1为雌二醇适配体结构及生成P1和P2的剪切位点

图2为利用P1和P2检测雌二醇原理示意图

图3为纳米金所需适配体量摸索

图4为片段化适配体与原长适配体检测雌二醇灵敏度结果

图5为单一片段化适配体与雌二醇结合能力研究

图6为片段化适配体检测特异性研究

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

纳米金溶液中纳米金颗粒直径可以为5-40nm，本发明实施例中采用纳米金颗粒 直径为13nm的纳米金溶液，具体制备方法如下：加热煮沸100mL浓度为1mM的HAuCl₄溶液，剧烈搅拌下加入10mL浓度为38.8mM的柠檬酸三钠溶液，继续煮沸20分钟， 然后室温冷却，得到纳米金溶液，其浓度为14nM。

下述实施例中原长适配体17β-estradiol aptamer及片段化的P1+P2均有上海 生工公司合成制备。

实施例1、检测雌二醇适配体的获得

通过分析适配体纳米金比色法的原理，认为适配体越长，其形成二级结构的可能 性就越大，适配体折叠形成双链，使得磷酸骨架暴露在外，与带负电荷的纳米金发生 排斥，从而不易与纳米金结合。反之适配体越短，其链的自由度越大，单链碱基暴露 在外的机会越多，因此通过碱基氮原子与纳米金的配位作用，使短的单链DNA比长链 更容易吸附到纳米金表面上。同时长链适配体一旦结合到纳米金上，因为其与纳米金 结合碱基数目比较多，所以与纳米金的亲和力要比短链的更强。

基于上述分析，根据雌二醇适配体17β-estradiol aptamer(序列1)的预测构 象，选择颈环位置将雌二醇适配体断裂成两段(图1)，分别为33碱基的P1和43个 碱基P2，原长适配体与片段化适配体序列见表1。

表1为雌二醇原长及片段化适配体序列

图2为利用P1和P2检测雌二醇原理示意图；首先将原始的76碱基长的适配体 断裂成33和43个片段，然后加入到纳米金中，这两个片段可以吸附到纳米金上，保 护纳米金溶液在高盐浓度下不会团聚变蓝；当加入雌二醇时，P1和P2会和雌二醇结 合，从而不能结合纳米金，这个时候加入盐溶液，会使纳米金发生团聚，溶液颜色由 红变蓝，且雌二醇浓度欲高，颜色越蓝，从而达到检测雌二醇的目的。

实施例2、适配体在检测雌二醇中的应用

1、适配体在纳米金检测中用量比较

适配体组合物：将片段化适配体P1和片段化适配体P2按照摩尔比为1:1混合， 得到适配体组合物。

向50μL纳米金溶液中加入50μL不同浓度的原长适配体或片段化适配体组合物 P1+P2(摩尔比为1:1)，然后加入50μL的纯水，反应5分钟，加入10μL的2M NaCl 水溶液(终浓度为125mM)，5分钟观察颜色。

其中纳米金、适配体和NaCl的浓度比可以为2-8nM:0.1-1uM:0.1-0.5M，在本实 验中的浓度比为4.375nM:0.3125μM:0.125M。

结果如图3所示，A为不同浓度适配体下纳米金颜色，B为对应的吸收光谱图； 加入浓度1μM的P1+P2即可以保护纳米金溶液维持红色(OD₅₂₀无显著变化)，而对于 原长76mer的适配体，则需要加入浓度为1.5μM才可以保护。

2、片段化适配体与原长适配体检测雌二醇灵敏度比较

分别用片段化适配体组合物P1+P2和原长适配体，吸附到纳米金表面上，建立雌 二醇比色检测方法，如下：

将1μM片段化适配体组合物P1+P2或1.5μM的76mer的原长适配体均取50μL加 入到50μL含不同浓度雌二醇溶液中，反应5分钟，然后加入50μL纳米金溶液再反应 5分钟，然后加入10μL的2MNaCl水溶液(终浓度为125mM)，5分钟后测定520nm(检 测红色)和620nm(检测蓝色)处的吸光度值。

其中纳米金、适配体和NaCl的浓度比可以为2-8nM:0.1-1uM:0.1-0.5M，在本实 验中的浓度比为4.375nM:0.3125uM:0.125M。

对于本实验雌二醇浓度计算公式为：

对于P1+P2公式为：雌二醇浓度＝[(OD₆₂₀/OD₅₂₀-0.7609)/0.1672]¹⁰；

对于原长适配体公式为：雌二醇浓度＝[(OD₆₂₀/OD₅₂₀-0.3632)/0.1975]¹⁰。

若溶液OD₆₂₀/OD₅₂₀大于不含有雌二醇水OD₆₂₀/OD₅₂₀，则溶液中含有雌二醇，相 差越大，含有的雌二醇越多。

结果如图4所示，A和B图分别用原始长适配体测定雌二醇的纳米金溶液吸光度 变化及以雌二醇浓度对数为横坐标吸光度为纵坐标的标准曲线；C图和D图则分别为 用片段化的P1+P2测定雌二醇的纳米金溶液吸光度变化及以雌二醇浓度对数为横坐标 吸光度为纵坐标的标准曲线；其中A和C中450nm处的曲线从上到下对应的雌二醇浓 分别为0、1、10、100、1000、10000、100000ng/ml；可以看出，利用P1+P2检测灵 敏度可以低至0.1ng/ml(溶液OD₆₂₀/OD₅₂₀大于不含有雌二醇水OD₆₂₀/OD₅₂₀，对应浓 度对数为-1)，而利用原长适配体，灵敏度仅为1ng/ml(溶液OD₆₂₀/OD₅₂₀大于不含有 雌二醇水OD₆₂₀/OD₅₂₀)。说明利用片段化的适配体比原长适配体灵敏度提高了10倍。

3、单一片段化适配体与雌二醇结合能力研究。

分别用P1和P2与雌二醇反应，然后加入纳米金和NaCl，检测二者是否还保持着 和雌二醇的结合能力具体方法如下：

将1μM的P1或P2适配体50μL加入到50μL含不同浓度雌二醇溶液中，反应5 分钟，然后加入50μL纳米金溶液再反应5分钟，然后加入10μL的2MNaCl水溶液(终 浓度为125mM)。结果与P1和P2适配体共同加入相比较。

其中纳米金、适配体和NaCl的浓度比可以为2-8nM:0.1-1uM:0.1-0.5M，在本实 验中的浓度比为4.375nM:0.3125uM:0.125M。

结果如图5所示，P1和P2单独使用，也都能用来检测雌二醇，证明二者单独都 具有结合雌二醇的能力。从图上既可以看出单独的P1和P2在10000ng/ml(对应横坐 标对数为4)的时候OD₆₂₀/OD₅₂₀才有明显增高，而P1+P2则从0.1-100000ng/ml(对 应横坐标-1到5)OD₆₂₀/OD₅₂₀即一直增高，也即单独使用P1或P2检测的灵敏度不如 二者共同使用。

4、检测方法特异性研究

分别用几种雌激素类似物及溶剂检测了基于片段化适配体纳米金比色法的特异 性，具体方法如下：

将1μM的P1+P2适配体组合物50μL加入到50μL含1000ng/ml不同雌二醇类似 物溶液中，反应5分钟，然后加入50μL纳米金溶液再反应5分钟，然后加入10μL的 2M的NaCl(终浓度为125mM)。

其中纳米金、适配体和NaCl的浓度比可以为2-8nM:0.1-1uM:0.1-0.5M，在本实 验中的浓度比为4.375nM:0.3125uM:0.125M。

结果如图6所示，除了与雌二醇同样具有环戊烷多氢菲结构的雌三醇、雌酮和去 甲睾酮有很小的交叉反应外，其他物质都几乎没有交叉反应，说明本发明方法具有很 好的特异性。

从上述可以看出，可以用P1+P2适配体组合物采用纳米金比色法判断待测溶液 是否有雌二醇，将适配体组合物P1+P2、待测溶液和纳米金溶液反应至红色(5分钟)， 然后再加入NaCl水溶液，得到反应产物，用如下1)或2)方法判断：

1)若反应产物为蓝色，则溶液中含有或候选含有雌二醇；若反应产物不为蓝色， 则溶液中不含有或候选不含有雌二醇；

2)若反应产物OD₆₂₀/OD₅₂₀大于或显著大于阴性对照OD₆₂₀/OD₅₂₀，则溶液中含有 或候选含有雌二醇；若反应产物OD₆₂₀/OD₅₂₀不大于阴性对照OD₆₂₀/OD₅₂₀，则溶液中 不含有或候选不含有雌二醇。